重組核酸片段RecCR012602及其檢測方法與流程

本申請涉及全基因組選擇育種技術。具體而言，本申請涉及利用全基因組選擇育種技術選育含有重組核酸片段的水稻植株，以及由此而獲得的重組核酸片段及其檢測方法。

背景技術：

長期以來，傳統育種的選擇方法主要依賴于田間表現型的評價，根據育種家個人經驗進行取舍，其最大的缺點在于耗時長，效率較低。要提高選擇的效率，最理想的方法應是能夠直接對基因型進行選擇。隨著分子生物技術的發展，分子標記為實現對基因型的直接選擇提供了可能。近年來，已開始應用分子標記輔助選擇方法來改良個別目標性狀，能夠顯著的縮短育種年限。

稻瘟病是水稻最嚴重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻產量損失占11％～30％，因此稻瘟病及其抗性的研究顯得尤為重要。隨著對稻瘟病研究的逐步深入，許多水稻抗稻瘟病基因DNA片段相繼被定位和克隆。其中，水稻第6染色體的Pi2區間被定位和克隆了很多稻瘟病抗性基因，如Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi50，該區間包含一個稻瘟病抗性基因的基因簇(Qu等，Genetics.2006,172:1901-1914；Wang等，Phytopathology.2012,102:779-786；Xiao等，Mol Breeding.2012,30:1715-1726；Liu等，Mol Genet Genomics.2002,267:472-480；Jiang等，Rice.2012,5:29-35；Zhu等，Theor Appl Genet.2012,124:1295-1304；Deng等，Theor Appl Genet.2006,113:705-713)。

技術實現要素：

一方面，本申請提供了重組核酸片段，其選自：i)包含SEQ ID NO:1所示序列368-1702位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補 序列；ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其變體或其互補序列；iii)包含SEQ ID NO:2所示序列564-968位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補序列；iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其變體或其互補序列；以及以上片段的組合。在一實施方案中，所述重組核酸片段為基因組重組核酸片段。

此外，本申請提供了檢測所述重組核酸片段的引物，其選自：(I)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列1-368位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列1702-2839位核苷酸的序列的反向引物；(II)以下第一組引物對與第二組引物對的組合，其包含(a)第一組引物對：特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-368位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第369-1701位核苷酸的序列的反向引物；和(b)第二組引物對：特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第369-1701位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1702-2839位核苷酸的序列的反向引物；(III)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第367-368位或第368-369位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第1701-1702位或第1702-1703位核苷酸的序列的反向引物；(IV)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第367-368位或第368-369位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1702-2839位核苷酸的序列的反向引物；(V)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-368位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第1701-1702位或第1702-1703位核苷酸的序列的反向引物；和/或任選地，(VI)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列1-564位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列968-1748位核苷酸的序列的反向引物；(VII)以下第三組引物對與第四組引物對的組合，其包含(c)第三組引物對：特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-564位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第565-967位核苷酸的序列的反向引物；和(d)第四組引物對：特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第565-967位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第 968-1748位核苷酸的序列的反向引物；(VIII)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第564-565位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第967-968位或第968-969位核苷酸的序列的反向引物；(IX)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第564-565位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第968-1748位核苷酸的序列的反向引物；(X)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-564位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第967-968位或第968-969位核苷酸的序列的反向引物。

在一實施方案中，用于擴增SEQ ID NO:1所示序列的引物對為，例如，5’-TATGCTTGGCGTCATATTGCTCTT-3’，和5’-TATTTTGCTATCGGATCTAAACCCT-3’。用于檢測SEQ ID NO:1所示序列的測序引物為，例如，5’-ATGGAACGGTCCCATACTTG-3’，5’-GAATATCGGTTTCGGTTGAT-3’，5’-GGACAATAACATTCCACCAG-3’，5’-TGAAGAGGACGGATTGTGAG-3’，5’-GGGATCGTACTCGCACAGAG-3’和5’-CGGACAGATGATTACCCACA-3’。

在另一實施方案中，用于擴增SEQ ID NO:2所示序列的引物對為，例如，5’-GAAGTCGCATAATAGTAACCACG-3’，和5’-GAAACCGCCTACGATACATACCC-3’。用于檢測SEQ ID NO:2所示序列的測序引物為，例如，5’-TGGGAGACAGGATTCATACC-3’，5’-CGAATTTACTACCCGTGAG-3’，5’-CCCCAGTTGGGTCGGAAAG-3’，5’-GGGTCAGAGCCAAAGTGCG-3’和5’-GAAACCGCCTACGATACATACCC-3’。

另一方面，本申請提供了選育含有重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以不含目的基因組片段的水稻受體植物親本作為輪回親本，將其與含有目的基因組片段的水稻供體植物進行雜交，然后將所得到的雜交種與輪回親本進行回交，再將所得到的回交種進行自交的步驟，其中利用分子標記對重組植株進行前景選擇和背景選擇。例如，所述重組核酸片段如前所述。

在上述方法中，用于所述前景選擇的分子標記選自Pi31、W068C06B和Pi2S122中的一種或多種；和/或利用水稻全基因組育種 芯片進行所述背景選擇。

在一實施方案中，本申請提供的選育含有抗稻瘟病基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以下步驟：1)將輪回親本與供體植物進行雜交，再將所得到的雜交種與輪回親本進行回交，獲得回交一代，利用正向選擇標記Pi31和負向選擇標記W068C06B、Pi2S122對其進行抗稻瘟病基因組片段的單側同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對其進行背景選擇；2)選擇背景回復較好的重組單株(此世代背景回復值超過75％)與輪回親本再次進行回交，獲得回交二代，利用正向選擇標記Pi31對其進行檢測，選擇含有抗稻瘟病基因組片段的重組單株，然后利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對其進行背景選擇；3)選擇背景回復好的重組單株(此世代背景回復值超過87.5％)與輪回親本又一次進行回交，獲得回交三代，利用正向選擇標記Pi31和負向標記W068C06B、Pi2S122對其進行抗稻瘟病基因組片段的另一側同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對其進行背景選擇；以及4)選擇導入片段小，且背景回復好的重組單株(背景回復值超過93.75％)，將選中的重組單株自交一次，獲得自交種，利用正向選擇標記Pi31對其進行檢測，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對其進行背景選擇，最終獲得含抗稻瘟病基因組重組核酸片段純合且背景回復(背景回復值超過99％)的水稻植株。

在另一實施方案中，利用分子標記對重組植株進行前景選擇時采用的擴增引物，包括：用于擴增分子標記Pi31的引物對，其中正向引物為5’-ATCCAAACCCGTTGTTGCAC-3’，反向引物為5’-CGGCAATTGCCACGATGATA-3’；用于擴增分子標記W068C06B的引物對，其中正向引物為5’-CCTATCGCTGACAAAGAG-3’，反向引物為5’-CACCCAGCCAGTTCATCTA-3’；以及用于擴增分子標記Pi2S122的引物對，其中正向引物為5’-GACTTGAAAACCAGTGCGTG-3’，反向引物為5’-CCTACCTAATGGAAAGGATTGC-3’。

又一方面，本申請提供了檢測重組核酸片段的方法，其包括根據如前所述的重組核酸片段設計特異性引物，以待測基因組為模板進行PCR反應，并分析PCR擴增產物的步驟。具體地，例如，所述引物如 前所述。可選擇地，利用Sanger測序法分析PCR擴增產物。

具體而言，本申請提供的檢測重組核酸片段的方法中，用于擴增及檢測SEQ ID NO:1所示序列的引物組合如下：擴增引物，包括正向引物：5’-TATGCTTGGCGTCATATTGCTCTT-3’，反向引物：5’-TATTTTGCTATCGGATCTAAACCCT-3’；測序引物，包括正向引物：5’-ATGGAACGGTCCCATACTTG-3’，反向引物：5’-GAATATCGGTTTCGGTTGAT-3’，正向引物：5’-GGACAATAACATTCCACCAG-3’，正向引物：5’-TGAAGAGGACGGATTGTGAG-3’，正向引物：5’-GGGATCGTACTCGCACAGAG-3’和正向引物：5’-CGGACAGATGATTACCCACA-3’。所述方法以待測樣品基因組DNA為模板，利用上述擴增引物進行PCR擴增，然后利用上述測序引物對獲得的擴增產物進行測序，若測序結果與SEQ ID NO:1序列一致或互補，則待測樣品中含有SEQ ID NO:1所示同源重組片段。

另外，在本申請提供的檢測重組核酸片段的方法中，用于擴增及檢測SEQ ID NO:2所示序列的引物組合如下：擴增引物，包括正向引物：5’-GAAGTCGCATAATAGTAACCACG-3’，反向引物：5’-GAAACCGCCTACGATACATACCC-3’；測序引物，包括正向引物：5’-TGGGAGACAGGATTCATACC-3’，正向引物：5’-CGAATTTACTACCCGTGAG-3’，正向引物：5’-CCCCAGTTGGGTCGGAAAG-3’，正向引物：5’-GGGTCAGAGCCAAAGTGCG-3’和反向引物：5’-GAAACCGCCTACGATACATACCC-3’。所述方法以待測樣品基因組DNA為模板，利用上述擴增引物進行PCR擴增，然后利用上述測序引物對獲得的擴增產物進行測序，若測序結果與SEQ ID NO:2序列一致或互補，則待測樣品中含有SEQ ID NO:2所示同源重組片段。

通過檢測確定了待測樣品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

此外，本申請還提供了檢測重組核酸片段的試劑盒，其包括如前述的引物。

進一步地，本申請還提供了篩選含有重組核酸片段的水稻植株或種子的方法，其包括檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段的步驟。在一實施方案中，采用如前所述的引物來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在另一實施方案中，采用如前所述的檢測重組核酸片段的方法來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在又一實施方案中，采用如前所述的試劑盒來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。

在又一方面，本申請提供了通過所述方法篩選得到的含有本申請公開的重組核酸片段的水稻植株或其種子。

本申請提供的基于全基因組選擇育種技術的選育含有抗稻瘟病基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，具有快速、準確、穩定的優勢。僅通過五世代轉育，即可僅將目標基因組片段導入受體材料，并同時實現背景的回復。本申請改良的受體材料為‘HD9802S’，為水稻早秈型溫敏不育系。利用上述方法，可以在保留‘HD9802S’原有特性的情況下大幅度提高其稻瘟病抗性。同時，本申請提供的基因組重組核酸片段與稻瘟病抗性緊密相關，可作為抗性資源應用于其他品種的培育。

附圖說明

圖1為本申請實施例1中CR012602水稻RICE60K全基因組育種芯片檢測結果；其中，橫坐標數字所指示方框依次表示水稻12條染色體，縱坐標數字為水稻基因組上的物理位置[以兆堿基(Mb)為單位]，灰色線條代表受體親本‘HD9802S’基因型，黑色線條代表供體親本‘R6’基因型，白色線條代表兩親本基因型一致即無多態性區段。圖中第6號染色體黑色圓點處線條顯示區段即為導入的抗稻瘟病基因組重組核酸片段RecCR012602。

圖2A和圖2B為本申請實施例2中RecCR012602上游同源重組片段測序比對結果；圖中所示星號代表比對結果中相同堿基，圖中CR012602為獲得的新品系，HD9802S為受體親本‘HD9802S’，R6 為供體親本‘R6’。

圖3A和圖3B為本申請實施例2中RecCR012602下游同源重組片段測序比對結果；圖中所示星號代表比對結果中相同堿基，圖中CR012602為獲得的新品系，HD9802S為受體親本‘HD9802S’，R6為供體親本‘R6’。

圖4為本申請實施例2中RecCR012602兩側同源重組片段的結構圖；其中，(A)為上游同源重組片段結構圖；(B)為下游同源重組片段結構圖，上方堿基為供體‘R6’的SNP或InDel標記，下方堿基為受體‘HD9802S’的SNP或InDel標記。灰色區段為來源于‘HD9802S’基因組區段，黑色區段為來源于‘R6’基因組區段，白色區段為同源重組區段，橫坐標為片段長度，以堿基對數目(bp)為單位。

圖5為本申請實施例3中CR012602稻瘟病抗性室內鑒定結果；圖中所示葉片依次為：(A)稻瘟病感病品種麗江新團黑谷；(B)原品種‘HD9802S’；(C)改良新品系CR012602；(D)稻瘟病抗病品種谷梅4號。

具體實施方式

提供以下定義和方法用以更好地界定本申請以及在本申請實踐中指導本領域普通技術人員。除非另作說明，術語按照相關領域普通技術人員的常規用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向從左向右書寫，包括具有天然核苷酸基本性質的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。

在一些實施方案中，可以對本申請的核苷酸序列進行改變，以進行保守氨基酸替換。在某些實施方案中，可以依照單子葉密碼子偏好性對本申請的核苷酸序列進行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變該核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。

具體地，本申請涉及對SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2進一步優化所得的核苷酸序列。該方法的更多細節描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。優化核苷酸序列可用于提高抗稻瘟病基因組重組核酸片段在水稻中的表達。

在一些實施方案中，本申請還涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的變體。一般來講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補序列。這樣的變體序列包括一個或多個核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導致相應的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過本領域內已知的序列比對程序包括雜交技術確定序列同一性。實施方案的核苷酸序列變體與本申請的序列的差異可以少至1-15個核苷酸、少至1-10個(例如6-10個)，少至5個，少至4、3、2或甚至1個核苷酸。

本申請還涉及包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列中特定位點的序列或其片段或其變體或其互補序列，例如，包含SEQ ID NO:1所示序列的368-1702位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補序列，或者包含SEQ ID NO:2所示序列的564-968位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補序列。根據包含上述特定位點的片段，能夠特異性地鑒定出相應的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列。進一步地，通過鑒定出含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以與水稻育種的所有植物品種。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物細胞、植物器官、植物原生質體、植物可以從中再生的植物細胞組織培養物、植物愈傷組織、植物叢和植物或植物部分中完整的植物細胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、莖桿、根、根尖、花藥等。

在本申請的方法可以適用于任何需要選育的水稻品種。也就是說，可以將任何缺少某種有利性狀的優良品種(即綜合性狀較好，預計有發 展前途的品種)用作輪回親本。用另一具有該受體所缺少的有利性狀的品種作為供體親本，并且所提供的有利性狀最好是顯性單基因控制的。在本申請的實施方案中，采用水稻‘HD9802S’作為輪回親本，采用已被證實具有良好的稻瘟病抗性的水稻‘R6’作為供體。

在本申請所提供的重組植株的選育方法中，利用分子標記對重組植株進行前景選擇。前景選擇的可靠性主要取決于標記與目標基因間連鎖的緊密程度，為提高選擇的準確率，一般同時用兩側相鄰的兩個標記對目標基因進行跟蹤選擇。

在本申請的實施方案中，采用的前景選擇標記包括正向選擇標記和負向選擇標記。在具體實施方案中，經優化篩選使用的正向前景選擇標記是與目標基因組片段緊密連鎖的標記Pi31，負向選擇標記是位于目標片段上游的標記W068C06B，以及位于目標片段下游的標記Pi2S122。

在本申請的實施方案中，利用上述前景選擇標記進行同源重組的檢測時，一側或單側同源重組的判斷標準是Pi31檢出與‘R6’相同帶型，且W068C06B或Pi2S122檢出與‘HD9802S’相同帶型；兩側或雙側同源重組的判斷標準是Pi31檢出與‘R6’相同帶型，且W068C06B和Pi2S122檢出與‘HD9802S’相同帶型。

在本申請中，可以使用任何一種可利用的芯片進行本申請所提供的育種方法中的背景選擇。在優選的實施方案中，可以采用本申請人在中國專利申請CN102747138A中公開的水稻全基因組育種芯片RICE6K，或者在PCT國際申請WO/2014/121419中公開的水稻全基因組育種芯片RICE60K。這兩份申請文件中的全部內容整體并入本文作為參考。

以下實施例僅用于說明而非限制本申請范圍的目的。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

本申請中所使用的水稻植株材料信息均可參見中國水稻品種及其系譜數據庫(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申請中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

實施例1選育導入抗稻瘟病基因組片段的重組植株

本實施例中使用的材料為水稻‘HD9802S’及水稻‘R6’。

水稻‘R6’具有良好的稻瘟病抗性，并推測可能是第6號染色體的Pi2、Pi9和Pigm所在的基因簇區域對該材料的稻瘟病抗性起到了關鍵作用。

在重組植株的選育過程中，利用分子標記對重組植株進行前景選擇，對所采用的前景選擇分子標記進行了篩選。參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載第6染色體9,559,000至10,990,000DNA序列。使用SSRLocator軟件對上述序列中的SSR位點進行掃描。利用Primer Premier 3.0軟件對尋找出的SSR位點設計引物，共設計引物162對。通過PCR的方法，篩選上述引物對在‘R6’及‘HD9802S’中的多態性，最終挑選出在兩份材料中具有多態性、擴增效率高的前景選擇分子標記，分別是正向選擇標記Pi31和負向選擇標記W068C06B、Pi2S122。用于PCR擴增上述分子標記的具體引物信息見表1。

表1 前景選擇分子標記引物信息

將水稻‘R6’中前述基因簇所在的基因組片段導入到水稻‘HD9802S’中，具體過程如下：

以‘HD9802S’為輪回親本，‘R6’為供體親本進行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘HD9802S’進行回交，獲得BC₁F₁種子，育苗后利用正向選擇標記Pi31和負向選擇標記W068C06B、Pi2S122 進行重組單株選擇，篩選出24個在目標基因組DNA片段一側同源重組的單株，即Pi31檢出與‘R6’相同帶型，且W068C06B或Pi2S122檢出與‘HD9802S’相同帶型，并利用水稻全基因組育種芯片RICE6K(CN102747138A)對其進行背景選擇(Yu等,Plant Biotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在篩選出的24個單側同源重組單株中比較芯片結果，選擇背景回復最好的重組單株(此世代背景回復值超過75％)，使其與輪回親本‘HD9802S’再次進行回交，獲得BC₂F₁種子，育苗后利用正向選擇標記Pi31對其進行檢測，選擇含有目標基因組DNA片段的重組單株，即Pi31檢出與‘R6’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE6K對其進行背景選擇。

選擇背景回復較好的單株(此世代背景回復值超過87.5％)，使其與輪回親本‘HD9802S’又一次進行回交，獲得BC₃F₁種子，育苗后利用正向選擇標記Pi31和負向標記W068C06B、Pi2S122對收獲的種子進行目標基因組DNA片段另一側同源重組片段的篩選，獲得24個在目標片段兩側重組的單株，即Pi31檢出與‘R6’相同帶型，且W068C06B和Pi2S122檢出與‘HD9802S’相同帶型。

利用水稻全基因組育種芯片RICE60K(WO/2014/121419)對上述24個雙側交換單株進行背景和目標片段選擇(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，篩選到導入目標片段較小，且背景回復好的目標單株一個(此世代背景回復值超過93.75％)。

將選中的單株自交一次，獲得BC₃F₂，育苗后利用正向選擇標記Pi31對其進行檢測，選擇含有目標基因組DNA片段的單株，即Pi31檢出與‘R6’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對其進行背景選擇。

最終獲得目標片段純合，且背景回復(背景回復值超過99％)的株系一個，命名為CR012602。芯片檢測結果見圖1。

因‘HD9802S’為兩系不育系，在上述過程中的BC₁F₁、BC₂F₁、BC₃F₁及BC₃F₂世代入選單株均為不育單株，采取了以下辦法實現不育單株的育性轉化以回交或自交：當不育單株進入生殖期4期時，在 低溫處理區(21-23℃)處理10天左右，可利用植物人工氣候箱、植物生長室、冷水浸灌池等；使用碘-碘化鉀染色法對抽出穗的花粉進行育性鑒定，判定70％以上花粉可育的穗為育性成功轉化穗，隨即開展回交或自交。

實施例2導入稻瘟病抗性基因組片段后同源重組片段的確定

為了確定導入的稻瘟病抗性基因組片段大小，對‘HD9802S’導入片段的純合單株進行了目標基因組片段兩側同源重組片段的測序。將CR012602所含的抗稻瘟病基因組重組核酸片段命名為RecCR012602。

通過水稻全基因組育種芯片RICE60K檢測結果初步確定，RecCR012602位于兩個SNP標記R0610084130TG和R0610454932GA之間。

同時，使用Miseq測序技術對‘HD9802S’、‘R6’和CR012602三個樣本進行全基因組測序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)試劑盒進行文庫建立，使用Library Quantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進行定量，使用MiSeq V2 Reagent Kit(illumina)試劑盒進行測序反應。使用Miseq臺式測序儀(illumina)進行檢測。具體步驟及方法參見各試劑盒及測序儀使用說明書。

根據前述SNP芯片及Miseq測序結果，將RecCR012602上游同源重組片段定位在第6染色體的10090076bp到10093784bp區間，下游同源重組片段定位于10437335bp到10439846bp區間。

在此基礎上，參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載對應區段DNA序列。使用Primer Premier 5.0軟件設計擴增及測序引物，設計要求為引物長22nt左右、GC含量40-60％且沒有錯配。

以受體親本‘HD9802S’和供體親本‘R6’為對照，對RecCR012602上游和下游同源重組片段分別設計擴增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)進行擴增，使用兩步法或三步法尋找最佳擴增條件，確保擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳檢測中顯示為單一明亮條帶。其中確定的上游同源重組片段擴增引物反應條件為：94℃2min；98℃10sec， 68℃180sec，37個循環；20℃1min。下游同源重組片段擴增引物反應條件為：94℃2min；98℃10sec，68℃180sec，37個循環；20℃1min。由此，最終各篩選出一對擴增引物用于上游和下游同源重組片段的擴增。

另外，以擴增產物為模板，利用Sanger測序法進行測序，根據實際測序效果，最終各篩選出6條和5條測序引物分別用于上游和下游同源重組片段的測序。具體的擴增引物及測序引物序列見表2，測序結果見圖2A、圖2B和圖3A、圖3B。

RecCR012602上游同源重組片段測序長度為2839bp(SEQ ID NO:1)。1-368bp為受體‘HD9802S’的基因組區段，與供體‘R6’比較，存在2個SNP，1個Indel。369-1701bp這一1333bp區段為同源重組區段。1702-2839bp為供體‘R6’基因組片段，與‘HD9802S’比較，存在4個SNP。

RecCR012602下游同源重組片段測序長度為1748bp(SEQ ID NO:2)。1-564bp為供體‘R6’的基因組區段，與‘HD9802S’比較，存在2個SNP，1個Indel。565-967bp這一403bp區段為同源重組區段。968-1748bp為受體‘HD9802S’的基因組區段，與供體‘R6’比較，存在3個SNP，2個Indel。

圖4為RecCR012602兩側同源重組片段的結構圖。其中，(A)為上游同源重組片段結構圖；(B)為下游同源重組片段結構圖。上方堿基為供體‘R6’的SNP或InDel標記，下方堿基為受體‘HD9802S’的SNP或InDel標記。灰色區段為來源于‘HD9802S’基因組區段，黑色區段為來源于‘R6’基因組區段，白色區段為同源重組區段。橫坐標為片段長度，以堿基對數目(bp)為單位。

表2 抗稻瘟病基因組重組核酸片段擴增及測序引物信息

實施例3‘HD9802S’導入抗稻瘟病基因組片段后的抗性鑒定

為了鑒定抗性效果，對本申請選育的新品系CR012602、輪回親本‘HD9802S’、稻瘟病抗病品種谷梅4號(作為陽性對照)，以及稻瘟病感病品種麗江新團黑谷(作為陰性對照)進行室內種植，將其培養至3-4葉期后采用如下方法進行鑒定：

選取2015年從湖北宜昌病圃稻瘟病病樣上分離的M15Bb-1-1、M15Bb-1-2、M15Bb-2-1、M15Bb-3-1、M15Bb-4-1、M15Bb-5-1和M15Bb-6-1，共7株稻瘟病菌株作為接種菌株。菌株采用高粱粒法-20℃保存，使用前將保存的高粱粒取出至馬鈴薯葡萄糖培養基(PDA)平板活化(PDA：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水定容至1L)，28℃光照培養5天后取直徑5mm的新鮮菌絲塊轉接至高粱粒培養基中(高粱粒500g加入1.5L蒸餾水，煮至沸騰后濾去液體，將高粱粒撈出裝入250ml三角瓶，100ml/瓶，濕熱滅菌20分鐘)，10塊/瓶，接菌2天后每天將高粱粒搖散，28℃黑暗培養至菌絲長滿高粱粒。然后將高粱粒攤在無菌紗布上，蓋上無菌的潮濕紗布，在25℃，RH≥95％，12h光照條件下培養4-5天至大量孢子產生，用無菌水(含0.02％吐溫20)洗下孢子，等孢子量混合接種菌株，調整濃度至5×10⁵個/ml。

用混合分生孢子懸浮液噴霧接種CR012602、‘HD9802S’、谷梅4號及麗江新團黑谷，接種三個重復。接種后罩上透明罩子，28℃黑暗培養24h，然后16h光照培養5天后調查。

調查標準為0級(高抗，HR)：沒有癥狀；1級(抗，R)：很小的褐色病斑；2級(中抗，MR)：直徑約為1mm的褐色病斑；3級(MS，中 感)：直接約為2-3mm的帶圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；4級(感，S)：長約1-3cm的橢圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；5級(高感，HS)：長且寬的大橢圓形病斑，病斑融合成片，至葉片枯死。其中0-2級為抗病，3-5級為感病。接種結果見表3和圖5。

表3 接種稻瘟菌后的抗性表現

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本申請作了詳盡的描述，但在本申請基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本申請精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本申請要求保護的范圍。