Rhodol類衍生物及其制備方法和應用與流程

本發明涉及兩種化學傳感器的制備方法及其應用，屬于化學傳感器技術領域。

背景技術：

活性氧（reactiveoxygenspecies，ros）包括羥基自由基、超氧自由基、單線態氧、過氧化氫和次氯酸/次氯酸鹽等，在生命系統中起著至關重要的作用。次氯酸（hclo）作為一種不穩定的弱酸性活性氧，具有很強的氧化性。一定濃度的次氯酸鹽常作為有效的消毒液和漂白劑廣泛用于日常生活中。另外，生物體內的內源性次氯酸也是一種正常的細胞代謝的副產物，是由氯離子與過氧化氫在髓過氧化物酶（mpo）的催化作用下生成，在免疫系統中扮演著抵御外來病原體入侵的角色并且還對維持細胞內微環境的氧化還原平衡狀態起著非常重要的作用。然而，細胞內次氯酸的水平一旦過高就會引發氧化應激，破環生物自身的防御系統，導致蛋白質、磷脂、dna等生物大分子的嚴重損害，從而引起一系列的疾病如肺部炎癥、神經元退化、風濕性關節炎、動脈硬化、心血管疾病、癌癥和腎臟疾病等。因此，實時監測活細胞中次氯酸的動態分布情況以及濃度變化已經成為當今細胞生物學研究和臨床診斷等領域的一項重要課題。傳統檢測次氯酸/次氯酸鹽的方法有很多，如電位分析法（ordeigo,masr,gonzaloj,etal.electroanalysis,2005,17,1641）、碘量滴定法（sotono,horstkotteb,marchjg,etal.analyticachimicaacta,2008,611,182）、色譜法（gallinaa,pastorep,magnof.analyst,1999,124,1439）等，但這些方法或多或少都存在著一些問題，如靈敏度差，檢測過程復雜，儀器使用成本昂貴，所以我們急需研發一種更方便，簡單，靈敏的次氯酸根檢測方法。

熒光分析法具有其高選擇性、高靈敏性、實時檢測、易于操作、無損檢測以及良好的生物樣品相容性等優點，已經成為研究者們檢測化學與生物樣品的一種重要手段。在實際應用過程中，選擇光譜性能優良的熒光分子對熒光分析法至關重要。然而，一些熒光分子的光物理性質缺陷限制了自身的應用范圍。因此，新型熒光團的開發及應用迫在眉睫。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種可用于細胞熒光成像的rhodol類衍生物（i）以及一類用于次氯酸根離子檢測的rhodol類衍生物（ii）。

本發明的另一目的是提供上述rhodol類衍生物的制備方法。

結構式（i）和（ii）所示化合物：

其中，，

r'為c1-18的烷基、烯基、炔基或芐基；

ia與ib互為互變異構體，在不同溶劑中以不同形式存在：在非質子性溶劑中主要以ia形式存在，而在質子性溶劑中主要以ib形式存在。

結構式（i）和（ii）所示化合物的制備方法，包括如下步驟：

（1）2-(4-二乙氨基)-2-羥基苯甲酰苯甲酸和2,4-二羥基苯甲醛在溫度為60～110°c，濃硫酸作為溶劑和催化劑的條件下，發生縮合反應，得到化合物（i）；

反應式：

（2）化合物（i）與r-h在溫度為60～85°c，使用體積比為5:1～1:5的醇與鹵代烷的混合溶劑，在無催化劑或在有機胺類催化劑條件下，通過縮合反應得到如結構式（ii）所示化合物；

反應式：

；

r'為c1-18的烷基、烯基、炔基或芐基。

上述的制備方法中，步驟（3）所述的醇包括但不限于甲醇、乙醇、異丙醇；鹵代烷包括但不限于二氯甲烷、三氯甲烷、二氯乙烷；有機胺包括但不限于六氫吡啶、三乙胺、吡啶。

本發明所述的化合物（i）可應用于細胞熒光成像。

本發明所述的化合物（ii）可用于次氯酸根離子的定量熒光檢測。

rhodafluor即rhodol熒光團，以其特有的熒光素和羅丹明混合結構兼具了兩者熒光量子產率高、摩爾消光系數大、以及光穩定性好和溶解性優良的光物理學性質。本發明通過2-(4-二乙氨基)-2-羥基苯甲酰苯甲酸和2,4-二羥基苯甲醛之間的縮合反應合成了一種新型rhodol類染料（i），且將此染料成功應用于生物成像中。進而以化合物（i）為熒光團，構建了一類次氯酸根熒光探針（ii），并在其中篩選出了兩種高靈敏性、高選擇性的實時響應型次氯酸根熒光探針ro610（r-=）和ro585（r-=）。

本發明的優點：（1）、化合物（i）熒光量子產率高，發射波長長，可以很好地應用于細胞熒光成像中并不受背景熒光的影響。（2）、化合物（ii）可實現環境、細胞和動物體內次氯酸根離子的高選擇性、高靈敏性實時檢測。舉例說明：由于次氯酸根離子有很強的氧化性，可以氧化ro610中c=n雙鍵，進而水解為甲酰基，移除異構化作用，從而引起熒光信號增強。基于這種熒光信號的變化，探針分子ro610能夠實現緩沖溶液測試體系中次氯酸根的實時檢測且不受其他活性氧類物質和常見陰離子的干擾，其檢測限為0.17μm，同時此探針已被成功應用于活細胞及小鼠體內次氯酸根檢測。除此之外，本發明還設計、合成了一種同時具有c=n雙鍵和聯氨基的rhodol類衍生物ro585。研究發現次氯酸根作用于此分子的聯氨基團，將其氧化為重氮基后經過分子內質子轉移形成一種穩定的結構，以此機理實現了次氯酸根離子的高選擇性，高靈敏性實時檢測。

附圖說明

圖1為化合物（ia）晶體結構圖；

圖2為化合物（i）的細胞熒光成像圖；

圖3為探針ro610在緩沖溶液中對次氯酸根離子離子濃度的熒光光譜；

圖4為探針ro610在緩沖溶液中對次氯酸根離子濃度工作曲線圖；

圖5為探針ro610在緩沖溶液中對次氯酸根離子在活性氧類化合物中選擇性熒光光譜；

圖6為探針ro610對次氯酸根離子在常見陰離子及氨基酸類化合物中選擇性熒光光譜；

圖7為探針ro610細胞內外源性次氯酸熒光成像研究；

圖8為探針ro610小鼠體內外源性次氯酸熒光成像研究；

圖9為探針ro585在緩沖溶液中對次氯酸根離子離子濃度的熒光光譜；

圖10為探針ro585在緩沖溶液中對次氯酸根離子濃度工作曲線圖；

圖11為探針ro585在緩沖溶液中對次氯酸根離子在活性氧類化合物中選擇性熒光光譜；

圖12為探針ro585對次氯酸根離子在常見陰離子及氨基酸類化合物中選擇性熒光光譜。

具體實施方式

下面實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法，所使用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1化合物（i）的制備

（1）準確稱量3-二乙胺基苯酚（8.25g,0.05mol），鄰苯二甲酸酐（9.5g,0.064mol）和甲苯35ml于100ml圓底燒瓶中。利用程序升溫的方法，80°c加熱10h，90°c加熱5h，100°c加熱2h,110°c回流1h。反應完成后析出紫紅色固體，抽濾，用甲醇洗滌濾餅，得到粉白色固體，即為產物2-(4-二乙氨基)-2-羥基苯甲酰苯甲酸。

（2）準確稱量化合物2-(4-二乙氨基)-2-羥基苯甲酰苯甲酸（0.15g,0.48mmol），2,4-二羥基苯甲醛（0.066g,0.48mmol），甲磺酸5ml于25ml圓底燒瓶中90°c反應約1h，待反應體系冷卻至室溫，傾入40ml冰水中，用氨水調ph至7-8，大量紅色固體析出，抽濾收集固體，冰水洗滌，干燥，最后經過柱層析純化（ch2cl2:ch3oh=300:1,v:v）得到淡粉色固體，即化合物（ⅰ）。¹hnmr(cdcl3,400mhz):δppm1.19(t,j=6.8hz,6h),3.38(q,j=6.8hz,4h),6.40(d,j=8.4hz,1h),6.49(s,1h),6.58(d,j=8.8hz,1h),6.81(s,1h),7.02(s,1h),7.23(d,j=7.4hz,1h),7.69(m,2h),8.06(d,j=7.2hz,1h),9.58(s,1h),11.20(s,1h);¹³cnmr(cdcl3,100mhz):δppm12.38,44.45,82.99,97.67,104.37,108.86,113.24,117.80,123.86,125.07,125.92,126.94,128.72,129.83,135.07,135.49,149.71,152.19,152.47,157.83,162.91,169.28,194.62;esi-hrms:[m+h]⁺m/z416.1483,calcdforc25h22no5416.1492；ft-ir(kbr,cm^-1):3672,1750,1625,1521,1405,875,801,697.

通過溶劑（二氯甲烷：ch2cl2）揮發法得到rhodol類化合物（ia）的晶體，并利用單晶衍射儀測定分析了其單晶結構（圖1）。化合物（ia）的分子式為c25h21no5，該晶體結構屬于單斜晶系，晶胞參數為：α=90deg，β=91.616deg，γ=90deg。

rhodol類化合物（i）細胞熒光成像研究：在直徑為35mm激光共聚焦培養皿上種植細胞，對照組孵育24h后在2ml的培養基中加入1μl，10mm的化合物（ⅰ）探針母液（dmso溶解，終濃度為5μm）進行染色培養10min。然后用pbs，ph=7.4緩沖溶液沖洗細胞3次，拍攝熒光成像圖片（圖2）。

實施例2探針ro610的制備及應用

（1）2-(4-二乙氨基)-2-羥基苯甲酰苯甲酸的制法與實施例1中的相同；

（2）rhodol類的化合物（i）制法與實施例1中的相同；

（3）準確稱取化合物（i）（83.05mg,0.2mmol），二氨基順丁烯二腈（32.43mg,0.3mmol）溶于4ml的混合溶劑（ch3oh:ch2cl2=5:3），攪拌回流，tlc監測至化合物（ⅰ）反應完全。反應結束后冷卻至室溫有黃色固體析出，減壓抽濾用冰甲醇洗滌3次，室溫干燥后即為純品，即為rhodol類衍生物ro610。¹hnmr(400mhz,acetone-d6):δppm8.46(s,1h),7.97(d,j=7.2hz,1h),7.80(t,j=7.2hz,1h),7.73(t,j=7.6hz,1h),7.39(s,1h),7.33(d,j=7.6hz,1h),7.13(s,2h),6.79(s,1h),6.57(d,j=9.6hz,1h),6.51(m,2h),3.44(q,j=6.8hz,4h),1.17(t,j=6.8hz,6h);¹³cnmr(100mhz,acetone-d6):δppm210.57,173.79,166.24,164.64,160.69,157.79,157.61,154.96,140.30,139.57,135.06,133.98,132.50,130.39,129.78,129.24,121.78,119.14,118.43,117.93,114.16,110.55,109.77,108.52,102.56,49.30,17.07;hrms(esi):[m+h]⁺m/z506.1831,calcdforc29h24n5o4506.1823;ft-ir(kbr,cm^-1):3432,2976,2233,2205,1739,1626,1501,1373,1264,1215,1108,874,767,692,546。

探針ro610對次氯酸根離子濃度的熒光光譜測試：在10ml的比色管中加入0.1ml1mm的ro610母液，3ml乙醇，1ml磷酸緩沖溶液（ph=7.4,20mm），再向其中分別加入濃度為0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,14,16,18,20,30,50μm的次氯酸根溶液。定容搖勻后，測定各組的熒光光譜，如圖3所示。由圖3可知，當體系中逐漸加入clo^?(0-50μm)時，隨著clo^?濃度增大，ro610在波長577nm處的熒光強度逐漸增強。

探針ro610對次氯酸根離子濃度工作曲線測定：由ro610對次氯酸根離子濃度的熒光光譜得到在577nm處熒光響應強度隨次氯酸根離子濃度工作曲線圖。如圖4可知，當體系中逐漸加入clo^?(0-20μm)時，577nm處的熒光強度與clo^?濃度呈現很好的線性關系，線性方程為y=150.448x+50.182，相關系數為0.9910，并且通過計算得其檢測限為0.17μm(3σ/slope)。

探針ro610對次氯酸根離子在活性氧類化合物中選擇性熒光光譜測試：在10ml的比色管中加入0.1ml1mm的ro610母液，3ml乙醇，1ml磷酸緩沖溶液（ph=7.4,20mm），再向其中分別加入200μmh2o2，?oh，o2^?，¹o2，no?，tbhp，tbo?和50μmclo^?。定容搖勻后，測定各組的熒光光譜，如圖5所示。由圖5可知，加入次氯酸根離子的體系在577nm處熒光強度大大增強，而其它活性氧類化合物則沒有明顯變化，說明rhodol類衍生物ro610對次氯酸根離子的檢測不受其他活性氧類物質影響，具有很好的選擇性。

探針ro610對次氯酸根離子在常見陰離子及氨基酸類化合物中選擇性熒光光譜測試：同活性氧類化合物選擇性檢測條件，向各組溶液中分別加入200μmf^?，cl^?，br^?，i^?，s2o3^2?，aco^?，so4^2?，no2^?，no3^?，cn^?，hs^?，scn^?，po4^3?，h2po4^?，hpo4^2?，co3^2?，hco3^?，hso4^?，hso3^?，so3^2?，cys，hcy，gsh和50μmclo^?。定容搖勻后，測定各組的熒光光譜，如圖6所示。由圖6可知，加入次氯酸根離子的體系在577nm處熒光強度大大增強，而加入其它陰離子和氨基酸類化合物不會引起熒光的變化，說明ro610對次氯酸根離子的檢測不受其他陰離子及氨基酸類化合物影響，具有很好的選擇性。

探針ro610細胞內外源性次氯酸熒光成像研究：在直徑為35mm激光共聚焦培養皿上種植細胞，對照組孵育24h后在2ml的培養基中加入1μl，10mm的ro610探針母液（dmso溶解，終濃度為5μm）進行染色培養10min。然后用pbs，ph=7.4緩沖溶液沖洗細胞3次，拍攝熒光成像圖片（激發波長為543nm，收集555-655nm波長范圍）。另一實驗組則是在細胞中加入探針母液染色后再加入10μm和25μm的次氯酸鈉溶液，孵育10min后進行熒光成像（激發波長為543nm收集，555-655nm波長范圍），得到熒光成像圖7。如圖7b所示ro610在細胞內呈現極其微弱的紅色熒光，隨后分別將2當量和5當量的次氯酸鈉溶液加入至染色后的細胞培養皿中，此時圖7e和7h顯示加入次氯酸鈉后探針分子的熒光顯著增強，且圖7h熒光比7e更強，這說明ro610可以實現mcf-7細胞內外源性次氯酸的熒光成像。

探針ro610小鼠體內外源性次氯酸熒光成像研究：選用4-6周未脫毛的小鼠作為實驗材料，將小鼠麻醉后用探針分子ro610(1mm,25μl)培養10min后進行小鼠成像實驗。從外加次氯酸在小鼠體內的熒光成像圖8可以看出，隨著時間的延長，探針分子和次氯酸鈉在小鼠體內發生反應，使得小鼠皮下注射部位的熒光強度顯著增強，此實驗說明ro610也可以用于活體動物內次氯酸的熒光成像研究。

實施例3探針ro585的制備及應用

（1）2-(4-二乙氨基)-2-羥基苯甲酰苯甲酸的制法與實施例1中的相同；

（2）rhodol類化合物（i）的制法與實施例1中的相同；

（3）準確稱取化合物（i）30mg（0.07mmol），2-吡啶肼11mg（0.1mmol）于10ml圓底燒瓶中，加入乙醇2ml溶解，加熱回流，tlc監測直至原料反應完全停止反應，體系冷卻至室溫，大量粉白色固體析出，抽濾，冰乙醇多次洗滌濾餅，得到粉白色固體，即為純品rhodol類衍生物ro585。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δppm8.12(s,1h),8.03(d,j=7.3hz,1h),7.66(m,2h),7.62(t,j=7.0hz,2h),7.20(d,j=7.4hz,1h),6.99(d,j=8.5hz,1h),6.83(s,1h),6.80(d,j=6.1hz,1h),6.59(s,1h),6.55(d,j=8.8hz,1h),6.45(s,1h),6.35(d,j=9.0hz,1h),3.36(q,j=6.8hz,4h),1.17(t,j=6.7hz,6h);¹³cnmr(100mhz,dmso-d6):δppm169.29,158.09,156.64,152.83,152.61,152.42,149.66,148.43,138.42,137.42,136.04,130.52,129.10,126.86,126.67,125.02,124.61,118.38,115.47,111.63,109.08,106.13,104.94,103.21,97.44,83.97,44.24,12.78;hrms(esi):[m+na]⁺m/z529.1851,calcdforc30h27n4o4529.1846;ft-ir(kbr,cm^-1):2971,1744,1600,1622,1441,1216,1166,1108,868,766,697,522.

探針ro585對次氯酸根離子濃度的熒光光譜測試：在10ml的比色管中加入0.1ml1mm的rhodol類衍生物ro585母液，2ml乙醇，1ml磷酸緩沖溶液（ph=7.4,20mm），再向其中分別加入濃度為0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,12,14,16,18,20μm的次氯酸根溶液。定容搖勻后，測定各組的熒光光譜，如圖9所示。由圖9可知，當體系中逐漸加入clo^?(0-20μm)時，隨著clo^?濃度增大，ro610在波長563nm處的熒光強度逐漸增強。

探針ro585對次氯酸根離子濃度工作曲線測定：由rhodol類衍生物ro585對次氯酸根離子濃度的熒光光譜得到在563nm處熒光響應強度隨次氯酸根離子濃度工作曲線圖。如圖10可知，當體系中逐漸加入clo^?(0-18μm)時，563nm處的熒光強度與clo^?濃度呈現很好的線性關系，y=211.405x–41.677，相關系數為0.9978，通過計算得出其檢出限為33nm(3σ/slope)。

探針ro585對次氯酸根離子在活性氧類化合物中選擇性熒光光譜測試：在10ml的比色管中加入0.1ml1mm的rhodol類衍生物ro585母液，2ml乙醇，1ml磷酸緩沖溶液（ph=7.4,20mm），再向其中分別加入200μmh2o2，?oh，o2^?，¹o2，no?，tbhp，100μmtbo?，50μmonoo^?和20μmclo^?。定容搖勻后，測定各組的熒光光譜，如圖11所示。由圖11可知，加入次氯酸根離子的體系在563nm處熒光強度大大增強，而其它活性氧類化合物則沒有明顯變化，說明rhodol類衍生物ro585對次氯酸根離子的檢測不受其他活性氧類物質影響，具有很好的選擇性。

探針ro585對次氯酸根離子在常見陰離子及氨基酸類化合物中選擇性熒光光譜測試：同活性氧類化合物選擇性檢測條件，向各組溶液中分別加入100μmf^?，cl^?，br^?，i^?，s2o3^2?，aco^?，so4^2?，no2^?，no3^?，cn^?，hs^?，scn^?，po4^3?，h2po4^?，hpo4^2?，co3^2?，hco3^?，hso4^?，hso3^?，so3^2?，cys，hcy，gsh和20μmclo^?。定容搖勻后，測定各組的熒光光譜。由圖12可知，加入次氯酸根離子的體系在563nm處熒光強度大大增強，而加入其它陰離子和氨基酸類化合物不會引起熒光的變化，說明rhodol類衍生物ro585對次氯酸根離子的檢測不受其他陰離子及氨基酸類化合物影響，具有很好的選擇性。