本發明屬于核酸分析與檢測領域，具體涉及一種核酸擴增產物的可視化檢測方法。
背景技術：
核酸擴增技術在當今的分析檢測領域具有十分重要的意義。食品安全檢測、環境監控、醫療診斷、法醫鑒定等領域無不依賴于核酸擴增技術。最早也是最經典的核酸擴增技術是在耐熱性聚合酶的作用下，依靠溫度的不斷循環交替而實現模板變性、引物退火及延伸從而實現目標產物的大量積累，這種技術被稱作聚合酶鏈式反應(pcr)。然而，pcr最大的缺陷也就在于，其不斷的溫度變化過程對儀器(pcr儀)提出了相對高的要求，并進而限制了其擴增速率。恒溫擴增的出現徹底擺脫了對精密溫控設備的依賴，僅僅一個熱塊、一臺水浴鍋甚至一只保溫效果良好的保溫瓶、熱水瓶等即可滿足反應需求。常見的恒溫擴增技術包括：環介導等溫擴增(lamp)、重組聚合酶擴增(rpa)、鏈置換擴增(sda)、依賴解旋酶的擴增(hda)、切口酶介導的擴增反應(near)等等。恒溫擴增的出現為現場快速檢測提供了十分大的便利。
然而，一個重要問題仍然限制核酸擴增現場快速檢測，即對擴增產物的快速特異性檢測。鈣黃綠素通常用于核酸恒溫擴增產物的可視化檢測，但是常用的方法是在核酸擴增液中添加mn2+猝滅鈣黃綠素的熒光。隨著核酸擴增的進行，釋放大量的焦磷酸鹽的時候，焦磷酸鹽由于與mn2+的結合作用更強，從而使鈣黃綠素脫離mn2+，熒光恢復。這種方法除了檢測結果不夠特異以外，mn2+的引入也會對擴增本身有較大的抑制作用。同時，對于擴增效率比較低的樣本其本身焦磷酸鹽產生的量就不多，因而鈣黃綠素的熒光恢復不明顯。同時由于反應本身產生的焦磷酸鹽并不會足夠多，所以對鈣黃綠素和mn2+的用量提出了嚴格的要求。
可視化試紙條用于核酸擴增檢測具有特異、方便、快速、結果可靠、成本低廉等優點。但是，利用試紙條對核酸擴增結果進行檢測通常需要較大體積(通常50-200μl)檢測液體，以便擴增分子在試紙條上順暢而快速的流動。但是在利用試紙條對核酸擴增結果進行檢測的過程中，往往有幾個方面的因素限制了擴增產物直接用于試紙條檢測，必須通過對擴增產物進行稀釋后才能用于試紙條檢測，如：(1)反應試劑體積的增大往往意味著反應成本驟增；(2)核酸擴增反應試劑中經常含有某些試劑(如peg，pva等)導致擴增體系的過于黏稠，影響樣品分子在試紙條上的涌動，造成檢測結果的不準確；(3)某些通過探針檢測的體系必須在反應后加入探針、緩沖溶液；(4)擴增產物量太大，超出所設計紙條的檢測范圍，造成鉤狀效應；等等。這些因素的存在都要求試紙條檢測過程中必須加入額外的試劑以保證檢測結果的準確性。然而在開蓋操作的情況下，擴增產物容易形成氣溶膠污染，影響后續檢測結果的準確性。針對此問題，目前有多種檢測裝置，發明人開發出了一種裝置(zl201520424418.5)，能夠在不開蓋的情況下實現對擴增產物的稀釋。
但是，依靠這些裝置，稀釋過程中樣品的混合均勻程度對檢測結果仍然有很大的影響，如果樣品沒有混合均勻將直接影響檢測結果的準確性。而如何判斷樣品是否混合均勻卻是一個難題。因此，本發明利用鈣黃綠素的熒光猝滅效果，結合核酸試紙條的檢測特異性，提出了一種利用鈣黃綠素檢測核酸擴增產物混合均勻程度的方法，進一步保障核酸試紙條檢測結果的準確性。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種核酸擴增的檢測方法，能在不開蓋的情況下監控試紙條檢測前樣品混勻程度，使采用試紙條檢測的結果更加準確。為此，本發明采用以下技術方案：
一種核酸擴增的檢測方法，其特征在于：
在第一pcr管加入反應擴增液，在第二pcr管加入鈣黃綠素和mno2納米材料，在第三pcr管加入焦磷酸鹽溶液；試紙條探針分別放置在第二pcr管和第三pcr管中，或者，在第一pcr管放入抗原修飾的引物；以具有三個接口的可視化核酸擴增檢測裝置作為蓋，將三個pcr管分別密封連到可視化核酸擴增檢測裝置的三個接口上，可視化核酸擴增檢測裝置的檢測室內預先裝好核酸檢測試紙條；
將密封好的裝置放在pcr儀或者金屬浴上進行擴增；
待擴增反應結束后，在不打開可視化核酸擴增檢測裝置的情況下，以可視化核酸擴增檢測裝置為連通器，對可視化核酸擴增檢測裝置和三個pcr管的連接體進行混勻操作，將反應擴增液，鈣黃綠素，mno2和焦磷酸鹽溶液混合，通過判斷混合液的顏色是否為黃綠色判斷混合均勻，然后再進行試紙條檢測核酸恒溫擴增結果。
由于第一pcr管中的擴增液中加入有二硫蘇糖醇dtt，能夠還原棕褐色的mno2,變成mn2+,使得溶液變成無色，但是第三pcr管中焦磷酸鹽的存在螯合生成的mn2+,使得鈣黃綠素熒光恢復，溶液呈現黃綠色。
試紙條檢測時，水平倒置裝置，使混合液流向逐漸流向試紙條，并在試紙條上出現紅色線條，指示檢測結果。
相比于傳統的利用鈣黃綠素進行核酸擴增產物的檢測方法，本發明雖然同樣可以采用鈣黃綠素進行判斷，方法卻有很大的差異。在本發明中，鈣黃綠素和mno2同時置于第二pcr管中，由于mno2具有很強的熒光猝滅作用，使得在擴增液與檢測液混合前僅第二pcr管為棕褐色，第一和第三pcr管溶液為無色。dtt是核酸擴增體系中經常使用的增強劑，也是強的還原劑，在核酸擴增體系中使用的濃度可以高達1-10mm。擴增結束后混勻的過程中，一旦具有氧化性質的mno2與還原性的dtt相遇即被還原成mn2+。盡管mn2+的存在仍然不能使鈣黃綠素熒光恢復，但是當我們在第三pcr管中添加過量的焦磷酸鹽時，焦磷酸鹽能夠充分螯合mn2+，從而使鈣黃綠素的熒光充分釋放。此外，由于mno2是一種很好的dna吸附劑，能夠有效而快速的吸附dna，使得吸附在mno2表面的探針dna可以在室溫條件下長期穩定保存。并且，當與擴增液混合時，mno2迅速捕獲周圍的產物dna，而當其被還原的過程中，被其捕獲到的dna由于空間距離的接近以及生成的mn2+屏蔽了dna之間的靜電斥力，從而可以有效地提高探針與產物之間的互補配對速率。相比于已經報道的鈣黃綠素法，這種方法并不要求精確控制鈣黃綠素的用量，而混合液中過量的焦磷酸鹽又能夠保證被dtt還原生成的mn2+能夠被完全螯合，充分保證了鈣黃綠素的黃綠色熒光的釋放，且顏色變成很深的亮黃綠色，極利于肉眼判斷，使本發明能夠在不開蓋的情況下檢測稀釋過程中樣品的混合均勻程度，使核酸恒溫擴增的檢測更容易操作，采用試紙條檢測的結果更加準確。
所述的鈣黃綠素的濃度的范圍在混合前優選為：20μm-500μm；更優選為50-200μm。所述二氧化錳濃度在混合前優選為50μg/ml-200μg/ml,更優選為100μg/ml-150μg/ml。所述焦磷酸鹽濃度在混合前優選為500μm-50mm,更優選為1mm-10mm。所述試劑的濃度范圍優選主要原因在于，鈣黃綠素的濃度在高于20μm時具有明顯的肉眼易于識別的黃綠色，低于此濃度，如10μm，盡管也能肉眼可見，但是通常需要在白色的背景下才易于觀察。而鈣黃綠素濃度過高時，如超過500μm，其濃度靠近棕紅色，與mno2的棕褐色十分類似，此時很難判斷mno2是否被溶解成mn2+,因此鈣黃綠素的濃度范圍優選為20μm-500μm。尤其在50μm-200μm之間,鈣黃綠素呈現明顯且純正的黃綠色，因此，此范圍為鈣黃綠素的最佳濃度。二氧化錳的優選濃度必須滿足能夠完全猝滅鈣黃綠素熒光的要求，但是由于dtt在pcr體系里面的最高濃度為10mm,其能夠溶解的mno2的最高濃度約為200μg/ml，故二氧化錳的濃度范圍優選為50μg/ml-200μg/ml。焦磷酸鹽的濃度則必須滿足能夠螯合所有的由二氧化錳產生的mn2+為宜，故焦磷酸鹽的濃度優選為最低500μm。但是混合液的鹽濃度過高容易造成溶液太黏稠而不利于在試紙條上涌動，因此焦磷酸鹽濃度最高不宜超過50mm。
附圖說明
圖1為實施例中所用可視化核酸檢測裝置的示意圖。附圖標號1、2、3為商業化的pcr管，附圖標號4為可視化核酸檢測裝置，附圖標號5為可視化核酸檢測裝置的檢測室，附圖標號6為核酸檢測用層析試紙條。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做進一步描述，但具體實施例并不對本發明作任何限定。
實施例1：所述可視化核酸擴增檢測裝置的使用方法——利用抗原修飾的引物進行試紙條檢測
1)在如圖1所示pcr管1加入核酸擴增反應液和抗原修飾引物，pcr管2中加入mno2和鈣黃綠素的混合溶液；pcr管3加入焦磷酸鹽(焦磷酸鈉或焦磷酸鉀)溶液。
2)將pcr管的管1管2管3分別與可視化核酸擴增檢測裝置4的三個連接口進行連接，密封。可視化核酸擴增檢測裝置的檢測室5內預先裝好核酸檢測試紙條6。
3)將密封好的裝置放在pcr儀或者金屬浴上進行擴增。所述裝有試劑的三個pcr管剛好至于金屬浴或者pcr儀的加熱孔中。
4)按照所需要的擴增程序進行正常擴增。
5)擴增結束，取出裝置。將裝置的倒置甩動，使得pcr管內的溶液流出。甩動的過程盡量使試紙條所在的一頭微微向上傾斜，液體在充分混勻之前不會流向試紙條。
6)觀察混合液的顏色在裝置內的各處都變為亮黃綠色，說明混合均勻。
7)水平倒置裝置，使混合液流向逐漸流向試紙條，并在試紙條上出現紅色線條。若僅出現c線，說明檢測結果為陰性。若同時出現t線和c線，說明檢測結果為陽性。若僅有t線沒有c線，或兩條線都沒有，說明檢測失敗，試紙條的品質出現問題。
實施例2：所述裝置的使用方法——利用抗原修飾的探針進行試紙條檢測1
1)在如圖1所示pcr管1加入核酸擴增反應液，pcr管2中加入mno2和鈣黃綠素的混合溶液及抗原修飾的探針；pcr管3加入焦磷酸鹽(焦磷酸鈉或焦磷酸鉀)溶液。
余下的步驟同實施例1。
實施例3：所述裝置的使用方法——利用抗原修飾的探針進行試紙條檢測2
1)在如圖1所示pcr管1加入核酸擴增反應液，pcr管2中加入mno2和鈣黃綠素的混合溶液及抗原修飾的探針1；pcr管3加入焦磷酸鹽(焦磷酸鈉或焦磷酸鉀)溶液及抗原修飾的探針2。
余下的步驟同實施例1。
實施例4：所述發明用于聚合酶鏈式反應pcr檢測豬肉成分。
1)在如圖1所示pcr管1加入20μlpcr反應液，(包括5’分別標記有生物素和fict的豬肉特異性引物、dntp、tris-hcl緩沖液、mg2+、taq核酸聚合酶，5mmdtt，購于biorad；模板等)；在pcr管管2中添加100μl100μg/mlmno2和100μm鈣黃綠素；管3添加100μl5mm焦磷酸鹽。三pcr管的液面加棕櫚油密封，避免擴增試劑蒸發。三管都與實驗裝置組成一個密封的整體。
2)將pcr管的管1管2管3分別與可視化核酸擴增檢測裝置的三個連接口進行連接，密封。顯色裝置內預先裝好核酸檢測試紙條。
3)將密封好的裝置放在pcr儀上。所述裝有試劑的三個pcr管剛好至于pcr儀的加熱孔中。
4)按照95度變性3分鐘，95度變性15s和60度退火延伸1min，擴增40循環的擴增程序進行擴增。
余下操作步驟同實施例1。
所述實施例中聚合酶鏈式反應pcr體系本身較為成熟簡單，不存在溶液過于黏稠的現象，使用的顯色試劑的濃度可以在最優濃度范圍內。
實施例3：所述發明用于重組酶聚合酶擴增rpa檢測轉基因大豆gts40-3-2成分。
1)在如圖1所示pcr管1加入50μlrpa反應液，(twist試劑盒，貨號tabas03kit，包括針對轉基因大豆gts40-3-2的無標記的引物f1；5’端生物素標記的引物r1；以及5’標記fitc，3’端標記spacer，中間標記thf殘基的探針；dntp；tris-hac緩沖液；mg2+、bsu聚合酶，重組酶t4uvsx，單鏈結合蛋白t4gp32，2mmdtt，購于twistdx；模板等)；在pcr管管2中添加100μl50μg/mlmno2和20μm鈣黃綠素；管3添加100μl500μm焦磷酸鹽。三管都與實驗裝置組成一個密封的整體。
2)將pcr管的管1管2管3分別與可視化核酸擴增檢測裝置的三個連接口進行連接，密封。顯色裝置內預先裝好核酸檢測試紙條。
3)將密封好的裝置放在金屬浴上。所述裝有試劑的三個pcr管剛好至于金屬浴的加熱孔中。
4)37度擴增20min。
余下操作步驟同實施例1。
所述實施例中由于重組酶聚合酶擴增反應rpa體系中本身含有十分高濃度的peg，擴增試劑本身的粘度非常高。為了保證試紙條檢測時擴增產物的正常涌動，所述各種顯色試劑濃度不宜過高。
實施例4：所述發明用于環介導等溫擴增lamp檢測副溶血弧菌。
1)在如圖1所示pcr管1加入25μllamp反應液，包括：針對副溶血弧菌的無標記的引物f3，b3，lf，bip；5’端生物素標記的引物lb；以及5’標記fitc的探針；dntp；betaine，bst聚合酶；5mmdtt，模板等)；在pcr管管2中添加100μl100μg/mlmno2和50μm鈣黃綠素；管3添加100μl3mm焦磷酸鹽。三管都與實驗裝置組成一個密封的整體。
2)將pcr管的管1管2管3分別與可視化核酸擴增檢測裝置的三個連接口進行連接，密封。顯色裝置內預先裝好核酸檢測試紙條。
3)將密封好的裝置放在金屬浴上。所述裝有試劑的三個pcr管剛好至于金屬浴的加熱孔中。
4)63度擴增60min。
余下操作步驟同實施例1。
所述實施例中由于環介導等溫擴增反應體系中本身betaine濃度通常達1m，反應試劑本身的粘度相對較高。在保證試紙條檢測時擴增產物的正常涌動的條件下，可以使用顏色最為明亮的顯色劑濃度，因此使用50μm鈣黃綠素，100μg/mlmno2和3mm焦磷酸鹽使檢測結果更為準確。
實施例5：所述發明用于交叉引物恒溫擴增cpa檢測柑橘黃龍病。
1)在如圖1所示pcr管1加入50μlcpa反應液，包括：針對柑橘黃龍病的無標記的引物f3，b3，cpf，cpr，5r；5’端生物素標記的引物5f；dntp；betaine，bst聚合酶；5mmdtt，購于杭州優思達生物；模板等)；在pcr管管2中添加100μl100μg/mlmno2和50μm鈣黃綠素以及5’標記fitc的探針；管3添加100μl3mm焦磷酸鹽。三管都與實驗裝置組成一個密封的整體。
2)將pcr管的管1管2管3分別與可視化核酸擴增檢測裝置的三個連接口進行連接，密封。顯色裝置內預先裝好核酸檢測試紙條。
3)將密封好的裝置放在金屬浴上。所述裝有試劑的三個pcr管剛好至于金屬浴的加熱孔中。
4)63度擴增60min。
余下操作步驟同實施例1。
所述實施例中由于交叉引物恒溫擴增cpa體系中本身betaine濃度通常達1m，反應試劑本身的粘度相對較高。在保證試紙條檢測時擴增產物的正常涌動的條件下，可以使用顏色最為明亮的顯色劑濃度，因此使用50μm鈣黃綠素，100μg/mlmno2和3mm焦磷酸鹽使檢測結果更為準確。
實施例6：所述發明用于切口酶擴增near檢測柑橘黃龍病。
1)在如圖1所示pcr管1加入50μlnear反應液，包括：針對柑橘黃龍病的無標記的引物f1，r1及bf,dntp；bst3.0聚合酶；切刻酶nt.bstnbi，kcl；購于envirologix；10mmdtt模板等)；在pcr管管2中添加100μl200μg/mlmno2和500μm鈣黃綠素以及5’標記fitc的探針p1；管3添加100μl50mm焦磷酸鹽和5’端標記生物素的探針p2。三管都與實驗裝置組成一個密封的整體。
2)將pcr管的管1管2管3分別與可視化核酸擴增檢測裝置的三個連接口進行連接，密封。顯色裝置內預先裝好核酸檢測試紙條。
3)將密封好的裝置放在金屬浴上。所述裝有試劑的三個pcr管剛好至于金屬浴的加熱孔中。
4)56度擴增10min。
余下操作步驟同實施例1。
所述實施例中由于切口酶擴增near的反應體系具有極高的反應速率，很容易產生非特異性擴增。使用高濃度的顯色試劑能夠起到抑制酶的反應活性的作用，從而抑制混合過程中探針與引物之間形成非特異性擴增，因此使用500μm鈣黃綠素，200μg/mlmno2和50mm焦磷酸鹽。