重組核酸片段RecCR033207及其檢測方法與流程

本申請涉及全基因組選擇育種技術。具體而言，本申請涉及利用全基因組選擇育種技術選育含有重組核酸片段的水稻植株，以及由此而獲得的重組核酸片段及其檢測方法。

背景技術：

長期以來，傳統育種的選擇方法主要依賴于田間表現型的評價，根據育種家個人經驗進行取舍，其最大的缺點在于耗時長，效率較低。要提高選擇的效率，最理想的方法應是能夠直接對基因型進行選擇。隨著分子生物技術的發展，分子標記為實現對基因型的直接選擇提供了可能。近年來，已開始應用分子標記輔助選擇方法來改良個別目標性狀，能夠顯著的縮短育種年限。

三系雜交水稻具有穩產、高產等優勢，是在細胞質雄性不育(即CMS，Cytoplasmic Male Sterility)基礎上開發配套的恢復系、保持系和不育系。CMS恢復系主要有野敗型(WA)CMS恢復系和紅蓮型(HL)CMS恢復系，以及粳稻包臺型(BT)CMS恢復系(萬建民等，2008)。上述3種類型中控制著育性恢復的關鍵位點之一就是Rf-1基因及其相鄰區間，它包括了野敗型CMS恢復基因Rf4(Tang等，2014)、包臺型CMS恢復基因Rf-1(Rf1a)和Rf1b(Wang等，2006；Komori等，2004)、紅蓮型CMS恢復基因Rf5(Rf1a)(Hu等，2012)。

技術實現要素：

一方面，本申請提供了重組核酸片段，其選自：i)包含SEQ ID NO:1所示序列224-367位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補序列；ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其變體或其互補序列；iii)包含SEQ ID NO:2所示序列339-607位核苷酸的序列或 其片段或其變體或其互補序列；iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其變體或其互補序列；以及以上片段的組合。在一實施方案中，所述重組核酸片段為基因組重組核酸片段。

此外，本申請提供了檢測所述重組核酸片段的引物，其選自：(I)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列1-224位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列367-1190位核苷酸的序列的反向引物；(II)以下第一組引物對與第二組引物對的組合，其包含(a)第一組引物對：特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-224位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第225-366位核苷酸的序列的反向引物；和(b)第二組引物對：特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第225-366位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第367-1190位核苷酸的序列的反向引物；(III)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第223-224位或第224-225位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第366-367位或第367-368位核苷酸的序列的反向引物；(IV)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第223-224位或第224-225位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第367-1190位核苷酸的序列的反向引物；(V)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-224位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第366-367位或第367-368位核苷酸的序列的反向引物；和/或任選地，(VI)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列1-339位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列607-1035位核苷酸的序列的反向引物；(VII)以下第三組引物對與第四組引物對的組合，其包含(c)第三組引物對：特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-339位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第340-606位核苷酸的序列的反向引物；和(d)第四組引物對：特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第340-606位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第607-1035位核苷酸的序列的反向引物；(VIII)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第338-339位或第339-340位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第606-607位或第607-608位核苷酸的序列的反向引物；(IX)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第338-339位或第339-340位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第607-1035位核苷酸的序列的反向引物；(X)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-339位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第606-607位或第607-608位核苷酸的序列的反向引物。

在一實施方案中，用于擴增SEQ ID NO:1所示序列的引物對為，例如，5’-AACGGAGGTAGTAGCAACAAGA-3’，和5’-AATATGTGAGACCCACAGAACG-3’。用于檢測SEQ ID NO:1所示序列的測序引物為，例如，5’-AGGTGAAGGATCGGGCATAG-3’，5’-TTCGCTGTCCCTACTTCCC-3’和5’-TGTCGTCTGCCCGTGTCGT-3’。

在另一實施方案中，用于擴增SEQ ID NO:2所示序列的引物對為，例如，5’-CTAACAGTCATCCCTTCAGA-3’，和5’-TAGCCTCATTTAGCCTTATC-3’。用于檢測SEQ ID NO:2所示序列的測序引物為，例如，5’-ACTTGAGGAGTCTTGCCATT-3’，5’-GAGGCATCAATCCTGGTCAT-3’，5’-TTTGCGTGCCAGACACTTCG-3’和5’-TAGCCTCATTTAGCCTTATC-3’。

另一方面，本申請提供了選育含有重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以不含目的基因組片段的水稻受體植物親本作為輪回親本，將其與含有目的基因組片段的水稻供體植物進行雜交，然后將所得到的雜交種與輪回親本進行回交，再將所得到的回交種進行自交的步驟，其中利用分子標記對重組植株進行前景選擇和背景選擇。例如，所述重組核酸片段如前所述。

在上述方法中，用于所述前景選擇的分子標記選自RfC10ID161、RfC10ID14和RfC10ID35中的一種或多種；和/或利用水稻全基因組育種芯片進行所述背景選擇。

在一實施方案中，本申請提供的選育含有Rf-1基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以下步驟：1)將輪回親本與供體植物進行雜交，再將所得到的雜交種與輪回親本進行回交，獲得回交一代，利用正向選擇標記RfC10ID161和負向選擇標記RfC10ID14、 RfC10ID35對其進行Rf-1基因組片段的單側同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對其進行背景選擇；2)選擇背景回復較好的重組單株(此世代背景回復值超過75％)與輪回親本再次進行回交，獲得回交二代，利用正向選擇標記RfC10ID161對其進行檢測，選擇含有Rf-1基因組片段的重組單株，然后利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對其進行背景選擇；3)選擇背景回復好的重組單株(此世代背景回復值超過87.5％)與輪回親本又一次進行回交，獲得回交三代，利用正向選擇標記RfC10ID161和負向標記RfC10ID14、RfC10ID35對其進行Rf-1基因組片段的另一側同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對其進行背景選擇；以及4)選擇導入片段小，且背景回復好的重組單株(背景回復值超過93.75％)，將選中的重組單株自交一次，獲得自交種，利用正向選擇標記RfC10ID161對其進行檢測，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對其進行背景選擇，最終獲得含Rf-1基因組重組核酸片段純合且背景回復(背景回復值超過99％)的水稻植株。

在另一實施方案中，利用分子標記對重組植株進行前景選擇時采用的擴增引物，包括：用于擴增分子標記RfC10ID161的引物對，其中正向引物為5’-TCATGTGATGAACATTAGCTGAGT-3’，反向引物為5’-CTTAGTCAATAGCGAGGACTCA-3’；用于擴增分子標記RfC10ID14的引物對，其中正向引物為5’-CGGCTCATCCATGTTGACTGACT-3’，反向引物為5’-ATGTTTGGGACGTGCGTGCAGAA-3’；以及用于擴增分子標記RfC10ID35的引物對，其中正向引物為5’-CACCAGCTAGAGCTAGGTTATTC-3’，反向引物為5’-CCTGTTTAGATTCGTGGTCCTGT-3’。

又一方面，本申請提供了檢測重組核酸片段的方法，其包括根據如前所述的重組核酸片段設計特異性引物，以待測基因組為模板進行PCR反應，并分析PCR擴增產物的步驟。具體地，例如，所述引物如前所述。可選擇地，利用Sanger測序法分析PCR擴增產物。

具體而言，本申請提供的檢測重組核酸片段的方法中，用于擴增及檢測SEQ ID NO:1所示序列的引物組合如下：擴增引物，包括正向引物：5’-AACGGAGGTAGTAGCAACAAGA-3’，反向引物： 5’-AATATGTGAGACCCACAGAACG-3’；測序引物，包括正向引物：5’-AGGTGAAGGATCGGGCATAG-3’，正向引物：5’-TTCGCTGTCCCTACTTCCC-3’和反向引物：5’-TGTCGTCTGCCCGTGTCGT-3’。所述方法以待測樣品基因組DNA為模板，利用上述擴增引物進行PCR擴增，然后利用上述測序引物對獲得的擴增產物進行測序，若測序結果與SEQ ID NO:1序列一致或互補，則待測樣品中含有SEQ ID NO:1所示同源重組片段。

另外，在本申請提供的檢測重組核酸片段的方法中，用于擴增及檢測SEQ ID NO:2所示序列的引物組合如下：擴增引物，包括正向引物：5’-CTAACAGTCATCCCTTCAGA-3’，反向引物：5’-TAGCCTCATTTAGCCTTATC-3’；測序引物，包括反向引物：5’-ACTTGAGGAGTCTTGCCATT-3’，反向引物：5’-GAGGCATCAATCCTGGTCAT-3’，正向引物：5’-TTTGCGTGCCAGACACTTCG-3’和反向引物：5’-TAGCCTCATTTAGCCTTATC-3’。所述方法以待測樣品基因組DNA為模板，利用上述擴增引物進行PCR擴增，然后利用上述測序引物對獲得的擴增產物進行測序，若測序結果與SEQ ID NO:2序列一致或互補，則待測樣品中含有SEQ ID NO:2所示同源重組片段。

通過檢測確定了待測樣品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

此外，本申請還提供了檢測重組核酸片段的試劑盒，其包括如前述的引物。

進一步地，本申請還提供了篩選含有重組核酸片段的水稻植株或種子的方法，其包括檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段的步驟。在一實施方案中，采用如前所述的引物來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在另一實施方案中，采用如前所述的檢測重組核酸片段的方法來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在又一實施方案中，采用如前所述的試劑盒來檢測待測水稻植株的基因組中是否 含有如前所述的重組核酸片段。

在又一方面，本申請提供了通過所述方法篩選得到的含有本申請公開的重組核酸片段的水稻植株或其種子。

本申請提供的基于全基因組選擇育種技術的選育含有Rf-1基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，具有快速、準確、穩定的優勢。僅通過五世代轉育，即可僅將目標基因組片段導入受體材料，并同時實現背景的回復。本申請改良的受體材料為‘華占’，是中國水稻研究所培育的秈型常規水稻，具有分蘗力強配合力高等特點。利用上述方法，可以在保留‘華占’原有特性的情況下，提高對不育系金農2A等材料的恢復能力，擴大配組范圍。同時，本申請提供的基因組重組核酸片段與育性恢復能力緊密相關，可作為基因資源應用于其他品種的培育。

附圖說明

圖1為本申請實施例1中CR033207水稻RICE60K全基因組育種芯片檢測結果；其中，橫坐標數字所指示方框依次表示水稻12條染色體，縱坐標數字為水稻基因組上的物理位置[以兆堿基(Mb)為單位]，灰色線條代表受體親本‘華占’基因型，黑色線條代表供體親本‘金恢3號’基因型，白色線條代表兩親本基因型一致即無多態性區段。圖中第10號染色體黑色圓點處線條顯示區段即為導入的Rf-1基因組重組核酸片段RecCR033207。

圖2為本申請實施例2中RecCR033207上游同源重組片段測序比對結果；圖中所示星號代表比對結果中相同堿基，圖中CR033207為獲得的新品系，HZ為受體親本‘華占’，JH3為供體親本‘金恢3號’。

圖3為本申請實施例2中RecCR033207下游同源重組片段測序比對結果；圖中所示星號代表比對結果中相同堿基，圖中CR033207為獲得的新品系，HZ為受體親本‘華占’，JH3為供體親本‘金恢3號’。

圖4為本申請實施例2中RecCR033207兩側同源重組片段的結構圖；其中，(A)為上游同源重組片段結構圖；(B)為下游同源重組片段結構圖，上方堿基為供體‘金恢3號’的SNP或InDel標記，下方堿 基為受體‘華占’的SNP或InDel標記。灰色區段為來源于‘華占’基因組區段，黑色區段為來源于‘金恢3號’基因組區段，白色區段為同源重組區段，橫坐標為片段長度，以堿基對數目(bp)為單位。

圖5為本申請實施例3中測配組合花粉I2-KI溶液染色鏡檢結果：(A)測配組合金農2A/CR033207花粉I2-KI溶液染色；(B)測配組合金農2A/華占花粉I₂-KI溶液染色。圖中，黑色表示被I₂-KI溶液完全染色，為可育花粉；灰色表示被I₂-KI溶液不完全染色，屬染敗類型，為不育花粉；透明表示未被I₂-KI溶液染色，屬圓敗類型，為不育花粉。

具體實施方式

提供以下定義和方法用以更好地界定本申請以及在本申請實踐中指導本領域普通技術人員。除非另作說明，術語按照相關領域普通技術人員的常規用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向從左向右書寫，包括具有天然核苷酸基本性質的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。

在一些實施方案中，可以對本申請的核苷酸序列進行改變，以進行保守氨基酸替換。在某些實施方案中，可以依照單子葉密碼子偏好性對本申請的核苷酸序列進行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變該核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。

具體地，本申請涉及對SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2進一步優化所得的核苷酸序列。該方法的更多細節描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。優化核苷酸序列可用于提高Rf-1基因組重組核酸片段在水稻中的表達。

在一些實施方案中，本申請還涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的變體。一般來講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補序列。這樣的變體序列包括一個或多個核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導致相應的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過本領域內已知的序列比對程序包括雜交技術確定序列同一性。實施方案的核苷酸序列變體與本申請的序列的差異可以少至1-15個核苷酸、少至1-10個(例如6-10個)，少至5個，少至4、3、2或甚至1個核苷酸。

本申請還涉及包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列中特定位點的序列或其片段或其變體或其互補序列，例如，包含SEQ ID NO:1所示序列的224-367位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補序列，或者包含SEQ ID NO:2所示序列的339-607位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補序列。根據包含上述特定位點的片段，能夠特異性地鑒定出相應的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列。進一步地，通過鑒定出含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以與水稻育種的所有植物品種。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物細胞、植物器官、植物原生質體、植物可以從中再生的植物細胞組織培養物、植物愈傷組織、植物叢和植物或植物部分中完整的植物細胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實、莖桿、根、根尖、花藥等。

在本申請的方法可以適用于任何需要選育的水稻品種。也就是說，可以將任何缺少某種有利性狀的優良品種(即綜合性狀較好，預計有發展前途的品種)用作輪回親本。用另一具有該受體所缺少的有利性狀的品種作為供體親本，并且所提供的有利性狀最好是顯性單基因控制的。在本申請的實施方案中，采用水稻‘華占’作為輪回親本，采用已被證實具有特異育性恢復能力的水稻‘金恢3號’作為供體。

在本申請所提供的重組植株的選育方法中，利用分子標記對重組植株進行前景選擇。前景選擇的可靠性主要取決于標記與目標基因間連鎖的緊密程度，為提高選擇的準確率，一般同時用兩側相鄰的兩個 標記對目標基因進行跟蹤選擇。

在本申請的實施方案中，采用的前景選擇標記包括正向選擇標記和負向選擇標記。在具體實施方案中，經優化篩選使用的正向前景選擇標記是與目標基因組片段緊密連鎖的標記RfC10ID161，負向選擇標記是位于目標片段上游的標記RfC10ID14，以及位于目標片段下游的標記RfC10ID35。

在本申請的實施方案中，利用上述前景選擇標記進行同源重組的檢測時，一側或單側同源重組的判斷標準是RfC10ID161檢出與‘金恢3號’相同帶型，且RfC10ID14或RfC10ID35檢出與‘華占’相同帶型；兩側或雙側同源重組的判斷標準是RfC10ID161檢出與‘金恢3號’相同帶型，且RfC10ID14和RfC10ID35檢出與‘華占’相同帶型。

在本申請中，可以使用任何一種可利用的芯片進行本申請所提供的育種方法中的背景選擇。在優選的實施方案中，可以采用本申請人在中國專利申請CN102747138A中公開的水稻全基因組育種芯片RICE6K，或者在PCT國際申請WO/2014/121419中公開的水稻全基因組育種芯片RICE60K。這兩份申請文件中的全部內容整體并入本文作為參考。

以下實施例僅用于說明而非限制本申請范圍的目的。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

本申請中所使用的水稻植株材料信息均可參見中國水稻品種及其系譜數據庫(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申請中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

實施例1選育導入Rf-1基因組片段的重組植株

本實施例中使用的材料為水稻‘華占’及水稻‘金恢3號’。

水稻‘金恢3號’具有特異育性恢復能力，并推測可能是第10染色體的Rf-1基因組片段對該材料的恢復能力起到了關鍵作用。

在重組植株的選育過程中，利用分子標記對重組植株進行前景選擇，對所采用的前景選擇分子標記進行了篩選。

使用Miseq測序技術對‘華占’和‘金恢3號’兩個親本進行全基因組測序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)試劑盒進行文庫建立，使用Library Quantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進行定量，使用MiSeq V2 Reagent Kit(illumina)試劑盒進行測序反應。使用Miseq臺式測序儀(illumina)進行檢測。具體步驟及方法參見各試劑盒及測序儀使用說明書。選取第10號染色體18,340,000至19,390,000DNA序列進行比對分析，尋找堿基差異較大的位置，之后利用Premier 5.0軟件在上述位置設計InDel標記共42對。通過PCR的方法，篩選上述引物對在‘金恢3號’及‘華占’中的多態性，最終挑選出在兩份材料中具有多態性、擴增效率高的前景選擇分子標記，分別是正向選擇標記RfC10ID161和負向選擇標記RfC10ID14、RfC10ID35。用于PCR擴增上述分子標記的具體引物信息見表1。

表1 前景選擇分子標記引物信息

將水稻‘金恢3號’中前述基因簇所在的基因組片段導入到水稻‘華占’中，具體過程如下：

以‘華占’為輪回親本，‘金恢3號’為供體親本進行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘華占’進行回交，獲得BC₁F₁種子，育苗后利用正向選擇標記RfC10ID161和負向選擇標記RfC10ID14、RfC10ID35進行重組單株選擇，篩選出52個在目標基因組DNA片段一側同源重組的單株，即RfC10ID161檢出與‘金恢3號’相同帶型，且RfC10ID14或RfC10ID35檢出與‘華占’相同帶型，并利用水稻全基因組育種芯片RICE6K(CN102747138A)對其進行背景選擇(Yu等, Plant Biotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在篩選出的52個單側同源重組單株中比較芯片結果，選擇背景回復最好的重組單株(此世代背景回復值超過75％)，使其與輪回親本‘華占’再次進行回交，獲得BC₂F₁種子，育苗后利用正向選擇標記RfC10ID161對其進行檢測，選擇含有目標基因組DNA片段的重組單株，即RfC10ID161檢出與‘金恢3號’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE6K對其進行背景選擇。

選擇背景回復較好的單株(此世代背景回復值超過87.5％)，使其與輪回親本‘華占’又一次進行回交，獲得BC₃F₁種子，育苗后利用正向選擇標記RfC10ID161和負向標記RfC10ID14、RfC10ID35對收獲的種子進行目標基因組DNA片段另一側同源重組片段的篩選，獲得6個在目標片段兩側重組的單株，即RfC10ID161檢出與‘金恢3號’相同帶型，且RfC10ID14和RfC10ID35檢出與‘華占’相同帶型。

利用水稻全基因組育種芯片RICE60K(WO/2014/121419)對上述6個雙側交換單株進行背景和目標片段選擇(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，篩選到導入目標片段較小，且背景回復好的目標單株一個(此世代背景回復值超過93.75％)。

將選中的單株自交一次，獲得BC₃F₂，育苗后利用正向選擇標記RfC10ID161對其進行檢測，選擇含有目標基因組DNA片段的單株，即RfC10ID161檢出與‘金恢3號’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對其進行背景選擇。

最終獲得目標片段純合，且背景回復(背景回復值超過99％)的株系一個，命名為CR033207。芯片檢測結果見圖1。

實施例2導入Rf-1基因組片段后同源重組片段的確定

為了確定導入的稻瘟病抗性基因組片段大小，對‘華占’導入片段的純合單株進行了目標基因組片段兩側同源重組片段的測序。將CR033207所含的Rf-1基因組重組核酸片段命名為RecCR033207。

通過水稻全基因組育種芯片RICE60K檢測結果初步確定，RecCR033207位于兩個SNP標記R1018818936GT和F1019055956AG 之間。

同時，使用Miseq測序技術對‘華占’、‘金恢3號’和CR033207三個樣本進行全基因組測序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)試劑盒進行文庫建立，使用Library Quantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進行定量，使用MiSeq V2 Reagent Kit(illumina)試劑盒進行測序反應。使用Miseq臺式測序儀(illumina)進行檢測。具體步驟及方法參見各試劑盒及測序儀使用說明書。

根據前述SNP芯片及Miseq測序結果，將RecCR033207上游同源重組片段定位在第10染色體的18825087bp到18827848bp區間，下游同源重組片段定位于19055027bp到19056459bp區間。

在此基礎上，參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載對應區段DNA序列。使用Primer Premier 5.0軟件設計擴增及測序引物，設計要求為引物長22nt左右、GC含量40-60％且沒有錯配。

以受體親本‘華占’和供體親本‘金恢3號’為對照，對RecCR033207上游和下游同源重組片段分別設計擴增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)進行擴增，使用兩步法或三步法尋找最佳擴增條件，確保擴增產物在瓊脂糖凝膠電泳檢測中顯示為單一明亮條帶。其中確定的上游同源重組片段擴增引物反應條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃180sec，37個循環；20℃1min。下游同源重組片段擴增引物反應條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃180sec，37個循環；20℃1min。由此，最終各篩選出一對擴增引物用于上游和下游同源重組片段的擴增。

另外，以擴增產物為模板，利用Sanger測序法進行測序，根據實際測序效果，最終各篩選出3條和4條測序引物分別用于上游和下游同源重組片段的測序。具體的擴增引物及測序引物序列見表2，測序結果見圖2和圖3。

RecCR033207上游同源重組片段測序長度為1190bp(SEQ ID NO:1)。1-224bp為受體‘華占’的基因組區段，與供體‘金恢3號’比較，存在3個SNP,1個Indel。225-366bp這一142bp區段為同源重組區段。367-1190bp為供體‘金恢3號’基因組片段，與‘華占’比 較，存在4個SNP。

RecCR033207下游同源重組片段測序長度為1035bp(SEQ ID NO:2)。1-339bp為供體‘金恢3號’的基因組區段，與‘華占’比較，存在8個SNP。340-606bp這一267bp區段為同源重組區段。607-1035bp為受體‘華占’的基因組區段，與供體‘金恢3號’比較，存在5個SNP。

圖4為RecCR033207兩側同源重組片段的結構圖。其中，(A)為上游同源重組片段結構圖；(B)為下游同源重組片段結構圖。上方堿基為供體‘金恢3號’的SNP或InDel標記，下方堿基為受體‘華占’的SNP或InDel標記。灰色區段為來源于‘華占’基因組區段，黑色區段為來源于‘金恢3號’基因組區段，白色區段為同源重組區段。橫坐標為片段長度，以堿基對數目(bp)為單位。

表2 Rf-1基因組重組核酸片段擴增及測序引物信息

實施例3‘華占’導入Rf-1基因組片段后育性恢復鑒定

在水稻三系雜交系統中，不育系的細胞質會導致雜交F1代花粉不育，當恢復系中存在對應的恢復基因時，可使雜交F1代育性恢復、正常結實。CR033208與原品系‘華占’需要與相應的不育系‘金農2A’進行測配，觀察雜交F1代育性，來測試兩者育性恢復能力的差異。

1、雜交種子制備

2014年冬季在海南進行材料的種植，其中父本為改良品系 CR033207和原品系‘華占’，測配母本為‘金農2A’。父本抽穗期間，母本選取盛花期植株，剪去已經開過的穎花，將已經成熟未開放的穎花噴水后逐粒剪去上部1/3的穎殼，不傷及柱頭，套上紙袋。次日上午水稻盛花時段，剪取父本盛花的稻穗，從套袋頂端開口伸到母本稻穗的上方，充分抖粉，隨后將套袋上口折合，注明父本編號和日期。20天后收獲種子，完成兩個測配組合金農2A/CR033207和金農2A/華占F1代的制備，每個組合收獲100粒左右種子。

2、F1代種植

2015年夏季在武漢種植F1代，上述兩個F1代雜交種分別種植24株，單株插秧，株距20cm，行距20cm，中間留走道40cm，常規栽培管理。

3、花粉育性考察

抽穗階段，每個組合F1代取5株，每株1穗。在穗上、中、下部各取成熟穎花1～2朵，每朵穎花剝取2～3枚花藥，用鑷子將花藥在玻片上搗碎，用1％I2-KI溶液染色后，置于100倍顯微鏡下觀察花粉形態和染色程度。

I₂-KI染色鏡檢結果見附圖5，(A)為測配組合金農2A/CR033207花粉I₂-KI溶液染色；(B)為測配組合金農2A/華占花粉I₂-KI溶液染色。圖中，黑色為被I₂-KI溶液完全染色，為可育花粉；灰色為被I₂-KI溶液不完全染色，屬染敗類型，為不育花粉；透明為未被I2-KI溶液染色，屬圓敗類型，為不育花粉。以可育花粉數/總花粉數×100％表示花粉育性，取5株平均值，考察結果見表3。

結果顯示，測配組合金農2A/CR033207花粉數目明顯多于測配組合金農2A/華占，且前者的花粉育性明顯高于后者，表明F1代育性得到恢復。

4、自然結實率考察

每個組合F1代灌漿結實20天后，各取5株，每株1穗，考察稻穗的自然結實情況，以結實粒數/穗總粒數×100％表示自然結實率，取5株平均值，考察結果見表3。結果顯示測配組合金農2A/CR033207自然結實率較測配組合金農2A/華占大幅提高，F1代育性得到恢復。

表3 F₁代花粉育性及自然結實率考察結果

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本申請作了詳盡的描述，但在本申請基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本申請精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本申請要求保護的范圍。