專利名稱：一種惡臭假單胞菌用培養基的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物培養技術領域，涉及一種微生物培養基，特別是涉及一種用于培養惡臭假單胞菌的培養基。
背景技術：
硝基苯是化工行業的基本原料之一，主要應用于炸藥、農藥、染料等有機合成工業。由于硝基苯在水中具有較高的穩定性，一旦進入水體，就會造成水體較長時間的污染，另外，硝基苯毒性較強，不僅能夠造成環境污染，而且一旦人吸入硝基苯蒸汽，還會引起急性中毒等。目前對硝基苯廢水的處理方法主要有物理法、化學法和生物法。化學法和物理法處理硝基苯廢水較多，但普遍存在二次污染和處理效果不理想等問題。生物法，特別是利用微生物處理該類廢水是目前研究的熱點。
有關硝基苯降解菌的研究已有文獻報道，孫凌等(活性炭固定耐冷菌對硝基苯的降解特性，中國環境科學，2009，29(9) =941 - 945)用活性炭固定惡臭假單孢菌(.Pseudomonas putida)進行了硝基苯的降解研究。李明堂,徐鏡波，盧振蘭，等(兩株細菌對鄰氯硝基苯的協同降解[J]，環境科學學報，2010，30 (6) :1138 - 1143)研究結果表明Pseudomonas putida也可以降解對鄰氯硝基苯。王琦等(硝基苯降解菌的篩選馴化及其最適降解條件研究，廣東化工，2009，36 (11) =216-219)研究表明，隨著硝基苯濃度升高，短桿菌屬細菌對其降解效率降低，硝基苯濃度為500mg/L時，去除率僅為82%。王書航等(硝基苯降解菌篩選和鑒定，合肥工業大學學報，2008，31 (11) 1751 - 1754)研究表明，假單孢菌對初始質量濃度為25mg/L的硝基苯溶液經過168h培養，降解效率為81. 86%。王松等(硝基苯微生物降解的優化條件研究)研究了硝基苯初始濃度、PH值、重金屬和NaCl濃度對硝基苯降解率影響，結果表明硝基苯的初始體積比為1000 μ L/L，pH=8, NaCl質量濃度50mg/L，ZnCl2質量濃度50mg/L時，硝基苯降解率可達72. 9%。但是，上述報道均存在微生物作用時間較長，降解效率不高，微生物對硝基苯的耐受性較低等問題。上述問題的本質是微生物數量少，培養條件差造成的。其原因是現在針對培養基的研究主要集中在菌種生長所需碳源、氮源和無機鹽等常規營養元素上，并未考慮到培養基中假單孢菌生長過程中所需要的限制成份。
發明內容
本發明的目的是提供一種惡臭假單胞菌用培養基，以本發明的培養基培養出的惡臭假單胞菌培養時間快，生長速度快、菌株耐受性高，適應能力強。每IOOOmL本發明的惡臭假單胞菌用培養基中，各組分的含量分別為
牛肉膏7 13g，尿素2 5g，磷酸氫二鉀2 3g，磷酸二氫鉀O. 5 2g，氯化鈣O. 3
1.2g，硝酸鈉3. 4 5. 6g，微量元素和生長因子溶液I 5mL，去離子水余量。其中，所述的微量元素和生長因子溶液中含MoSO4 2.4 3. 6mmol/L，CuCl2 I. 5
2.8mmol/L, ZnCl2 3. O 4. OmmoI/L, FeSO4 4. 2 4. 8mmol/L，尿嘧啶 15 21mmol/L, VB620 35mmol/L, L-色氛酸 30 SOmmoI /I,η本發明制備得到的培養基的pH值范圍調節為7. 5 8. 2。進一步地，每IOOOmL本發明的惡臭假單胞菌用培養基中，各組分的含量分別為 牛肉膏8. 6 10. 8g，尿素2. 3 4. 6g，磷酸氫二鉀1.1 I. 7g，磷酸二氫鉀O. 6
I. 7g，氯化鈣O. 4 I. Og,硝酸鈉3. 4 4. 3g，微量元素和生長因子溶液lmL，去離子水余量。優選地，每IOOOmL本發明的惡臭假單胞菌用培養基中含有牛肉膏10g，尿素4. 2g，磷酸氫二鉀2. 96g，磷酸二氫鉀O. 84g，氯化鈣O. Sg,硝酸鈉4g，微量元素和生長因子溶液lmL，去離子水余量。將惡臭假單胞菌株接入本發明的培養基，于27 32 °C，搖床轉速120 150r/min下培養12 24h，即可得到高濃度銅綠假單孢菌液。 本發明根據惡臭假單胞菌的生理特性，篩選配制出了適合于惡臭假單胞菌生長的培養基，并在培養基中引入了 Mo2+，Cu2+，Zn2+，Fe2+，尿嘧啶，VB6, L-色氨酸等微量元素和生長因子。其中，無機鹽有助于促進硝基苯降解相關酶類的合成和提高其酶活，促進微生物的生長速率，而尿嘧啶，VB6和L-色氨酸等有利于細胞的生長和分裂，從而提高了微生物對硝基苯的降解效率。本發明提供的培養基為惡臭假單胞菌提供了優良的生長環境，經本發明培養基培養的惡臭假單胞菌培養時間短，可在24h內達到較高濃度(0D值達2. O以上)，在自然條件下適應能力強，具有較高的活力及硝基苯降解能力，對硝基苯的降解效率特別是炸藥廢水中硝基苯的降解效率達94. 5%以上，同時還對含苯環和硝基類物質具有較高的耐受性。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步說明本發明。但不能將實施例理解為是對本發明保護范圍的限制，本領域技術人員根據其內容對本發明進行的一些非本質的改進和調整，仍應屬于本發明的保護范圍。實施例I
分別稱取 MoSO4 O. 52g, CuCl2 O. 26g, ZnCl2 O. 43g, FeSO4 O. 70g，尿嘧啶 2. 22g，VB65. 08g，L-色氨酸6. 35g，加入IOOOmL去離子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生長因子溶液。取牛肉膏8. 8g，尿素2. 6g，磷酸氫二鉀2. 4g，磷酸二氫鉀O. 9g，氯化鈣O. 5g，硝酸鈉3. Sg，微量元素和生長因子溶液2mL，加去離子水攪拌溶解完全后，以去離子水補足至IOOOmL,并調節培養基的pH值范圍為7. 5 8. 2，得到惡臭假單胞菌用培養基。實施例2
分別稱取 MoSO4 O. 64g, CuCl2 O. 34g, ZnCl2 O. 51g, FeSO4 0.68g，尿嘧啶 I. 92g, VB64. 53g，L-色氨酸9. 85g，加入IOOOmL去離子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生長因子溶液。取牛肉膏9. 6g，尿素3. 9g，磷酸氫二鉀2. 5g，磷酸二氫鉀I. 3g，氯化鈣O. 8g，硝酸鈉4. lg，微量元素和生長因子溶液2mL，加去離子水攪拌溶解完全后，以去離子水補足至IOOOmL,并調節培養基的pH值范圍為7. 5 8. 2，得到惡臭假單胞菌用培養基。
實施例3
分別稱取 MoSO4 O. 46g, CuCl2 O. 29g, ZnCl2 O. 48g, FeSO4 0.65g，尿嘧啶 I. 73g, VB67. 03g, L-色氨酸8. 27g，加入IOOOmL去離子水中，充分溶解完全，得到微量元素和生長因子溶液。取牛肉膏10.(^，尿素3.38，磷酸氫二鉀2.78，磷酸二氫鉀L 6g，氯化鈣O. 9g，硝酸鈉3. 5g，微量元素和生長因子溶液2mL，加去離子水攪拌溶解完全后，以去離子水補足至IOOOmL,并調節培養基的pH值范圍為7. 5 8. 2，得到惡臭假單胞菌用培養基。應用例I I、采集興安化工廠硝化棉生產廢水3mL，加入到IOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于30°C、120r/min的恒溫搖床上振蕩培養24h。取培養物lmL，轉移到新鮮的同樣牛肉膏蛋白胨培養基中，于30°C、120r/min的恒溫搖床上振蕩重復培養24h，得到富集培養液。2、移取ImL上述富集培養液，轉接入含5mmol/L硝基苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養基中，在溫度30 V下培養48h后，取其中的培養物ImL轉移到同樣濃度硝基苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養基中，30°C下重復培養，至培養液濁度(0D值)達到1.2。3、在無菌條件下，用接種環蘸取上述含硝基苯的培養液，在實施例I的培養基上劃線分離，于30°C恒溫培養箱中培養72h后，得到獨立的典型菌株。4、將菌種接入實施例I提供的培養基中，27 32°C下，搖床轉速90 120r/min培養24 36h (對數期)，得到菌種，較平均培養時間縮短6 12h。5、取上述菌種5mL (0D值2. 2)，加入到含硝基苯300mg/L的IOOmL溶液中，30°C下，140r/min搖床振蕩培養72h后測定硝基苯含量。經測定，硝基苯降解率為96. 1%。6、將上述菌種按伯杰氏手冊進行菌種分類鑒定，經初步鑒定，該菌種為惡臭假單胞菌。應用例2
I、采集興安化工廠硝化棉生產廢水3mL，加入到IOOmL牛肉膏蛋白胨液體培養基中，于30°C、120r/min的恒溫搖床上振蕩培養24h。取培養物lmL，轉移到新鮮的同樣牛肉膏蛋白胨培養基中，于30°C、120r/min的恒溫搖床上振蕩重復培養24h，得到富集培養液。2、移取ImL上述富集培養液，轉接入含5mmol/L硝基苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養基中，在溫度30 V下培養48h后，取其中的培養物ImL轉移到同樣濃度硝基苯的新鮮牛肉膏蛋白胨培養基中，30°C下重復培養，至培養液濁度(0D值)達到1.2。3、在無菌條件下，用接種環蘸取上述含硝基苯的培養液，在實施例2的培養基上劃線分離，于30°C恒溫培養箱中培養72h后，得到獨立的典型菌株。4、將菌種接入實施例2提供的培養基中，27 32°C下，搖床轉速90 120r/min培養24 36h (對數期)，得到菌種，較平均培養時間縮短6 12h。5、取上述菌種5mL (0D值2. 4)，加入到含硝基苯500mg/L的IOOmL溶液中，32°C下，120r/min搖床振蕩培養72h后測定硝基苯含量。經測定，硝基苯降解率為95. 2%。6、將上述菌種按伯杰氏手冊進行菌種分類鑒定，經初步鑒定，該菌種為惡臭假單胞菌。
權利要求
1.一種惡臭假單胞菌用培養基，每IOOOmL培養基中含有 牛肉膏7 13g，尿素2 5g，磷酸氫二鉀2 3g，磷酸二氫鉀O. 5 2g，氯化鈣O. 3 1.2g，硝酸鈉3. 4 5. 6g，微量元素和生長因子溶液I 5mL，去離子水余量； 其中，所述的微量元素和生長因子溶液中含MoSO4 2. 4 3. 6mmol/L，CuCl2 I. 5 2.8mmol/L, ZnCl2 3. O 4. OmmoI/L, FeSO4 4. 2 4. 8mmol/L，尿嘧啶 15 21mmol/L, VB620 3Smmol /T,, L-色氛酸 30 SOmmoI /I,； 調節培養基的PH值范圍為7. 5 8. 2。
2.根據權利要求I所述的惡臭假單胞菌用培養基，每IOOOmL培養基中各組分的含量分別為牛肉膏8. 6 10. 8g,尿素2. 3 4. 6g,磷酸氫二鉀2. 2 2. 7g,磷酸二氫鉀O. 6 I. 7g，氯化鈣O. 4 I. Og,硝酸鈉3. 4 4. 3g，微量元素和生長因子溶液lmL，去離子水余量。
3.根據權利要求I所述的惡臭假單胞菌用培養基，每IOOOmL培養基中各組分的含量分別為牛肉膏10g，尿素4. 2g，磷酸氫二鉀2. 96g，磷酸二氫鉀O. 84g，氯化鈣O. Sg，硝酸鈉·4g,微量兀素和生長因子溶液ImL,去尚子水余量。
全文摘要
一種惡臭假單胞菌用培養基，每1000mL培養基中含有牛肉膏7～13g，尿素2～5g，磷酸氫二鉀2～3g，磷酸二氫鉀0.5～2g，氯化鈣0.3～1.2g，硝酸鈉3.4～5.6g，微量元素和生長因子溶液1～5mL，去離子水余量，其中微量元素和生長因子溶液中含MoSO42.4～3.6mmol/L，CuCl21.5～2.8mmol/L，ZnCl23.0～4.0mmol/L，FeSO44.2～4.8mmol/L，尿嘧啶15～21mmol/L，VB620～35mmol/L，L-色氨酸30～50mmol/L。本發明提供的培養基為惡臭假單胞菌提供了優良的生長環境，使用本發明培養基培養惡臭假單胞菌培養時間快，菌株耐受性高，適應能力強，對硝基苯的降解效率達94.5%以上，同時還對含苯環和硝基類物質具有較高的耐受性。
文檔編號C12R1/40GK102888378SQ201210432500
公開日2013年1月23日 申請日期2012年11月2日 優先權日2012年11月2日
發明者郭峰波, 賈萬利, 李穎 申請人:中北大學