一種抗肥胖七肽NPVWKRK的制作方法

本發明屬于生物制藥領域，具體涉及一種合成多肽及其應用。

背景技術：

生物活性肽是對機體的功能或狀態具有積極作用并最終影響機體健康的特殊蛋白質片段。相較于蛋白質而言，小分子肽片段的優越性主要體現在：更易被人體吸收利用；活性高，在較小濃度下即可發揮其特有的生理作用；分子量小，易于修飾和改造，能夠通過人工化學合成等。而相較于單一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸無可比擬的優越性。已有研究證實，人體小腸存在專門的低聚肽吸收通道，人體攝入的蛋白質經過多種消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸收。許多研究表明，各種來源的生物活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降壓、降血糖等多種作用，成為生物醫藥和保健品開發的熱點。肥胖增加動脈粥樣硬化，冠心病，高血壓，糖尿病，痛風，脂肪肝等疾病的發病危險。因此，對具有減肥降脂作用而安全無害的生物活性肽的開發研究，變得尤為重要。目前，具有減肥降脂作用的多肽包括利拉魯肽，鱸魚活性肽，蠶蛹肽等。

技術實現要素：

本發明選取小鼠前脂肪細胞3T3-L1為研究對象，使用MTT法測定合成肽的體外抑制活性。本發明的目的是提供一種具有體外抗肥胖活性的合成多肽，可應用于生物制藥領域。

本發明合成的抗肥胖七肽縮寫為NPVWKRK，分子量927.12，序列為：Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys。其中，

Asn表示英文名稱為Asparagine，中文名稱為天冬酰胺酸的氨基酸的相應殘基;

Pro表示英文名稱為Proline，中文名稱為脯氨酸的氨基酸的相應殘基；

Val表示英文名稱為Valine，中文名稱為纈氨酸的氨基酸的相應殘基;

Trp表示英文名稱為Tryptophan ，中文名稱為色氨酸的氨基酸的相應殘基;

Lys表示英文名稱為Lysine，中文名稱為賴氨酸的氨基酸的相應殘基;

Arg表示英文名稱為Arginine，中文名稱為精氨酸的氨基酸的相應殘基;

Lys表示英文名稱為Lysine，中文名稱為賴氨酸的氨基酸的相應殘基。

本發明所述的氨基酸序列采用標準 Fmoc 方案，通過樹脂的篩選，合理的多肽合成方法。將目標多肽的 C-端羧基以共價鍵形式與一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以這個氨基酸的氨基作為起點，與另一分子氨基酸的羧基作用形成肽鍵。不斷重復這一過程，即可以得到目標多肽產物。合成反應完成后，去除保護基，將肽鏈與樹脂分離，即得到目標產物。多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，固相合成順序從C端向N 端合成。

本發明將終濃度為0.125-2 mg/mL 的合成多肽與3T3-L1混勻，孵育48 h后，經MTT法檢測，對脂肪細胞抑制率達到14.59%-45.38%,可在制備生物醫藥領域中應用。

所述七肽NPVWKRK在濃度為2 mg/mL 時，對3T3-L1的體外增殖抑制率為45.38%。

與現有技術相比，本發明具有如下優點和技術效果：

本發明首次合成了該肽，并且采用MTT方法檢測了合成多肽的體外脂肪細胞增殖抑制活性，所述合成多肽具有一定的脂肪細胞抑制能力。

附圖說明

圖1a為合成多肽Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys 的HPLC圖。

圖1b為合成多肽Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys 的MS圖。

圖2為合成多肽Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys對脂肪細胞3T3-L1的抑制活性柱狀圖。

具體實施方式

以下結合具體實例對本發明作進一步說明，但本發明的實施和保護范圍不限于此。

多肽固相合成

選用高分子樹脂（中肽生化有限公司），按照氨基酸序列Asn-Pro-Val-Trp-Lys-Arg-Lys的特征，先將Lys的羧基以共價鍵的形式與一個樹脂相連，然后Lys的氨基和Arg 的羧基縮水反應，處理后，再添加Lys，Arg的氨基和Lys的羧基反應，依次從右到左添加氨基酸，加好最后一個Asn氨基酸后，再切除樹脂即得到目標多肽。采用高效液相色譜進行純化，色譜柱型號為Phenomenex C₁₈，尺寸 4.6*150mm，流動相A:含有0.1%三氟乙酸（TFA）的水；流動相B:含有0.09%TFA 的溶液 (80%乙腈+20%水)；20 min內B相由14.0%上升到24.0%，流速1.0 mL/min，檢測波長220nm。液氮速凍，冷凍干燥，得到最后的產品，要求純度達到98.95%以上，并經MS 鑒定結構（如圖1 所示）。

合成多肽的體外抑制活性

通過 MTT 比色法分析肽組分對3T3-L1的生長抑制作用。具體操作步驟如下：

1）取對數生長期的細胞，經0.25%（體積）的胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，加入相應的完全培養基終止消化并重懸細胞，血球平板計數后，調整細胞懸液的濃度至5×10⁴個/mL，加至96孔板中，每孔100 μL, 于37 ℃恒溫CO2培養箱中培養；

2）培養24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為200 μL的含有不同濃度待測樣品的新鮮完全培養基，并以完全培養基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養；

3）48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養箱中繼續培養；

4）4 h后，棄去含有MTT的培養液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率:

脂肪細胞生長抑制率(%)=((對照組OD-空白組OD)-(給藥組OD-空白組OD ))/((對照組OD-空白組OD ) )×100。

應用實施例1

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養，24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為100 μL的125 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養基，并以完全培養基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養，48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養基180 μL；于37 ℃恒溫CO2培養箱中繼續培養；4 h后，棄去含有MTT的培養液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，125 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是14.59%。

應用實施例2

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養， 24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為100 μL的250 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養基，并以完全培養基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養，48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養箱中繼續培養；4 h后，棄去含有MTT的培養液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，250 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是24.93%。

應用實施例3

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養， 24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為100 μL的500 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養基，并以完全培養基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養，48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮基完全培養基180 μL；于37 ℃恒溫CO2培養箱中繼續培養；4 h后，棄去含有MTT的培養液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，500 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是31.73%。

應用實施例4

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養， 24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為100 μL的1000 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養基，并以完全培養基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養，48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養箱中繼續培養；4 h后，棄去含有MTT的培養液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，1000 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是33.57%。

應用實施例5

脂肪細胞3T3-L1 100 μL 細胞懸液(5×10⁴個/mL),加至96孔板中，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養，24 h后細胞貼壁，吸出廢舊培養液，加入終體積為100 μL的2000 μg/mL的多肽樣品的新鮮完全培養基，并以完全培養基為陰性對照，于37 ℃恒溫CO₂培養箱中培養， 48 h后吸出藥液，用PBS洗板2次，加入5 mg /mL的MTT溶液20 μl和新鮮完全培養基180 μL；于37 ℃恒溫CO₂培養箱中繼續培養；4 h后，棄去含有MTT的培養液，加入150 μl DMSO后于微型振蕩器上振蕩15 min， 490nm 波長處測定光密度值并計算抑制率。由圖2可知，2000 μg/mL的多肽對脂肪細胞3T3-L1的抑制率是45.38%。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學

<120> 一種抗肥胖七肽NPVWKRK

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asn Pro Val Trp Lys Arg Lys

1 5