一種稻瘟病抗性基因Piz?t功能特異性分子標記及其檢測方法和應用與流程

本發明屬于農業生物技術領域，特別涉及一種稻瘟病抗性基因Piz-t功能性分子標記Piz-t-InDel及其檢測方法與應用。

背景技術：

稻瘟病是危害水稻高產穩產最為嚴重的病害之一。當前生產中常用的化學防治雖在一定程度上可解決或減輕病害對水稻生產的影響，但農田長期用藥不僅對環境有污染作用，而且農藥殘留物還會影響到稻米的食用品質。長期的生產實踐表明，選育與利用抗病品種是防治稻瘟病最為安全有效的方法之一。然而由于稻瘟病菌生理小種致病性有頻繁變異的特性，這會導致抗性單一的品種會在種植后3-5年時間里逐漸喪失抗性(殷得所等，2011)；因此，挖掘和應用抗性基因是獲得持久、廣譜抗病品種的重要途徑。早期的抗性基因鑒定方法主要是接種鑒定，但常規的接種鑒定方法不能準確地反映出抗病基因型，難以滿足抗病分子育種的要求。隨著水稻抗病分子遺傳學的發展，很多抗性基因被精細定位或克隆(Su et al.2015)；隨著分子標記的發展及應用，其逐漸適用于抗性基因遺傳背景的鑒定以及多抗病基因聚合育種的發展(Hittalmani et al.2000；Jena and Mackill,2008)。

但在已克隆的抗性基因中，一些重要的抗病基因位于同一位點,如Pik和Pi2/Pi9位點上的復等位基因之間、功能型序列與非功能型之間序列高度同源，一般的連鎖標記仍然難以準確甄別各種材料的功能抗病基因(Qu et al.2006；Zhou et al.2006；Ashikawa et al.2008；Takahashi et al.2010；Yuan et al.2011；Zhai et al.2011；Yuan et al.2011；Hua et al.2012；Ma et al.2015；Tian et al.2016)。因此，直接分析功能等位基因本身的序列并開發其功能特異性的分子標記來對目標基因進行選擇，不僅選擇可靠性高，還會大大加快了育種步伐。

到目前為止，至少有六個稻瘟病抗性基因(Piz-t、Pi2、Pi9、Piz、Pigm、Pi50)已經被定位在水稻第6染色體短臂端的Pi2/Pi9基因簇內(Jiang etal.2012)，其中Piz-t、Pi2、Pi9和Pi50等已經被成功克隆(Qu et al.2006,Zhou et al.2006)。研究表明，該位點的功能基因多具有廣譜高抗的特性，其中Piz-t與水稻葉瘟抗性相關，對國內外多個稻瘟病小種表現出較強的葉瘟抗性。華麗霞等(2015)開發出了Piz-t的顯性標記，該標記在抗性育種工作中容易發生錯選或漏選的情況。為了能更準確有效地將稻瘟病廣譜抗性基因Piz-t應用到水稻抗性育種工作中，有必要開發出該基因的特異性功能標記。鑒于前期我們已開發出Pi2和Pi9功能標記(楊立明等,2014；2015),本研究將著重于分型Piz-t與Pi2/Pi9位點其它功能基因及等位非功能基因的特異性標記。

技術實現要素：

解決的技術問題：為了克服現有技術的不足與缺點，本發明的首要目的在于提供一種稻瘟病抗性基因Piz-t基因功能特異性分子標記Piz-t-InDel。

本發明的另一發明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Piz-t基因特異性分子標記Piz-t-InDel的檢測方法。

本發明的再一發明目的在于提供所述的稻瘟病抗性基因Piz-t基因功能特異性分子標記Piz-t-InDel的應用。

技術方案：一種稻瘟病抗性基因Piz-t功能特異性分子標記，所述分子標記是通過引物對SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2從水稻基因組DNA中擴增出與稻瘟病抗性基因Piz-t呈特異性帶型的分子標記，所述引物對序列為：

SEQ ID NO.1Fl：5’-TTACTAGAATCGCTCCAT-3’；

SEQ ID NO.2Rl：5’-ACTGCGTGCGACTTGA-3’。

所述與稻瘟病抗性基因Piz-t呈特異性帶型的分子標記的序列如SEQ ID NO.3所示。

檢測所述稻瘟病抗性基因Piz-t的功能特異性分子標記的方法，通過比對多個水稻稻瘟病抗性基因Piz-t的等位基因序列,包含以下步驟:(1)從公共數據庫中下載得到的Piz-t及其同源的基因組序列，以及測序品種日本晴相對應區域的基因組序列，針對Piz-t位點進行序列比對，篩查Piz-t特異的、能區別于該位點其他稻瘟病等位抗性基因的插入/缺失(insertion-deletion,InDel)位點；(2)利用步驟(1)獲得的InDel信息，根據InDel標記的設計原理，在所述InDel位點處上下游處設計基因特異性引物，引物對堿基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；(3)以攜帶有稻瘟病抗性基因Piz-t的稻瘟病抗性品種IRBLZT-T的總DNA為模板，進行PCR擴增，所獲得的PCR產物即為稻瘟病抗性基因Piz-t基因特異性分子標記Piz-t-InDel。

上述稻瘟病抗性基因Piz-t基因特異性分子標記在鑒別水稻品種稻瘟病抗性基因中的應用。

上述稻瘟病抗性基因Piz-t基因特異性分子標記在鑒別Pi2/Pi9基因簇區域不同的稻瘟病抗性基因中的應用。

一種鑒別水稻品種稻瘟病抗性基因的試劑盒，含有核酸序列如SEQ ID NO.3所示的分子標記，以及如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的引物對。

本發明的原理:InDel是指在近緣種或同一物種不同個體之間基因組同一位點的序列發生了不同大小核苷酸片段的插入或缺失，即一個序列上某一位點相比同源的另一個序列插入或缺失了一個或多個堿基(Weber et al,2002)。InDel標記基于PCR擴增技術，本質上屬于長度多態性標記(Hyten et al,2010)。InDel標記穩定性好、多態性高、分型系統簡單(Jander et al,2002)；與分型系統復雜的SNP標記相比，InDel檢測更加簡單便捷，對儀器設備和技術要求較低，在電泳技術平臺上即可進行。目前已開始應用于動植物群體遺傳分析、分子輔助育種以及人類法醫遺傳學、醫學診斷等領域。本發明通過多序列比對的方法尋找Piz-t基因序列上出現的InDel，由于這個InDel在Piz-t與Pi2/Pi9的其它功能/非功能基因有27bp的差異，因此很容易將Piz-t從中區分出來。本發明據此設計引物對F1/R1，通過常規PCR擴增，在聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測時，以不同大小的片斷得以呈現。

有益效果:(1)本發明提供的分子標記特異性高:Piz-t所在的基因組區域存在著包括Piz-t在內的多個具有抗性基因特征的候選基因，這些候選基因在序列上高度同源；此外，Piz-t與該位點上已經克隆的稻瘟病抗性基因在堿基序列上高度一致。本發明提供的分子標記是本發明發明人經過不斷的進行序列多態性搜查并通過實驗驗證得到的，能明顯地將Piz-t與存在于該基因組區域內與Piz-t高度同源的旁系同源基因進行區分。

(2)本發明提供的分子標記在實際應用中，低成本、高通量:目前大多是利用電泳平臺進行分型,該分型平臺快捷經濟，不需要復雜的實驗設備，可操作性強。電泳分型平臺有瓊脂糖凝膠電泳、變性或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳以及毛細管電泳。本發明提供的分子標記只需PCR結合瓊脂糖凝膠電泳或非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，成本低、通量高、加上特異性高(即準確度高)，特別適用于生產實踐中。

(3)本發明是第一個針對Piz-t基因內部序列所開發的Piz-t基因特異性InDel標記。本發明能通過電泳檢測的方法成功地將Piz-t與定位在該位點上的其它稻瘟病抗性基因區分開，到目前為止，還沒有有關這類標記的報道。本發明所提供的Piz-t特異性分子標記Piz-t-InDel是一個共顯性標記，在實際應用過程中其可靠性及準確性優于顯性標記。本發明可應用于Piz-t的種質資源篩選、轉基因鑒定和基因聚合以及基于MAS技術的水稻抗性育種工作中。該標記存在于Piz-t基因內部，因此對Piz-t的篩選能力理論值可達100％，其綜合性能優于已報道的與Piz-t連鎖的分子標記和功能標記。

(4)本發明提供的分子標記能簡便地應用于遺傳背景不同的群體中。現有的與Piz-t連鎖的分子標記大部分都是針對同一個群體2個不同親本的序列多態性所開發的，這些標記在其它群體中的適用性有限。華麗霞等(2015)等開發的功能標記，不僅鑒定過程比較繁瑣，而且還是顯性標記，不適應于大規模的種質資源鑒定及MAS育種中。本發明適用于任何遺傳背景下的轉基因育種，基因聚合以及基于MAS技術的抗性育種，無需重復進行親本多態性的篩選，大大提高了育種效率。

因此，本發明所提供的稻瘟病抗性基因Piz-t基因特異性分子標記具有重要的應用價值，利用此標記可以提高該基因在種質資源篩選、分子標記輔助選擇育種、基因聚合育種，以及轉基因育種中利用的效率。

附圖說明

圖1是Piz-t基因特異性分子標記Piz-t-InDel在Pi2/Pi9基因簇區域不同稻瘟病抗性基因及日本晴、9311的驗證結果圖，其中:泳道DL500為DNA ladder,泳道的DNA模板依次為IRBLzt-T(Piz-t)、IR65482-4-136-2-2、谷梅2號、谷梅4、二八占、Fukunishiki。

圖2是Piz-t基因特異性分子標記Piz-t-InDel在其它水稻品種中的驗證結果圖，其中:泳道DL500為DNA ladder，泳道1-13的DNA模板依次為IRBLzt-T(Piz-t)、矮洋稻、遼粳5號、TQ155、Masoli、BG1100、TRAT、5011、培矮64、9311、楊恢136-4、中農青、34重慶恢。

具體實施方式

一種稻瘟病抗性基因Piz-t基因功能特異性分子標記Piz-t-InDel，是通過引物對SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2從水稻基因組DNA中擴增出與稻瘟病抗性基因Piz-t呈特異性帶型的分子標記；SEQ ID NO.1(5’-3’):TTACTAGAATCGCTCCAT；SEQ ID NO.2(5’-3’)：ACTGCGTGCGACTTGA；

所述的水稻品種為IRBLzt-T(Piz-t供體親本)；

所述的稻瘟病抗性基因Piz-t包括編碼NBS-LRR類蛋白的基因片段I，序列如下所示

SEQ ID NO.3:

TTACTGGAATCGCTCCATTTTCGTATTTGAAAATATTTGATTATGTTTTTTATGTGGGGTTTCTGATTCCAATTAAAAAAA-TGAAAATAAAAATGGTATGATGGTTTCCGTTCGTTATGCATGCGCGGAACAATGGATCTCACTAATCAAGTAGCACGCAGT

所述的稻瘟病抗性基因Piz-t的功能特異性分子標記Piz-t-InDel的檢測方法，通過比對多個水稻稻瘟病抗性基因Piz-t的等位基因序列，包含以下步驟:(1)從公共數據庫中下載得到的Piz-t及其同源的基因組序列Pi50以及測序品種日本晴(Nipponbare)相對應區域的基因組序列，針對NBS_1～9-Piz-t位點進行序列比對，篩查Piz-t特異的、能區別于該位點其他稻瘟病等位抗性基因的插入/缺失(insertion-deletion,InDel)位點。(2)利用步驟(1)獲得的InDel信息，根據InDel標記的設計原理，在所述InDel位點處上下游100-200bp處設計基因特異性引物，利用引物對擴增IRBLz-FU(Piz)、谷梅4(Pigm(t))、二八占(Pi50(t))、谷梅2(P26(t))、IR65482-4-136-2-2(Pi40(t))、日本晴和9311，測序比對，直至在NBS2-Piz-t篩選到能明顯區分出Piz-t引物對，堿基序列如下:Fl:5’-TTACTAGAATCGCTCCAT-3’；Rl:5’-ACTGCGTGCGACTTGA-3’；(3)以攜帶有稻瘟病抗性基因Piz-t的稻瘟病抗性品種IRBLzt-T的總DNA為模板，進行PCR擴增，所獲得的PCR產物即為稻瘟病抗性基因Piz-t基因特異性分子標記Piz-t-InDel。

稻瘟病抗性基因Piz-t基因特異性分子標記Piz-t-InDel在鑒別水稻品種稻瘟病抗性基因的應用，特別適合于在鑒別Pi2/Pi9基因簇區域不同的稻瘟病抗性基因的應用；優選包含如下步驟:(1)擴增:利用引物Fl和Rl對待檢測的水稻品種的基因組進行PCR；(2)檢測:利用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，若檢測到分子量大小為163bp的核苷酸片段，則攜帶有稻瘟病抗性基因Piz-t；若檢測到分子量大小為190bp，則待檢測的水稻品種不攜帶Piz-t位點的功能基因。

下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。

實施例1

稻瘟病抗性基因Piz-t基因特異性分子標記及其引物設計與檢測:

(I)Piz-t插入/缺失(insertion-deletion，InDel)位點的分析:

從公共數據庫中下載得到Piz-t等水稻供體品種的部分基因組序列,針對NBS_1～9-Piz-t位點進行序列比對，篩查Piz-t特異的、能區別于該位點其他稻瘟病等位抗性基因的特異性插入/缺失(InDel)差異位點設計引物，擴增IRBLz-FU(Piz)、谷梅2(P26(t))、谷梅4(Pigm(t))、二八占(Pi50(t))、IR65482-4-136-2-2(Pi40(t))、日本晴，測序、比對結果下表所示:

其中，----即為鑒定到的Piz-t基因特異性缺失序列；

(2)設計引物:

根據InDel標記的設計原理，在所述InDel位點處上下游100-200bp處設計引物，引物對堿基序列如下所示:

Fl:5′-TTACTAGAATCGCTCCAT-3′；

Rl:5′-ACTGCGTGCGACTTGA-3′。

(3)選擇水稻代表品種:選擇攜帶有Piz-t基因以及Pi2/Pi9基因族等位基因的代表品種如下:

IRBLzt-T(Piz-t)、IR65482-4-136-2-2(Pi40(t))、谷梅2(P26(t))、谷梅4(Pigm(t))、二八占(Pi50(t))、Fukunishiki。

(4)PCR擴增，獲得含有Piz-t基因特異性InDel的片段

利用上述引物對Fl和R1，以上述水稻品種的總DNA為模板，進行常規PCR擴增后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，得到的結果如圖1所示。

擴增反應體系如下:

2x Reaction Mix:12.5μL

引物Fl(10μΜ):1μL

引物Rl(10μΜ):1μL

Golden DNA Polymerase:0.2μL

DNA模板(20-50ng/μL):1μL

ddH₂O:補足至25μL。

PCR溫度循環條件如下:94℃5分鐘；94℃30秒、63℃30秒、72℃30秒，35個循環；72℃7分鐘；10℃保存。

PCR反應結束后，取適量樣品在8％的聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳檢測，電泳條件為90V，1小時。

其中，圖1的泳道I為以Piz-t供體品種水稻品種IRBLzt-T基因組為模板PCR得到的片段，與稻瘟病抗性基因Piz-t呈特異性帶型，即泳道1為Piz-t基因特異性分子標記Piz-t-InDel。圖1的結果顯示，Piz-t基因特異性分子標記既能區分抗感等位基因，又能區分Pik位點上所鑒定到的其它抗性基因。也就是說，攜帶有Piz-t的水稻品種，其PCR擴增產物的電泳檢測條帶以163bp呈現，其它Pi2/Pi9基因族等位基因稻瘟病抗性基因及非功能基因以電泳檢測條帶190bp呈現。

實施例2

抗性基因Piz-t基因特異性分子標記在其它水稻品種中的檢測應用:

選擇13個代表性水稻品種，依次為:IRBLzt-T(Piz-t)、矮洋稻、遼粳5號、TQ155、Masoli、BG1100、TRAT、5011、培矮64、9311、楊恢136-4、中農青、34重慶恢。

分別提取其基因組DNA，并以此為模板，按照實施例1的方法，進行PCR擴增、酶切及電泳檢測。根據酶切產物(條帶)的大小，可以把抗性基因Piz-t與其他稻瘟病抗性基因區分開來。如圖2所示，在抗譜表型為Piz-t型的個體(攜帶有稻瘟病抗性基因Piz-t的抗病品種IRBLZT-T，泳道1的樣品)中能檢測到Piz-t-InDel基因特異性分子標記的存在，而其他抗譜表型的個體則以另外一種帶型呈現。可見，試驗結果與設計分析的相吻合，說明抗性基因Piz-t基因特異性分子標記可在鑒別Piz-t基因與其他Pi2/Pi9基因簇等位基因等方面得到應用。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 楊海軍

<120> 一種稻瘟病抗性基因Piz-t功能特異性分子標記及其應用

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

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ttactagaat cgctccat 18

<210> 2

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

actgcgtgcg acttga 16

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<211> 162

<212> DNA

<213> 人工序列

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<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

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<212> DNA

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