基于核酸適配體檢測miRNA?155的方法與流程

文檔序號：12697659閱讀：1242來源：國知局

本發明涉及生物技術檢測技術領域，特別涉及基于核酸適配體檢測miR-155的方法。

背景技術：

MiRNA是一類長度為17-25個核苷酸的非編碼RNA分子，其在腫瘤發生、細胞分化、細胞凋亡和蛋白質合成等生命現象中扮演著重要的角色。miRNA的異常表達與人類多種疾病如癌癥，糖尿病，心血管疾病和神經病癥等直接相關，因此miRNA已經成為對于癌癥等多種疾病進行早期預防和診斷的重要生物標志物。miRNA-155作為miRNA的一種，它的過量表達將會導致乳腺癌的發生，因此通過對miR-155的高靈敏檢測來實現對乳腺癌的早期診斷和預防是非常有必要的。

目前報道的對于miR-155的檢測方法包括實時定量PCR法、Northern印跡雜交、基因芯片檢測等方法，這些方法往往存在儀器昂貴、分析周期長、樣品預處理復雜、檢測費用昂貴、檢測靈敏度低等問題，已經難以滿足對miR-155進行方便、快捷、高靈敏檢測的要求。因此，目前急需建立一種快速，準確，靈敏度高且特異性強的檢測方法來對miR-155進行檢測，以實現對乳腺癌的早期診斷和預防。

技術實現要素：

本發明基于核酸適配體與目標物的特異性識別，利用phi29 DNA聚合酶在滾環擴增中的鏈延伸作用以及核酸內切酶在特異性位點對核酸鏈的切割作用以及分子信標的熒光基團能夠產生熒光信號的特性構建了該生物檢測方法。該檢測方法具有檢測速度快，檢測限低，特異性高等優點，可以彌補miRNA-155現有檢測方法的缺陷與不足，實現對其快速，準確的定量檢測。

本發明中一共用到了4種DNA鏈和1種分子信標，其序列分別是：

Circular template 1:

5’-P-CCC CTA TAT AGA AGT CTG ATA GCA CAG ACG CGC CAT CGA TAG GCG TGG AGC ATT ACC CGT GGC TTC TTC GTA CTA G-3’ (SEQ ID NO:1)；

Circular template 2:

5’-P-AAG TAG TCT ATT GGT CGG ATC TGG AGG TTG CAT GTG CTG AGG CGA ATT TAA CGA CCC ACA CCG AAT ACA A-3’(SEQ ID NO:2)；

Hairpin 1:

5’-CCC CTA TCA CGA TTA GCA TTA ACA TTG AGG ATT TCT ATA TAG GGG-3’(SEQ ID NO:3)；

Hairpin 2:

5’-TGGAGCATTACCCGTTTTTACCTCCAGA-3’(SEQ ID NO:4)；

Molecular beacon:

5’-FAM-CATGTGCTGAGGCGTTTCACATG-Dabcyl-3’(SEQ ID NO:5)。

其中在Hairpin1結構的序列中，5’端畫橫線的部分為目標物miRNA-155的適配體，可以與目標物通過堿基互補配對作用而緊密結合，因而可以將Hairpin1打開然后釋放出它的3’端從而進行下一步的反應。

Molecular beacon的5’端修飾有熒光基團，3’端修飾有猝滅基團，由于其自身能維持發夾型結構，因此就使熒光基團和猝滅基團臨近，因而在激發波的作用下無法檢測到熒光信號或者熒光信號很弱；如果將發夾型的分子信標打開或者將其切斷使得熒光基團和猝滅基團遠離，在激發波的作用下就會檢測到強烈的熒光信號，我們就是通過檢測熒光信號的強度來達到定量檢測目標物的目的。

本發明中用到了兩種酶：phi29 DNA聚合酶和Nb.BbvCI核酸內切酶。phi29 DNA聚合酶具有鏈延伸的功能；核酸內切酶可以在特異性位點實現對DNA雙鏈的特異性切割，其特異性的切割識別序列是:5’---GCTGAGG---3’，切割位點位于靠近5’端的第二個和第三個堿基之間。

本發明中miRNA-155的檢測是在均相溶液中實現的，通過利用三步信號放大技術來實現對目標物的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。

均相中發生的反應主要有：發夾結構的Hairpin1中有目標物的適配體，在有目標物存在的情況下，該適配體序列能夠特異性的識別目標物并與之結合，發生構型轉變，從而將發夾結構的Hairpin1打開并且釋放出Hairpin1的3’ 端，釋放出的Hairpin1的3’端能夠與Circular template1的一段核酸序列互補配對，在phi29 DNA聚合酶和dNTPs的作用下進行第一步滾環擴增反應，從而產生一段單鏈DNA。這一段單鏈DNA又能夠打開大量的發夾型Hairpin2進而釋放出Hairpin2的3’端，然后釋放出的Hairpin2的3’端又能夠與Circular template2的一段核酸序列互補配對，從而進行第二步滾環擴增反應，并且釋放出一條長的單鏈DNA序列。作為第二步滾環擴增反應的產物，這一條長的單鏈DNA序列又能夠打開發夾狀的分子信標，使得修飾在分子信標5’端和3’端的熒光基團和猝滅基團分離，從而能夠產生熒光信號。同時，被打開的分子信標又會暴露出一種核酸內切酶（Nb.BbvCI）的酶切位點,從而將結合在第二次滾環擴增產生的單鏈DNA上的MB切割后將MB釋放下來，然后第二次滾環擴增所產生的單鏈又能夠進行下一步的反應，最終不斷地將MB打開、切割、釋放從而實現第三步信號放大反應，產生強烈的熒光信號。

在均相反應中，反應條件為37℃，反應時間是70 min。

該發明的檢測方式是熒光檢測，利用的是一臺安捷倫熒光分析儀。所有分析檢測過程中激發波、發射波的狹縫都為5nm，電壓為950V，激發波為486nm，在發射光譜的518nm處獲得發射波的強度，根據不同的熒光強度來檢測目標物miRNA-155的濃度。

具體檢測方法如下：

1）將1μL， 1.0μM 的Hairpin1，1μL，1.0μM 的Circular template 1, 1μL，1.0μM 的Hairpin2， 1μL，1.0μM的 Circular template 2，Molecular beacon（1μL，1.0μM），1μL，10×的phi29 DNA聚合酶，1μL，10×的Nb.BbvCI , NEB buffer(5μL，10×)和待測物加入到EP管中，震蕩30s，放入37℃的水浴鍋中反應70min；

2）將反應好的溶液從水浴鍋中取出，放入85℃的水浴鍋中水浴加熱10min，使體系中的酶失活；

3）10 min后，從水浴鍋中取出混合溶液，然后用安捷倫熒光檢測儀測定混合溶液的熒光強度，據此檢測目標物。

有益效果

1、通過利用堿基互補配對原則，使得核酸適配體能夠高特異性地識別目標物miRNA-155，最終實現了對其的高特異性檢測；

2、利用了三步信號放大技術極大地增強了熒光信號，從而提高了檢測的靈敏度，實現對目標物miRNA-155的高靈敏檢測；

3、該生物傳感器的檢測反應過程均是在均相中進行的，提高了反應速度，降低了操作的復雜程度，實現了對目標物的快速，簡單，靈敏的檢測；

4、制備方法簡單，性能穩定，重復性好，適用于人體組織中miRNA-155的檢測和生物傳感器產業化的實際應用；

5、制作該生物傳感器的工藝成本低，符合產業化中價格價廉的要求。

附圖說明

圖1為該實驗的原理圖；

圖2為實施例1 Hairpin1濃度優化檢測結果圖；

圖3為實施例2 Circular template1濃度優化檢測結果圖；

圖4為實施例3 Hairpin2濃度優化檢測結果圖；

圖5為實施例4 Circular template2濃度優化檢測結果圖；

圖6為實施例5 Molecular beacon濃度優化檢測結果圖；

圖7為實施例6傳感器檢測的標準曲線。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，下述說明僅是實例性的，不限定本發明的保護范圍。

實施例1

a、將1μL不同濃度的Hairpin1（終濃度分別為0.4μM，0.6μM，0.8μM，1.0μM，1.2μM，1.4μM），Circular template1（1μL， 10μM），Hairpin2（1μL，10μM）,Circular template 2（1μL，10μM）, Molecular beacon（1μL，100μM），phi29 DNA聚合酶（1μL，10×），Nb.BbvCI(1μL，10×), NEB buffer(5μL，10×)和待測物（miRNA-155）加入到EP管中，震蕩30s，放入37℃的水浴鍋中反應70min。