雙向信號擴增檢測miRNA的試劑盒及方法與流程

本發明涉及核酸檢測領域，更具體地，涉及一種雙向信號擴增檢測mirna的試劑盒及方法。

背景技術：

micrornas(mirnas)是存在于真核細胞中的一類短序列、非編碼、具有調控功能的單鏈小分子rna，長約18-24nt。mirnas通過與其靶mrna分子的3’端非編碼區(3’utr)互補結合，在翻譯水平上特異性抑制或沉默基因的表達，因此mirnas廣泛參與了生物體多種生理過程，如個體發育、細胞增殖、分化和凋亡、代謝與應激反應的調節，甚至疾病的發生，包括腫瘤形成。mirnas還參與了腫瘤細胞重要的生物程序調控，間接地起著促癌基因和抑癌基因的功能，在腫瘤的發生和發展中起了至關重要的作用，因此mirnas被視為腫瘤早期診斷、預后和治療的重要潛在生物標記物和靶標。

滾環擴增(rollingcircleamplification，rca)是借鑒自然界中環狀dna分子滾環式的擴增機制發展起來的一種信號放大的檢測方法。rca是一種等溫信號擴增方法，可在室溫下進行，使用兩個引物就可實現指數滾環擴增，可用于極微量生物標記物的檢測。

硫黃素t(thioflavint，tht)是一種商業化的水溶性苯并噻唑熒光染料，以前常用于淀粉體的檢測，近些年有研究發現，tht可專一性的與dna/rna的g-四聯體結合并顯著增強其熒光強度，而不能與dna/rna的其它結構(三聯體、二聯體和單鏈)結合，因此可以顯著降低檢測背景。

mirnas具有短序列、高同源、低含量和極易降解的特性，因此在生物醫學研究和早期臨床診斷方面急需高效，特異的mirnas檢測方法。

傳統的mirnas的檢測方法主要有northernblot，微陣列和實時定量pcr(real-timepcr)，這些檢測方法不僅需要使用大型昂貴的儀器設備，操作繁瑣，而且靈敏度低，特異差，因此很難普及。

技術實現要素：

本發明的目的是克服現有技術中的上述缺陷，提供一種操作簡單、靈敏度高、特異性好和成本低的雙向信號擴增特異性檢測循環microrna的方法。

為了實現上述目的，本發明提供一種雙向信號擴增檢測mirna的試劑盒，該試劑盒包括：

(1)第一發卡結構dna探針，所述第一發卡結構dna探針能夠與所述mirna堿基配對，從而打開發卡結構；

(2)第二發卡結構dna探針，所述第二發卡結構dna能夠與mirna競爭結合所述第一發卡結構dna探針，從而釋放mirna，并且，所述第二發卡結構dna探針與所述第一發卡結構dna探針形成的dna復合體具有至少一個粘性末端；

(3)環狀dna探針，所述環狀dna探針中的一段連續堿基與dna復合體的一個粘性末端互補，并且，所述環狀dna探針與所述dna復合體能夠通過滾環擴增得到含有多g重復序列的g四聯體擴增產物。

優選地，所述試劑盒還包括：(4)tht熒光染料。

根據本發明，所示粘性末端的長度優選為10-20nt。

所述tht熒光染料(thioflavint)的結構如式i所示。其合成方法已為本領域技術人員公知。也可商購獲得。

為便于檢測，所述第一發卡結構dna探針和所述第二發卡結構dna探針優選共同以檢測溶液1的形式提供。

其中，所述檢測溶液1中，所述第一發卡結構dna探針和所述第二發卡結構dna探針的濃度可根據需要確定，通常均為0.1μm-10μm。

所述檢測溶液1可以為tris-hcl緩沖液，也可以根據需要調整為其他緩沖溶液。

優選地，所述試劑盒還包括滾環擴增所需試劑。所述滾環擴增所需試劑為本領域技術人員公知，包括但不限于滾環擴增dna聚合酶、滾環擴增反應液、dntps。

為便于檢測，優選地，所述環狀dna探針與所述滾環擴增所需試劑共同以檢測溶液2的形式提供。

所述檢測溶液2中，所述環狀dna探針的濃度可以根據需要確定，優選為10nm-1000nm。

本發明的試劑盒用于mirna檢測基于以下原理，如圖1所示：

檢測體系包含兩步反應，當待檢測物靶標(target)存在的時候，target首先會與第一發卡結構dna探針(hp1)結合并將其展開，展開后的hp1會繼續與第二發卡結構dna探針(hp2)結合，將hp2展開的同時也會釋放target進入第一步反應的循環。由于形成的hp1和hp2復合體中有一段粘性末端與環狀dna探針互補，因此在dna聚合酶和dntps的作用下會進行滾環擴增(hp-rca)，產物是含有大量多g重復序列(與環狀dna完全互補)的g四聯體。最后將tht熒光染料加入該擴增體系中，通過熒光信號的強弱對比來判斷mirna含量的高低。在沒有待檢測物mir-21的時候，hp1將不會被打開，因此后續兩步反應將無法進行，檢測信號極弱。

根據本發明的上述原理，本領域技術人員可以根據特定的待測mirna，設計相應的第一發卡結構dna探針、第二發卡結構dna探針和環狀dna探針的核苷酸序列。

本發明提供一種優選實施方式，針對mirna21(seqidno：4)進行檢測，以證明本發明。但是本領域技術人員可以確認，本發明的檢測并不限于mir-21。

5’-uagcuuaucagacugauguuga-3’(seqidno：4)

具體地，針對所述mirna為mir-21的情況；所述第一發卡結構dna探針(hp1)具有seqidno：1所示的堿基序列；所述第二發卡結構dna探針(hp2)具有如seqidno：2所示的堿基序列；所述環狀dna探針(ct)具有seqidno：3所示的堿基序列。

5’-tcaacatcagtctgataagctacgatgtgtagatagcttatcagact-3’(seqidno：1)

5’-taagctatctacacatggtagcttatcagactccatgtgtagaggt-3’(seqidno：2)

5’-tacacaatctcgactagtcagaccctaaccctaaccctaaccctacaacatgtctttgatacctc-3’(seqidno：3)

其中，hp1和hp2中下劃線的堿基分別表示互補的序列，它們將分別形成發卡探針的互補區(莖區)。hp1中加粗的堿基(5’端起第1-22位)表示靶標mir-21的互補區。hp2中加粗的堿基(5’端起第1-32位)表示hp1的互補區。ct中加粗的堿基(5’端起第1-6位和第61-65位)表示hp2的互補區，下劃線的互補序列將形成g-四聯體，即結合和激活tht的互補區。

本發明還提供利用上述試劑盒檢測mirna的方法，該方法包括以下步驟：

(1)向待測體系中加入第一發卡結構dna探針和第二發卡結構dna探針，并孵育；

(2)加入環狀dna探針并進行滾環擴增；

(3)加入tht熒光染料進行檢測，所述tht熒光染料加入的時機為：加入環狀dna探針的同時，或滾環擴增完成以后。

所述孵育以mirna充分與第一發卡結構dna探針結合并被第二發卡結構dna探針充分競爭結合為目的，條件包括：25-40℃，1-5小時；例如37℃孵育2h。

所述滾環擴增的條件為本領域技術人員公知。

所述檢測的方法可以為酶標儀檢測。

具體地，本發明檢測mirna的試劑盒和方法如下：

試劑盒組成：

a)檢測溶液1：20mmtris-hcl緩沖液(100mmnacl,5mmmgcl2,ph7.4)，其中含發卡結構的dna探針hp1和hp2，濃度均為0.1μm-10μm。

b)檢測溶液2：rca反應液，其中含dna環狀探針10nm-1000nm，phi29dna聚合酶，dntps：0.5mm。

c)tht熒光染料。

檢測方法如下：

1)將含有mirna的溶液與檢測溶液1充分混勻后37℃孵育2小時。

2)將檢測溶液2和tht加入到上述反應液中，37℃孵育40分鐘，用酶標儀讀取熒光信號。

利用本發明的試劑盒和方法對mirnas進行測定，不需要任何化學修飾，沒有復雜的反應過程，也不需要昂貴的儀器，mirnas在該檢測體系中可循環使用，操作簡便，成本低，靈敏度高，特異性好。

本發明的其它特征和優點將在隨后具體實施方式部分予以詳細說明。

附圖說明

通過結合附圖對本發明示例性實施方式進行更詳細的描述。

圖1示出了本發明mirna檢測的原理。

圖2示出了根據本發明一種實施方式的第一步反應的20％非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳結果。

圖3示出了根據本發明一種實施方式的第二步反應的瓊脂糖凝膠電泳結果。

圖4a和圖4b示出了不同濃度mir-21存在時的熒光光譜和熒光強度。圖4a中曲線所代表的濃度自下而上依次為：0、0.1nm、0.2nm、0.4nm、0.6nm、0.8nm、1nm、1.5nm、2nm、2.5nm。

圖5分別示出了mir-21及mir-21的5種突變型(1個、2個、3個、4個和5個堿基錯配)相對于對照(不含mir-21)的熒光強度。

具體實施方式

下面將參照附圖更詳細地描述本發明的優選實施方式。

試劑盒組成：

a)檢測溶液1：20mmtris-hcl緩沖液(100mmnacl,5mmmgcl2,ph7.4)，其中含發卡結構的dna探針hp1和hp2，濃度均為1μm。

b)檢測溶液2：rca反應液，其中含dna環狀探針100nm，phi29dna聚合酶，dntps：0.5mm。

c)tht熒光染料。

檢測方法如下：

1)將含有mirna的溶液與檢測溶液1充分混勻后在37℃孵育2小時。

2)將檢測溶液2和tht加入到上述反應液中，37℃孵育40分鐘，用酶標儀讀取熒光信號。

測試例1

檢測不同條件下步驟1)的反應結果。

如圖2所示，當反應液中只含有mir-21(1)、hp1(2)、hp2(3)、mir-21+hp2(5)、hp1+hp2(6)的時候不能啟動第一步的反應，當反應液中含有mir-21+hp1(4)的時候只能啟動第一步的部分反應,只有當mir-21+hp1+hp2(7)的時候才能完全啟動第一步的反應。這些實驗結果與圖1所示檢測原理相符，有力的證明了本發明方法的可行性。

測試例2

檢測不同條件下步驟2)的反應結果。

如圖3所示，當該反應體系中無靶標mir-21的時候，該體系不能進行hp-rca反應(左邊)，當該反應體系含靶標mir-21的時候才能進行hp-rca反應(右邊)，這一現象與該體系的檢測原理相符，又進一步證明了該技術方案的可行性。

測試例3

測試不同濃度mir-21存在時的熒光光譜和熒光強度。

如圖4a所示，隨著mir-21濃度的升高(0.1nm-1.5nm)，相應的熒光強度逐漸增大。mir-21的濃度在0.1nm-1nm的熒光強度可以做出標準校準曲線圖4b，該線性回歸方程為fl強度(λex485nm)＝88.382[cmir21]+41.031(線性相關系數r＝0.9942)，通過計算得出該方法對mir-21的檢測限為10pm，說明本發明方法的靈敏度極高。

測試例4

測試mir-21及mir-21的5種突變型(1個、2個、3個、4個和5個堿基錯配)相對于對照(不含mir-21)的熒光強度。

突變序列如下，其中，下劃線的堿基表示mir-21的突變位點。

突變mir-21-1(m1)：

5’-uagcuuaucagaccgauguuga-3’(seqidno：5)

突變mir-21-2(m2)：

5’-uagcauaucagaccgauguuga-3’(seqidno：6)

突變mir-21-3(m3)：

5’-uagcaaaucagaccgauguuga-3’(seqidno：7)

突變mir-21-4(m4)：

5’-aagcaaaucagaccgauguuga-3’(seqidno：8)

突變mir-21-5(m5)：

5’-aagcaaaucagaccgaugucga-3’(seqidno：9)

如圖5所示，m1、m2、m3、m4和m5的相對熒光強度分別是mir-21相對熒光強度的10.2％、0.5％、-0.5％、-2％和-4.4％。這一實驗證明了本發明方法的特異性極高。

測試例5

在含有10％的正常人血清條件下比較本發明和標準的mirnas檢測方法(熒光實時定量pcr，qrt-pcr)，3次平行實驗。結果如表1所示。

表1

^bd三次獨立的實驗測得的值

^c平均復原率(％)＝100×(c平均計算值/c實際加入值)

如表1所示，相比于標準mirnas檢測方法(qrt-pcr)而言，當該檢測體系中含有10％的正常人血清時并不影響其檢測結果，這一現象表明該技術方案可以在復雜的生物樣本(血清)中進行mirnas的檢測，具有非常好的應用前景和實用價值。并且，根據實際加入值與平均計算值的比對可見，本發明的檢測方法更準確。

以上已經描述了本發明的各實施例，上述說明是示例性的，并非窮盡性的，并且也不限于所披露的各實施例。在不偏離所說明的各實施例的范圍和精神的情況下，對于本技術領域的普通技術人員來說許多修改和變更都是顯而易見的。

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<110>清華大學深圳研究生院

<120>雙向信號擴增檢測mirna的試劑盒及方法

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