(一)技術領域
本發明涉及一種具有抗腫瘤作用的阿樸啡生物堿illigerineb及其制備方法和應用。
(二)
背景技術：
青藤屬(illigera)植物是蓮葉桐科(hernanadiaceae)第二大屬，主要分布于東半球熱帶，亞熱帶地區，全世界約有30余種，我國有12余種，廣泛分布于我國西南部至臺灣。該屬多種植物在我國作為藥用植物和民間草藥使用。廣西民間常用其莖泡茶飲用，作為鎮痛、止痢、解熱藥物使用。傳統中醫認為其具有養血祛風、舒筋活絡、解毒消腫的功效，常用于祛風止痛、散瘀消腫、主風濕性關節疼痛、跌打腫痛、蛇蟲咬傷、腰肌勞損、四肢麻木等癥；現代藥理研究表明本屬植物具有解痙鎮痛、降溫、局部麻醉等活性，目前多用于治療風濕性及類風濕性關節炎、肥大性脊椎炎等。
因此對該類植物進行系統、科學的研究，探明其有效成分及作用機理，發現一些結構新穎的活性成分，將對更深層開發利用青藤屬藥用植物的食療保健產品、開發治療藥物及臨床應用產生重要意義。
香青藤(illigeraaromaticas.z.huangets.l.mo)是青藤屬(illigera)植物，藤本，藤莖直徑1～8厘米，是中國特有的藤本資源，分布于中國廣東、廣西及云南、四川南部、臺灣等地。
本發明以香青藤藤莖為研究對象，進行提取、分離、純化、結構鑒定得到illigerineb，屬于阿樸啡生物堿類化合物，該化合物具有一定程度的抗腫瘤活性。
(三)
技術實現要素：
本發明旨在提供一種具有抗腫瘤作用的阿樸啡生物堿illigerineb及其制備方法和應用。
本發明的技術方案如下：
如式(i)所示的阿樸啡生物堿illigerineb：
本發明還提供了所述式(i)所示阿樸啡生物堿illigerineb的制備方法，所述制備方法按如下步驟進行：
(1)甲醇浸提：將香青藤藤莖粉碎干燥，加入甲醇浸提提取，之后濾除不溶物，濾液減壓蒸干得到甲醇浸膏；
所述香青藤藤莖可通過常規途徑商購獲得；
具體的，所述甲醇浸提的操作方法為：將粉碎干燥后的香青藤藤莖與甲醇以料液質量體積比1/3～1/5(g/ml)混合，常溫(20～30℃，下同)浸提5～10天，過濾得到甲醇提取液，濾渣重復浸提2～4次，合并每次所得甲醇提取液，減壓蒸干，得到甲醇浸膏；
(2)乙酸乙酯萃取：將步驟(1)所得甲醇浸膏分散于水中，再用乙酸乙酯萃取，萃取液減壓蒸干得到乙酸乙酯浸膏；
具體的，所述乙酸乙酯萃取的操作方法為：將步驟(1)所得甲醇浸膏分散于5～10倍質量的水中，得到懸浮液，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏；
(3)一次柱層析：對步驟(2)所得乙酸乙酯浸膏進行柱層析分離，以200～300目硅膠為柱填料，石油醚/乙酸乙酯體積比10/1～1/10的混合液和乙酸乙酯為洗脫劑，進行梯度洗脫，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到一次柱層析產品；
具體的，所述梯度洗脫的操作方法為：以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為10/1、8/1、6/1、5/1、3/1、1.5/1、1/1、1/2、1/3、1/3.5、1/4.5、1/6、1/7、1/10的混合液、乙酸乙酯為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為18～20ml/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為360～600min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到一次柱層析產品；
(4)二次柱層析：繼續對步驟(3)所得一次柱層析產品進行柱層析分離，以200～300目硅膠為柱填料，二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇體積比100/1～2/1的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到二次柱層析產品；
具體的，所述梯度洗脫的操作方法為：以二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇體積比100/1、80/1、60/1、30/1、10/1、5/1、2/1的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為10～12ml/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為16～20min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到二次柱層析產品；
(5)洗滌除雜：將步驟(4)所得二次柱層析產品用甲醇進行洗滌除雜，最后干燥得到式(i)所示阿樸啡生物堿illigerineb；
具體的，所述洗滌除雜的操作方法為：將所述二次柱層析產品和甲醇按料液質量體積比1/5～1/10(g/ml)加入離心管中，40khz超聲10s，離心，去除上清液，重復洗滌3次，最后干燥得到式(i)所示阿樸啡生物堿illigerineb。
本發明所述步驟(3)、(4)的柱層析過程中，可通過薄層層析(tlc)檢測收集含目標化合物(illigerineb)的洗脫液；所述的目標化合物用tlc檢測時，以二氯甲烷：甲醇體積比＝10/1為展開劑，其rf值為0.48。
本發明所述阿樸啡生物堿illigerineb在制備抗腫瘤活性藥物中具有應用前景。經實驗證明，阿樸啡類生物堿illigerineb與ddp對照組相比較，高濃度時對人宮頸癌hela細胞、人乳腺癌bcap37細胞及人肝癌smmc7721細胞具有顯著的體外增殖抑制作用，且對人宮頸癌hela細胞作用最強，這提示該化合物具有潛在的抗腫瘤活性。
本發明的有益效果在于：本發明所述阿樸啡類生物堿illigerineb的提取、分離、純化方法簡單，抑制腫瘤細胞活性明確，具有潛在的開發為抗腫瘤藥物的價值。
(四)附圖說明
圖1：實施例5中順鉑(ddp)、阿樸啡類生物堿illigerineb(i)對三種癌細胞的半致死濃度(ic50)。
(五)具體實施方式
下面通過具體實施例對本發明作進一步的說明，但本發明的保護范圍并不僅限于此。
以下實施例中用到的香青藤藤莖購自廣西玉林中藥材市場。
實施例1：illigerineb的制備
表1：實驗所用儀器
(1)甲醇浸提：將粉碎干燥后的香青藤藤莖500g與甲醇2000ml混合，常溫浸提5天，過濾得到甲醇提取液，濾渣重復浸提4次，合并每次所得甲醇提取液，減壓蒸干，得到甲醇浸膏50g。
(2)乙酸乙酯萃取：將步驟(1)所得甲醇浸膏30g分散于水250ml中，得到懸浮液，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏12g。
(3)一次柱層析：用200～300目柱層析硅膠450g對步驟(2)所得乙酸乙酯浸膏12g進行柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為10/1、8/1、6/1、5/1、3/1、1.5/1、1/1、1/2、1/3、1/3.5、1/4.5、1/6、1/7、1/10的混合液和乙酸乙酯(純)為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為18ml/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為400min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得一次柱層析產品0.96g；
(4)二次柱層析：用200～300目柱層析硅膠65g繼續對步驟(3)所得一次柱層析產品0.96g進行柱層析分離，以二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇體積比100/1、80/1、60/1、30/1、10/1、5/1、2/1的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為10ml/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為20min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到二次柱層析產品52mg；
(5)洗滌除雜：在離心管中加入步驟(4)所得二次柱層析產品52mg，再加入甲醇0.5ml，40khz超聲10s，4000rpm離心2分鐘，去除上清液，重復洗滌3次，最后干燥得到產物illigerineb31mg。
實施例2：illigerineb的制備：
表2：實驗所用儀器
(1)甲醇浸提：將粉碎干燥后的香青藤藤莖1000g與甲醇3000ml混合，常溫浸提5天，過濾得到甲醇提取液，濾渣重復浸提4次，合并每次所得甲醇提取液，減壓蒸干，得到甲醇浸膏50g。
(2)乙酸乙酯萃取：將步驟(1)所得甲醇浸膏50g分散于水400ml中，得到懸浮液，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏23g。
(3)一次柱層析：用200～300目柱層析硅膠450g對步驟(2)所得乙酸乙酯浸膏23g進行柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為10/1、8/1、6/1、5/1、3/1、1.5/1、1/1、1/2、1/3、1/3.5、1/4.5、1/6、1/7、1/10的混合液和乙酸乙酯(純)為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為18ml/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為400min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得一次柱層析產品1.59g；
(4)二次柱層析：用200～300目柱層析硅膠130g繼續對步驟(3)所得一次柱層析產品1.59g進行柱層析分離，以二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇體積比100/1、80/1、60/1、30/1、10/1、5/1、2/1的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為10ml/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為20min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到二次柱層析產品63mg；
(5)洗滌除雜：在離心管中加入步驟(4)所得二次柱層析產品63mg，再加入甲醇0.5ml，40khz超聲10s，4000rpm離心2分鐘，去除上清液，重復洗滌3次，最后干燥得到產物illigerineb55mg。
實施例3：illigerineb的制備：
表3：實驗所用儀器
(1)甲醇浸提：將粉碎干燥后的香青藤藤莖25kg與甲醇100l混合，常溫浸提5天，過濾得到甲醇提取液，濾渣重復浸提4次，合并每次所得甲醇提取液，減壓蒸干，得到甲醇浸膏1kg。
(2)乙酸乙酯萃取：將步驟(1)所得甲醇浸膏1kg分散于水5000ml中，得到懸浮液，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯相，減壓回收溶劑，得到乙酸乙酯浸膏293g。
(3)一次柱層析：用200～300目柱層析硅膠1.7kg對步驟(2)所得乙酸乙酯浸膏293g進行柱層析分離，以石油醚/乙酸乙酯體積比分別為10/1、8/1、6/1、5/1、3/1、1.5/1、1/1、1/2、1/3、1/3.5、1/4.5、1/6、1/7、1/10的混合液和乙酸乙酯(純)為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為18ml/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為500min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得一次柱層析產品2.76g；
(4)二次柱層析：用200～300目柱層析硅膠130g繼續對步驟(3)所得一次柱層析產品2.76g進行柱層析分離，以二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇體積比100/1、80/1、60/1、30/1、10/1、5/1、2/1的混合液為洗脫劑，進行梯度洗脫，洗脫劑的流速為10ml/min，每種梯度的洗脫劑的洗脫時間為20min，收集含目標化合物的洗脫液，減壓蒸除溶劑得到二次柱層析產品72mg；
(5)洗滌除雜：在離心管中加入步驟(4)所得二次柱層析產品72mg，再加入甲醇0.5ml，40khz超聲10s，4000rpm離心2分鐘，去除上清液，重復洗滌3次，最后干燥得到產物illigerineb70mg。
實施例4：化合物測試
表4：實驗所用儀器
試劑：核磁共振使用氘代dmso(二甲亞砜)試劑，質譜使用德國默克(merck)色譜純試劑。
對實施例1、實施例2或實施例3制得的阿樸啡類生物堿illigerineb(i)進行理化性質和波譜學分析，esi-ms測定值m/z:338[m-h]-，結合nmr數據確定其分子式為c18h13no6，分子量為339，不飽和度為13。
表5：所得化合物illigerineb(i)的nmr數據
實施例5：抗腫瘤活性測試
對上述實施例制得的阿樸啡類生物堿illigerineb(i)進行了體外抗腫瘤活性測試。
方法：取對數生長期腫瘤細胞，調整細胞懸液濃度，每孔100μl細胞懸液接種于96孔細胞培養板中，接種24h后給藥(100μl/孔)，分別設細胞對照組以及4個濃度受試藥物組。繼續培養72h后每孔加入100μlmtt(1mg/ml，以dmem培養液溶解)，37℃孵育2h，棄去各孔內液體后加入150μl酸化異丙醇(含0.04mol/lhcl)，避光放置30min，dg3022a型酶聯免疫檢測儀測定570nm處吸光度，計算各受試藥物對腫瘤細胞的增殖抑制率，以孫瑞元教授編寫的ndst計算機程序計算各受試藥物的半數抑制濃度(ic50)。
結果：上述實施例所制得的阿樸啡類生物堿illigerineb(i)與ddp對照組相比較，高濃度時對人宮頸癌hela細胞，人乳腺癌bcap37細胞及人肝癌smmc7721細胞具有顯著的體外增殖抑制作用，且對人宮頸癌hela細胞作用最強。這提示該化合物是潛在的抗腫瘤活性的藥物(如圖1所示)。