一種新型核酸熒光定量檢測方法與流程

本發明涉及生物醫學和分子生物學領域，具體地說，涉及一種新型核酸熒光定量檢測方法。
背景技術：
：熒光定量PCR技術自問世以來，就因為其高靈敏性，高特異性和高精確性的特點，已被廣泛應用于微生物病原體測定、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因表達、突變及其多態性等多個研究領域。熒光定量PCR技術的化學原理包括探針類和非探針類兩種。探針類技術主要包括Taqman探針法、分子信標法，兩者都是利用與靶序列特異雜交的探針所產生的熒光信號，來實現熒光定量檢測。非探針類主要包括Sybgreen法，Lux熒光法，兩者是利用熒光染料或者發夾結構引物而實現了熒光定量檢測。探針類技術由于在擴增過程中增加了探針的識別步驟，特異性更高。因此，探針法已經成為熒光定量PCR檢測的主流技術。但是，由于探針的設計非常復雜，同時要求探針必須有一定的長度和較高的退火溫度。這無疑增加了探針的設計難度和選擇區域，特別是在高突變的靶序列上，很難有效地開展探針設計。而非探針類技術由于只需要設計上下游引物就能開展熒光定量檢測，設計簡單易行而受到研究人員的喜愛。但是，由于非探針類技術使用的熒光染料或發夾結構引物，會導致非特異性結果或檢測結果穩定性差，這也直接導致了非探針類技術在醫學檢測領域應用受到限制。技術實現要素：本發明的目的是提供一種新型核酸熒光定量檢測方法，與常用Taqman探針法、分子信標法、LUX等方法相比，無需設計熒光探針，只需上下游引物就能高效地完成熒光定量擴增檢測。本發明的另一目的是提供一種新型核酸熒光定量擴增檢測系統。本發明的構思如下：將上游引物5’端標記上熒光基團或淬滅基團，下游引物5’端標記上淬滅基團或熒光基團，然后進行PCR、RT-PCR擴增或進行其他形式的核酸擴增。由于上下游引物每完成一次擴增后，就會在擴增片段的兩側分別帶有熒光基團和淬滅基團，就會產生熒光基團的淬滅。通過熒光基團淬滅，來完成對PCR過程進行實時定量檢測。由于在PCR擴增的指數時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數存在線性關系，所以成為定量的依據。該發明與探針法相比，不需額外設計復雜的熒光探針，只需上下游引物就能高效的完成熒光定量擴增檢測。(圖1)為了實現本發明目的，本發明提供一種新型核酸熒光定量檢測方法，在核酸(包括DNA和RNA)熒光定量擴增檢測系統中，設置一對或多對上下游引物，每對引物的上游引物序列和下游引物序列的5’端分別標記熒光基團和淬滅基團，或者每對引物的上游引物序列和下游引物序列的5’端分別標記淬滅基團和熒光基團；每完成一次擴增后，就會在擴增產物的兩端分別帶有熒光基團和淬滅基團，通過熒光基團淬滅，來對PCR反應過程進行實時定量檢測。本發明所述熒光基團選自FAM、Alexa546、CY5、ROX、JOE、HEX、TET等，所述淬滅基團選自TAMARA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、Eclipse等。優選地，本發明所述上游引物序列和下游引物序列的長度為10-30個堿基，擴增產物的長度為30-90個堿基。本發明所述核酸熒光定量擴增檢測系統包括PCR、RT-PCR、等溫擴增等常見的核酸擴增體系。本發明所述核酸熒光定量擴增檢測系統可以是單色熒光擴增，或者多色熒光同步擴增。本發明還提供一種新型核酸熒光定量擴增檢測系統，所述檢測系統包含一對或多對上下游引物，每對引物的上游引物序列和下游引物序列的5’端分別標記熒光基團和淬滅基團，或者每對引物的上游引物序列和下游引物序列的5’端分別標記淬滅基團和熒光基團。可將本發明的核酸熒光定量擴增檢測系統用于病原微生物、腫瘤檢測、遺傳疾病檢測、檢驗檢疫等多個領域的定性和定量檢測。本發明與探針法(Taqman探針法、分子信標法等)相比，無需額外設計復雜的熒光探針，給熒光定量PCR的設計和檢測帶來巨大便利。同時，由于沒有熒光探針對PCR的擴增干擾，將極大的提高熒光定量PCR的檢測靈敏度。也降低了多色熒光定量檢測的互相干擾。本發明與非探針法相比，避免了由于添加熒光染料而導致的非特異結果。也解決了Lux熒光法的，由于復雜的發夾結構引物設計，而帶來的檢測結果不穩定等問題。因此，本發明既有探針類技術的高特異性，又具有非探針類技術的設計簡便性。本發明從根本上解決了現有熒光探針定量PCR技術存在的設計復雜、成本高等缺陷問題。本發明提供的新型核酸熒光定量擴增檢測系統具有設計簡單、檢測靈敏度高，特異性強，穩定性好等優點。與目前主流的探針法和非探針法熒光定量檢測技術相比，本發明成本更加低廉，設計簡單易行，擴增效率更高，可廣泛應用于醫學、遺傳、檢驗檢疫等多個領域。附圖說明圖1為本發明核酸熒光定量擴增檢測系統的工作原理。圖2為本發明實施例1中檢測HBV國家參考品的結果。圖3為本發明實施例1中檢測HBV國家參考品的檢測濃度及其理論濃度的擬合曲線。圖4為本發明實施例1中對4種濃度HBV陽性血清樣本的重復性測試檢測結果。圖5為本發明實施例2中對三種病毒血清樣本的多重PCR檢測結果；其中，A為HBV檢測結果，B為HCV檢測結果，C為HIV檢測結果。具體實施方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。實施例1乙型肝炎病毒的熒光定量PCR檢測1、病毒核酸樣本的制備使用東北制藥集團遼寧生物醫藥有限公司生產的“核酸提取試劑盒(磁珠法)，備案號：遼本械備20160001”進行乙肝病毒核酸的提取和純化工作。具體操作參照產品說明書進行。2、PCR反應液的配制按照表1完成PCR反應液組份的配制。然后在每個PCR反應管中分裝40μlPCR反應液。表110×Buffer5.0μldNTPs(含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP，每種組份各2mM)4.0μl熱啟動TaqDNA聚合酶(5U/μl)1.0μlUNG酶(1U/μl)0.2μl上游引物HBV-For(20μm，5’端標記FAM)0.5μl下游引物HBV-Rev(20μm，5’端標記BHQ-1)0.5μl去RNase水28.8μl其中，上游引物HBV-For、下游引物HBV-Rev的序列分別為:HBV-For：5’-ACCTCTCTTTACGCGGTCTCC-3’；HBV-Rev：5’-TGCACACGGTCCGGCAGATGAG-3’，擴增產物大小為56bp。3、加樣和檢測向含有PCR反應液的PCR反應管中，加入提取的病毒核酸樣本10μl，蓋緊管蓋，置于熒光定量PCR儀上進行擴增檢測。擴增程序見表2。表2一、國家參考品檢測以中國食品藥品檢定研究院的“乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量參考品(L0-L6)”為待測樣本，采用上述方法進行檢測。最后分析參考品的檢測值和理論值之間的雙對數線性關系。要求雙對數線性關系(R2)≥0.97視為符合。檢測結果見圖2、圖3和表.3，其理論濃度和檢測濃度的雙對數曲線線性相關系數(R2)為0.999，表明本發明的新定量方法準確可靠，定量結果可以準確溯源到國家參考品。表3參考品質量標準(IU/ml)理論濃度對數值實際檢測值檢測濃度對數值L0(0.7762～6.165)E+088.3421.73E+088.24L1(0.1479～1.175)E+087.6193.68E+077.566L2(0.1585～1.259)E+076.6494.55E+066.658L3(0.1659～1.318)E+065.6724.34E+055.637L4(0.1820～1.479)E+054.7153.72E+044.571L5(0.1514～1.230)E+043.6364.45E+033.648L6(0.3890～3.090)E+022.0431.37E+022.137二、樣本重復性檢測以東北制藥集團遼寧生物醫藥有限公司生產的“乙型肝炎病毒(HBV)核酸(DNA)檢測試劑盒(熒光探針法)”標定的HBV陽性血清為初始樣本，用陰性血清將其稀釋成為1.0E+06、1.0E+05、1.0E+04和1.0E+03IU/ml四個梯度樣本。每個樣本重復三次，最后計算Ct值變異系數。結果如圖4所示。Ct值的變異系數分別為0.34％、0.41％、0.38％和0.46％，變異系數均控制在1％以內，表明利用本發明方法檢測血清樣本的重復性和精密度很好。實施例2多重熒光定量RT-PCR檢測1、病毒核酸樣本的制備使用東北制藥集團遼寧生物醫藥有限公司生產的“核酸提取試劑盒(磁珠法)，備案號：遼本械備20160001”進行病毒核酸的提取和純化工作。具體操作參照產品說明書進行。2、RT-PCR反應液的配制按照表.4完成RT-PCR反應液組份的配制。然后在每個PCR反應管中分裝40μlRT-PCR反應液。表.45×Buffer10.0μldNTPs(含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP，每種組份各2mM)4.0μl熱啟動TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.6μlUNG酶(1U/μl)0.1μlM-MLV(200U/μl)0.6μlRNase抑制劑(40U/μl)0.2μl上游引物HBV-For(20μm，5’端標記FAM)0.3μl下游引物HBV-Rev(20μm，5’端標記BHQ-1)0.3μl上游引物HCV-For(20μm，5’端標記HEX)0.3μl下游引物HCV-Rev(20μm，5’端標記BHQ-1)0.3μl上游引物HIV-For(20μm，5’端標記Cy5)0.3μl下游引物HIV-Rev(20μm，5’端標記BHQ-1)0.3μl去RNase水22.7μl其中，上游引物HBV-For、下游引物HBV-Rev的序列分別為:HBV-For：5’-ACCTCTCTTTACGCGGTCTCC-3’；HBV-Rev：5’-TGCACACGGTCCGGCAGATGAG-3’，擴增產物大小為56bp。上游引物HCV-For、下游引物HCV-Rev的序列分別為：HCV-For：5’-AGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGG-3’；HCV-Rev：5’-TCTACGAGACCTCCCGGGGCAC-3’，擴增產物大小為76bp。上游引物HIV-For、下游引物HIV-Rev的序列分別為：HIV-For：5’-CTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGC-3’；HIV-Rev：5’-CAAGTTTATTGAGGCTTAAG-3’，擴增產物大小為58bp。3、加樣和檢測向含有RT-PCR反應液的PCR反應管中，加入提取的病毒核酸樣本10μl，蓋緊管蓋，置于熒光定量PCR儀上進行擴增檢測。擴增程序見表.5。表.5以東北制藥集團遼寧生物醫藥有限公司生產的“乙型肝炎病毒(HBV)核酸(DNA)檢測試劑盒(熒光探針法)”標定的HBV陽性血清(病毒濃度：1.0E+05IU/ml)與HIVWHO國際標準品(病毒濃度：1.85E+05IU/ml)和HCVWHO國際標準品(病毒濃度：1.55E+05IU/ml)進行混合，制備成混合病毒血清樣本S1。用陰性血清將混合病毒血清進行三個梯度稀釋，分別制備成樣本S2，S3和S4。然后采用上述方法進行檢測。最后各自分析病毒檢測值和理論值之間的雙對數線性關系。要求雙對數線性關系(R2)≥0.97視為符合。檢測結果見圖5和表.6，其HBV、HCV和HIV理論濃度和檢測濃度的雙對數曲線線性相關系數(R2)分別為0.990、0.998和0.997。表明本發明適合進行多重熒光定量檢測，檢測結果準確可靠。表.6雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。序列表<110>東北制藥集團遼寧生物醫藥有限公司<120>一種新型核酸熒光定量檢測方法<130>KHP171111087.7TQ<160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1acctctctttacgcggtctcc21<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tgcacacggtccggcagatgag22<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3acctctctttacgcggtctcc21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4tgcacacggtccggcagatgag22<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5agtagtgttgggtcgcgaaagg22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6tctacgagacctcccggggcac22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7ctgagcctgggagctctctggc22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8caagtttattgaggcttaag20當前第1頁1 2 3