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從人胎盤羊膜制備羊膜間充質干細胞的方法及其應用與流程

文檔序號:12411382閱讀:來源:國知局

技術特征:

1.從胎盤羊膜制備人羊膜間充質干細胞的方法,該方法包括以下步驟:

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤,置于白瓷盤中,使用基礎平衡鹽溶液反復沖洗表面,對胎盤進行消毒處理;

(2)用手術鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中,使用基礎平衡鹽溶液反復清洗表面污血,剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊;用300目濾網過濾,生理鹽水沖洗殘血,組織塊轉移至50ml離心管;

(3)組織消化:在37℃恒溫搖床中,將組織塊用1倍組織體積的混合酶消化液以100rpm振蕩消化30~60min;消化結束后,加2ml胎牛血清混勻終止;用200目濾網過濾并用大量生理鹽水清洗,收集濾液;

(4)分別對濾液部分和組織塊部分進行細胞培養:

濾液部分:收集的濾液以1500rpm離心5min,去上清,用生理鹽水重懸清洗細胞沉淀;以1500rpm離心5min,去上清,將細胞沉淀用完全培養基重懸;計數儀計取有核細胞數并用臺盼蘭染色測定細胞活率;以每瓶2×106個細胞接種于75cm2培養瓶中,添加20ml完全培養基,晃勻后在5%CO2、37℃培養箱中培養;定期換液;培養10~15天(通常可以是12天左右)后傳代至P1代,繼續用完全培養基培養;

組織塊部分:將收集的組織塊置于75cm2培養瓶中,使組織塊能夠覆蓋培養瓶中一半的培養面積,添加完全培養基沒過組織,晃勻后于5%CO2、37℃培養箱中培養;2d后補液10ml完全培養基,繼續培養;較多間充質干細胞爬出后去組織,定期換液;培養10~15天(通常可以是12天左右)后傳代至P1代,繼續用完全培養基培養;

(5)P1代細胞收獲:用胰酶消化液將上一步驟中的兩部分合并后的P1代細胞消化后,收集細胞,計數并測定細胞活率,凍存,即得P1代的羊膜間充質干細胞,必要時對其進行傳代培養。

2.根據權利要求1的方法,其中:

所述基礎平衡鹽溶液中包括鏈霉素和青霉素兩種抗生素;

所述基礎平衡鹽溶液是通過如下方式配制得到的:將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液;和/或

所述混合酶消化液中包含:0.1mg/ml的I型膠原酶,0.3mg/ml的II型膠原酶,0.1mg/ml的透明質酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶。

3.根據權利要求1的方法,其中:

所述完全培養基包括:DMEM-F12培養基、FBS、青霉素、鏈霉素;

所述DMEM-F12培養基是DMEM-F12以體積比1:1配制的培養基;和/或

所述完全培養基包括:DMEM-F12(1:1)培養基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素;例如,所述的完全培養基中還添加了0.01~0.05%硝酸硫胺和0.05~0.1%麥芽糖。

4.根據權利要求1的方法,其中:

步驟(4)中,通常是培養10~15天(通常可以是12天左右)后傳代至P1代;和/或

步驟(5)中,胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液。

5.一種人羊膜間充質干細胞,其是通過包括如下步驟的方法制備得到的:

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤,置于白瓷盤中,使用基礎平衡鹽溶液反復沖洗表面,對胎盤進行消毒處理;

(2)用手術鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中,使用基礎平衡鹽溶液反復清洗表面污血,剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊;用300目濾網過濾,生理鹽水沖洗殘血,組織塊轉移至50ml離心管;

(3)組織消化:在37℃恒溫搖床中,將組織塊用1倍組織體積的混合酶消化液以100rpm振蕩消化30~60min;消化結束后,加2ml胎牛血清混勻終止;用200目濾網過濾并用大量生理鹽水清洗,收集濾液;

(4)分別對濾液部分和組織塊部分進行細胞培養:

濾液部分:收集的濾液以1500rpm離心5min,去上清,用生理鹽水重懸清洗細胞沉淀;以1500rpm離心5min,去上清,將細胞沉淀用完全培養基重懸;計數儀計取有核細胞數并用臺盼蘭染色測定細胞活率;以每瓶2×106個細胞接種于75cm2培養瓶中,添加20ml完全培養基,晃勻后在5%CO2、37℃培養箱中培養;定期換液;培養10~15天(通常可以是12天左右)后傳代至P1代,繼續用完全培養基培養;

組織塊部分:將收集的組織塊置于75cm2培養瓶中,使組織塊能夠覆蓋培養瓶中一半的培養面積,添加完全培養基沒過組織,晃勻后于5%CO2、37℃培養箱中培養;2d后補液10ml完全培養基,繼續培養;較多間充質干細胞爬出后去組織,定期換液;培養10~15天(通常可以是12天左右)后傳代至P1代,繼續用完全培養基培養;

(5)P1代細胞收獲:用胰酶消化液將上一步驟中的兩部分合并后的P1代細胞消化后,收集細胞,計數并測定細胞活率,凍存,即得P1代的羊膜間充質干細胞,必要時對其進行傳代培養。

6.根據權利要求5的人羊膜間充質干細胞,其中:

所述基礎平衡鹽溶液中包括鏈霉素和青霉素兩種抗生素;

所述基礎平衡鹽溶液是通過如下方式配制得到的:將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液;

所述混合酶消化液中包含:0.1mg/ml的I型膠原酶,0.3mg/ml的II型膠原酶,0.1mg/ml的透明質酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶;

所述完全培養基包括:DMEM-F12培養基、FBS、青霉素、鏈霉素;

所述DMEM-F12培養基是DMEM-F12以體積比1:1配制的培養基;和/或

所述完全培養基包括:DMEM-F12(1:1)培養基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素。

7.根據權利要求5的人羊膜間充質干細胞,其中:

步驟(4)中,通常是培養10~15天(通常可以是12天左右)后傳代至P1代;

步驟(5)中,胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液。

8.人羊膜間充質干細胞在制備作為細胞治療劑的藥物中的用途,所述人羊膜間充質干細胞是通過包括如下步驟的方法制備得到的:

(1)從胎盤樣品采集盒中取出胎盤,置于白瓷盤中,使用基礎平衡鹽溶液反復沖洗表面,對胎盤進行消毒處理;

(2)用手術鑷慢慢撕取胎膜外層羊膜置于150mm玻璃皿中,使用基礎平衡鹽溶液反復清洗表面污血,剪碎成直徑為5mm的羊膜組織小塊;用300目濾網過濾,生理鹽水沖洗殘血,組織塊轉移至50ml離心管;

(3)組織消化:在37℃恒溫搖床中,將組織塊用1倍組織體積的混合酶消化液以100rpm振蕩消化30~60min;消化結束后,加2ml胎牛血清混勻終止;用200目濾網過濾并用大量生理鹽水清洗,收集濾液;

(4)分別對濾液部分和組織塊部分進行細胞培養:

濾液部分:收集的濾液以1500rpm離心5min,去上清,用生理鹽水重懸清洗細胞沉淀;以1500rpm離心5min,去上清,將細胞沉淀用完全培養基重懸;計數儀計取有核細胞數并用臺盼蘭染色測定細胞活率;以每瓶2×106個細胞接種于75cm2培養瓶中,添加20ml完全培養基,晃勻后在5%CO2、37℃培養箱中培養;定期換液;培養10~15天(通常可以是12天左右)后傳代至P1代,繼續用完全培養基培養;

組織塊部分:將收集的組織塊置于75cm2培養瓶中,使組織塊能夠覆蓋培養瓶中一半的培養面積,添加完全培養基沒過組織,晃勻后于5%CO2、37℃培養箱中培養;2d后補液10ml完全培養基,繼續培養;較多間充質干細胞爬出后去組織,定期換液;培養10~15天(通常可以是12天左右)后傳代至P1代,繼續用完全培養基培養;

(5)P1代細胞收獲:用胰酶消化液將上一步驟中的兩部分合并后的P1代細胞消化后,收集細胞,計數并測定細胞活率,凍存,即得P1代的羊膜間充質干細胞,必要時對其進行傳代培養。

9.根據權利要求1的用途,其中:

所述基礎平衡鹽溶液中包括鏈霉素和青霉素兩種抗生素;

所述基礎平衡鹽溶液是通過如下方式配制得到的:將0.4g的KCl、0.06g的KH2PO4、0.132g的Na2HPO4.12H2O、8g的NaCl、0.35g的NaHCO3、1.0g的D-葡萄糖、0.10g的鏈霉素、0.06g的青霉素用水溶解并定容成1L的溶液;

所述混合酶消化液中包含:0.1mg/ml的I型膠原酶,0.3mg/ml的II型膠原酶,0.1mg/ml的透明質酸酶和0.05mg/ml的中性蛋白酶;

所述完全培養基包括:DMEM-F12培養基、FBS、青霉素、鏈霉素;

所述DMEM-F12培養基是DMEM-F12以體積比1:1配制的培養基;和/或

所述完全培養基包括:DMEM-F12(1:1)培養基、10%FBS、100μg/mL青霉素、50μg/mL鏈霉素。

10.根據權利要求1的用途,其中:

步驟(4)中,通常是培養10~15天(通常可以是12天左右)后傳代至P1代;和/或

步驟(5)中,胰酶消化液是包括0.25%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA的消化液。

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