兼具谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的雙功能抗氧化酶及其制備方法與流程

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種兼具谷胱甘肽過氧化物酶(gpx)和超氧化物歧化酶(sod)活性的雙功能抗氧化酶及其制備方法。

背景技術：

活性氧(ros)是機體氧代謝的副產物，正常生理狀態下，ros的產生和消除處于動態平衡狀態，從而維持機體氧化和抗氧化的相對平衡。然而，隨著生態惡化、環境污染及現代化生活不規律的程度日趨加深，多種內在及外在因素導致ros的過量產生，當過多的ros不能及時清除，與之相伴的疾病也愈加嚴重和高發，對人類的健康造成嚴重威脅。

機體針對活性氧的酶學防御系統主要包括超氧化物歧化酶(sod)、過氧化氫酶(cat)和谷胱甘肽過氧化物酶(gpx)。gpx在該體系中發揮著重要的作用，它以底物gsh為還原劑，分解體內的過氧化氫和各類氫過氧化物，因而能清除體內多種活性氧(ros)，防止脂質過氧化，治療由活性氧引起的各種疾病，如衰老、紫外線輻射、心腦血管疾病、白內障、腫瘤等。與其它抗氧化酶不同，gpx除了能清除ros外，還能降解脂質過氧化物，防止細胞過氧化損傷，這種獨特的保護細胞的功能使它在抗氧化酶體系中占有特別重要的位置。然而，由于天然gpx的催化基團是硒代半胱氨酸(secys)，而且來源有限、穩定性差，致使它的人工產物及其模擬物的研究備受關注。sod是超氧陰離子(o2^·-)的唯一清除劑，能轉化o2^·-為過氧化氫(h2o2)，繼而被cat、gpx等將其分解為水(h2o)，從而使有害的o2^·-和h2o2轉化為無害的水分子。如果抗氧化酶的協同作用被破壞，可將ros的損傷效應放大，從而引發多種疾病。根據這些酶在清除ros時的協同作用，獲得兼具gpx和sod兩種抗氧化功能于一體的雙功能抗氧化酶，相比單一抗氧化酶，更有利于清除活性氧，發揮其巨大的應用價值。

中國專利201110287018.0公開的方法是制備一種兼具sod和gpx活性的65肽，是將sod和gpx活性中心的結構域整合而形成的小分子雙功能模擬酶，正象其說明書中顯示的那樣，其gpx活力831u/umol遠低于天然gpx57801u/umol的活力。中國專利201310302778.3、201310142866.1和201510431360.1公開的方法在活力上取得了突破性進展，但其只能用于制備高活力的各型單功能gpx及其突變體，不包括雙功能抗氧化酶及其制備方法。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種兼具谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的雙功能抗氧化酶的氨基酸序列并用中國專利201510431360.1公開的人工合成的能通讀uag為硒代半胱氨酸的雜合trna和特殊的工程菌制備該雙功能抗氧化酶。本發明涉及序列seqidno:1～26，其由gpx和sod兩種酶的氨基酸序列組成，既能分解sod的底物，又能分解gpx的底物。先用基因合成法獲得雜合trna基因，再合成或擴增gpx和sod基因，將兩者組裝到同一個能夠表達雜合trna的分泌型原核表達載體上，轉化tag工程菌，在亞硒酸鈉存在下誘導表達，通過常規氨基酸進入肽鏈的方式將gpx的催化基團sec引入到蛋白的底物結合部位，賦予其高的gpx和sod活性。本發明方法簡單，酶蛋白活力和產量高、穩定性好，具有高效的抗氧化功能。

本發明應用基因工程技術、原核細胞培養技術，以基因組中所有uag終止密碼子被uaa終止密碼子替代及刪除釋放因子rf1的大腸桿菌為表達系統，利用人工合成的雜合trna編碼uag終止密碼子為硒代半胱氨酸(硒代半胱氨酸)，從而通過常規氨基酸進入肽鏈的方式實現硒代半胱氨酸在谷胱甘肽過氧化物酶(gpx)的活性中心定點插入和高活力兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶的高效表達。本方法可以在避開原核生物編碼硒代半胱氨酸的復雜機制及低效率等缺點，發揮原核生物便于基因操作、高效表達外源基因和培養成本低等優點，為兼具gpx和sod活性的雙功能酶等具有藥用價值的硒蛋白提供簡單、高效的制備方法。本發明方法在日化品生產和生物制藥方面具有廣闊的應用前景。

本發明使用中國專利201510431360.1公開的雜合trna作為搬運rna，制備高活力兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶。這些雜合trna是以大腸桿菌絲氨酸的trna的編碼序列sert(參見ncbi，geneid:944826，編碼trna^seruga)和硒代半胱氨酸的trna編碼序列selc(參見ncbi，geneid:948167，編碼trnasec)為模板，通過計算機輔助的序列分析和基因合成，得到一種能夠編碼琥珀型終止密碼子uag為硒代半胱氨酸的雜合trna^uacua，其由90個堿基組成，與大腸桿菌trna^sec相比較，其既能夠作為硒代半胱氨酸合成的底物trna，又能夠被大腸桿菌自身的延伸因子ef-tu識別，從而通過常規氨基酸進入肽鏈的方式實現硒代半胱氨酸在uag密碼子處的定點編碼與插入。利用此雜合trna在uag通讀表達系統中能高效表達高活力兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶，所述的雜合trna^uacua的一級核苷酸序列如seqidno：1所示：

進一步，所述的雜合trna的具體核苷酸序列還包括將序列1(seqidno：1)第72位堿基a突變為其它三種堿基c、u、g中的任何一個所形成的新型雜合trna，其序列如seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4所示。

進一步，所述的雜合trna的具體堿基序列還包括，將序列1-4(seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4)中第8位堿基g突變為c、第79位堿基c突變為g所形成的任何一種新型雜合trna，其序列如seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8所示。

進一步，所述的雜合trna的具體堿基序列還包括，將序列1-8(seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8)中第62位堿基g突變為u、第78位堿基u突變為a和第64位堿基a突變為c、第76位堿基u突變為g所形成的任何一種新型雜合trna，其序列如seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15、seqidno：16所示。

本發明所述的兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶是將gpx和sod的氨基酸序列中間插入一段特殊的連接短肽而形成的具有新的氨基酸序列與組成的新型抗氧化酶gpx-l-sod，其氨基酸序列如seqidno：17所示(實施例1-17)。

進一步，所述的兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶的具體氨基酸序列還包括，將seqidno：17中sod的氨基酸序列提前，而gpx的氨基酸序列移到連接肽之后所形成的sod-l-gpx，其氨基酸序列如seqidno：18所示(實施例18)。

進一步，所述的兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶的具體氨基酸序列還包括，將seqidno：17中第204-229位氨基酸中的任何一個或幾個去掉或替換后所形成的新氨基酸序列。比如將第229位氨基酸去掉所形成的新序列如seqidno：19所示(實施例19)。

進一步，所述的兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶的具體氨基酸序列還包括，將seqidno：17中第2-13位氨基酸中的任何一個或幾個去掉后所形成的新氨基酸序列。比如將第2-13位氨基酸全部去掉所形成的新序列如seqidno：20所示(實施例20)。

進一步，所述的兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶的具體氨基酸序列還包括，將seqidno：18中第181-192位氨基酸中的任何一個或幾個去掉后所形成的新氨基酸序列。比如將第181-192位氨基酸全部去掉所形成的新序列如seqidno：21所示(實施例21)。

進一步，所述的兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶的具體氨基酸序列還包括，由于使用了便于靶蛋白純化的pcoldi(takara公司)等分泌型原核或真核表達載體而在上述氨基酸序列的氨基端或羧基端引入該載體上的組氨酸純化標簽和其它的氨基酸等所形成的任何一個新型gpx-l-sod或sod-l-gpx。比如在序列seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21的氨基端引入pcoldi(takara公司)原核表達載體的組氨酸純化標簽和凝血因子xa切割位點的氨基酸后所形成的序列如seqidno：22、seqidno：23和seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26所示(實施例22-26)。

本發明所述的用中國專利201510431360.1公開的雜合trna制備高活力兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶，包括如下2種方法：

方法1：

先合成雜合trna及其上下游的啟動子和終止子對應的基因序列，組裝到分泌型原核表達載體的多克隆位點以外的合適位置，再合成需要表達的靶基因并組裝到該分泌型原核表達載體的多克隆位點上，轉化uag通讀工程菌(或普通表達工程菌)，通過雜合trna通讀uag為硒代半胱氨酸，從而用常規氨基酸進入肽鏈的方式將gpx的催化基團硒代半胱氨酸引入到底物結合部位，所表達蛋白上既有gpx和sod的底物結合部位，又有gpx和sod的催化基團和催中心，結果同時賦予其極高的gpx和sod活性，就產生了高活力的兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶。

方法2：

先合成雜合trna及其上下游的啟動子和終止子對應的基因序列，組裝到分泌型原核表達載體的多克隆位點以外的合適位置，再用pcr法擴增需要表達的gpx和sod基因及其兩者中間的連接短肽l，組裝到該分泌型原核表達載體的多克隆位點上，并用基因突變法將gpx中硒代半胱氨酸的編碼序列突變為tag，轉化uag通讀工程菌(或普通表達工程菌)，通過雜合trna通讀uag為硒代半胱氨酸，從而用常規氨基酸進入肽鏈的方式將gpx的催化基團硒代半胱氨酸引入到底物結合部位，所表達蛋白上既有gpx和sod的底物結合部位，又有gpx和sod的催化基團和催中心，結果同時賦予其極高的gpx和sod活性，就產生了高活力的兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶。

本發明的第一種方法是先在生物公司用dna合成儀人工合成本發明所述的trna的編碼基因和gpx-l-sod或sod-l-gpx基因，構建至能表達trna和gpx-l-sod或sod-l-gpx基因的原核分泌型表達載體上，在uag通讀工程菌c321.δa.exp(addgenecat.#49018)菌株中合成并攜帶sec至uag密碼子處，實現gpx-l-sod或sod-l-gpx的直接通讀表達。

1)、載體的構建：根據中國專利201510431360.1公開的雜合trna的堿基序列seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15或seqidno：16，在生物公司用dna合成儀人工合成對應的編碼基因，確保雜合trna基因的5′端含有lpp啟動子序列和特定的酶切位點，3′端含有rrnc終止子序列和特定酶切位點；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的雜合trna基因和用來表達該雜合trna的分泌型原核表達載體(如pcold系列等)，再用dna連接酶通過特定的酶切位點將雜合trna基因組裝到分泌型原核表達載體的多克隆位點以外，得到含有雜合trna的分泌型原核表達載體(如pcold-trna等)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點以外序列含有的而雜合trna基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的dna序列；

目的基因序列是將gpx-l-sod或sod-l-gpx(氨基酸序列如seqidno：17、seqidno：18、seqidno：19、seqidno：20、seqidno：21或seqidno：22、seqidno：23、seqidno：24、seqidno：25、seqidno：26)基因中硒代半胱氨酸的編碼序列替換為琥珀型終止密碼子tag后的基因，在生物公司用dna合成儀人工合成該目的基因序列對應的編碼基因，確保兩端都含有特定的酶切位點；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的gpx-l-sod或sod-l-gpx基因和上步獲得的含有雜合trna的分泌型原核表達載體(如pcold-trna等)，再用dna連接酶通過特定的酶切位點將gpx-l-sod或sod-l-gpx基因組裝到該分泌型原核表達載體的多克隆位點上；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而gpx-l-sod或sod-l-gpx基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的dna序列；

2)、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化：

用步驟1)中構建的含有雜合trna基因的和編碼序列中含tag的目的基因的表達載體轉化uag通讀工程菌-c321.δa.exp(addgenecat.#49018)的感受態細胞，涂含氨芐抗性的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；將陽性轉化子擴大培養后，在含有亞硒酸鈉的營養瓊脂培養基中，經iptg低溫4～25℃誘導表達，在雜合trna的識別下，將uag編碼為硒代半胱氨酸，直接表達出在底物gsh的結合部位含有硒代半胱氨酸的gpx突變體，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；抗性篩選獲得的菌株經37℃擴大培養后，轉至4～25℃誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(gsh)親和層析純化gpx-l-sod或sod-l-gpx蛋白，透析凍干后即得本發明所述的高活力gpx-l-sod或sod-l-gpx蛋白純品。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)和蛋白印跡(westernblot)鑒定目標蛋白。

該方法在uag通讀原核表達系統中，通過雜合trna攜帶sec到uag密碼子處，在重組gpx的底物結合部位引入了催化基團，因而產生高活力的兼具gpx和sod活性的雙功能抗氧化酶蛋白。

所述的用谷胱甘肽(gsh)親和層析純化gpx-l-sod或sod-l-gpx蛋白，是用ph7.5、50mmol/ltris-cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/lgsh的緩沖液洗脫目的蛋白。

所述的將液體低溫離心，是在4℃、8000～12000g條件下離心15～30min。

本發明的第二種方法是先在生物公司用dna合成儀人工合成本發明所述的trna的編碼基因，再利用pcr擴增法獲取gpx、l和sod編碼基因，構建至能表達trna和gpx-l-sod或sod-l-gpx基因的原核分泌型表達載體上之后，再通過定點突變將gpx-l-sod或sod-l-gpx基因中硒代半胱氨酸的編碼序列突變為tag，最后在uag通讀工程菌c321.δa.exp(addgenecat.#49018)菌株中合成并攜帶sec至uag密碼子處，實現gpx-l-sod或sod-l-gpx的直接通讀表達。

1)、表達載體的構建：

根據中國專利201510431360.1公開的雜合trna的堿基序列seqidno：1、seqidno：2、seqidno：3、seqidno：4、seqidno：5、seqidno：6、seqidno：7、seqidno：8、seqidno：9、seqidno：10、seqidno：11、seqidno：12、seqidno：13、seqidno：14、seqidno：15或seqidno：16，在生物公司用dna合成儀人工合成對應的編碼基因，確保雜合trna基因的5′端含有lpp啟動子序列和特定的酶切位點，3′端含有rrnc終止子序列和特定酶切位點；用相同的限制性核酸內切酶切割兩端含特定酶切位點的雜合trna基因和用來表達該雜合trna的分泌型原核表達載體(如pcold系列等)，再用dna連接酶通過特定的酶切位點將雜合trna基因組裝到分泌型原核表達載體的多克隆位點以外，得到含有雜合trna的分泌型原核表達載體(如pcold-trna等)；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點以外序列含有的而雜合trna基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的dna序列；

根據基因文庫中公開的gpx和sod的基因序列(參見ncbi,nm_000581.2、nm_002083.3、nm_002084.3、nm_002085.3、eu178106.1等)設計引物，擴增其編碼基因，在設計引物時，確保gpx基因的5′端含有起始密碼子(atg)，3′端不含終止密碼子，但含有gpx-l-sod中間的連接肽基因序列，sod基因的5′端引物有一部分與gpx基因的3′端引物重合，sod基因的3′端含終止密碼子，且gpx-l-sod基因兩端都含有特定的酶切位點，其它氨基酸序列不變；用重疊pcr擴增gpx-l-sod基因，回收分子量最大的產物片段即為gpx-l-sod基因；同理可獲得sod-l-gpx基因；用相同的限制性核酸內切酶切割gpx-l-sod或sod-l-gpx基因和上步獲得的含有雜合trna的分泌型原核表達載體(如pcold-trna等)，再用dna連接酶通過特定的酶切位點將gpx-l-sod或sod-l-gpx基因組裝到該分泌型原核表達載體的多克隆位點上；在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據gpx中唯一的硒代半胱氨酸和它比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，以硒代半胱氨酸的密碼子為中心，引物長25-50bp，用定點突變引物和快速定點突變試劑盒，將構建在原核表達載體上的gpx-l-sod或sod-l-gpx基因中的硒代半胱氨酸的編碼序列突變為tag，且無其它意外基因突變發生，確保突變后的基因能在uag通讀工程菌株中表達本發明所述的gpx-l-sod或sod-l-gpx酶蛋白；所述的特定的酶切位點可以是表達載體的多克隆位點中含有的而gpx-l-sod或sod-l-gpx基因中不存在的任何一個酶切位點，是載體上固有的由限制性核酸內切酶識別的堿基組成的dna序列；

2)、陽性轉化子的篩選及蛋白的表達與純化：

用步驟1)中構建的含有雜合trna基因的和編碼序列中含tag的目的基因的表達載體轉化uag通讀工程菌-c321.δa.exp(addgenecat.#49018)的感受態細胞，涂含氨芐抗性的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株；將陽性轉化子擴大培養后，在含有亞硒酸鈉的營養瓊脂培養基中，經iptg低溫4～25℃誘導表達，uag通讀工程菌無法終止uag密碼子，在雜合trna的識別下，將uag編碼為硒代半胱氨酸，直接表達出在底物gsh的結合部位含有硒代半胱氨酸的gpx-l-sod或sod-l-gpx，酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到菌體的周質腔里；抗性篩選獲得的菌株經37℃擴大培養后，轉至4～25℃誘導表達；收集、洗滌、冰浴下超聲破碎菌體、釋放酶蛋白，將液體低溫離心，去除菌體沉淀、獲得上清液；用谷胱甘肽(gsh)親和層析純化gpx-l-sod或sod-l-gpx蛋白，透析凍干后即得gpx-l-sod或sod-l-gpx蛋白純品。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)和蛋白印跡(westernblot)鑒定目標蛋白。

該方法在uag通讀原核表達系統中，通過雜合trna攜帶sec到uag密碼子處，在重組gpx-l-sod或sod-l-gpx的底物結合部位引入了催化基團，因而產生高活力的gpx-l-sod或sod-l-gpx酶蛋白。

所述的用谷胱甘肽(gsh)親和層析純化gpx-l-sod或sod-l-gpx蛋白，是用ph7.5、50mmol/ltris-cl平衡并洗脫雜蛋白，用含10mmol/lgsh的緩沖液洗脫目的蛋白。

所述的將液體低溫離心，是在4℃、8000～-12000g條件下離心15-30min。

本發明具有以下特點：

(1)本發明方法制備的gpx-l-sod或sod-l-gpx雙功能酶蛋白活力高，解決了sod分解超氧陰離子過程中，由于局部產生的過氧化氫濃度過高而導致的蛋白、dna和細胞膜損傷，細胞生物學實驗已證實其對過氧化氫和紫外線損傷的皮膚和心肌細胞有更強的保護作用。

(2)本發明使用簡單的基因合成或擴增、基因突變和原核表達等基因工程技術，實現了與20種常規氨基酸相同的方式將硒代半胱氨酸插入到gpx-l-sod或sod-l-gpx的活性部位，不僅制備方法簡單，而且解決了雙功能抗氧化酶來源有限的問題。

(3)本發明所述的gpx-l-sod或sod-l-gpx的抗氧化能力顯著高于以往報道的單功能gpx、sod和兼具兩者活性的雙功能模擬酶。

(4)本發明使用的分泌型表達載體，能將gpx-l-sod或sod-l-gpx酶蛋白以可溶性形式表達并分泌到大腸桿菌的周質腔，引導蛋白分泌表達的前導信號肽由菌體自動切除，所表達的蛋白為可溶性，具有天然蛋白的空間構象和更高的活性，不需復性，可避免包涵體復性過程造成的產率下降和失活，因而生產周期短。

(5)本發明通過新型雜合trna與uag通讀工程菌聯合應用，通過常規氨基酸進入肽鏈的方式實現硒代半胱氨酸在uag密碼子處的定點編碼與插入，從而提高通讀效率和產率，因此具有高效高產的雙重優勢。

這些優點均有利于大規模生產，為今后的實際應用打下了堅實的基礎，解決了天然雙功能抗氧化酶來源不足、性質不穩定和活力低的問題，在生物制藥方面有廣闊的應用前景。

附圖說明：

圖1：實施例1-13制備的gpx1的sds-page和(上)和westernblot(下)結果：其中m是蛋白分子量marker，1-13泳道是實施例1-13制備的靶蛋白。

圖2：實施例14-26制備的gpx1的sds-page和(上)和westernblot(下)結果：其中m是蛋白分子量marker，14-26泳道是實施例14-26制備的靶蛋白。

具體實施方式

實施例1：用合成的雜合trna序列1和靶基因聯合uag通讀原核表達系統制備基因工程人gpx1-l-apsod蛋白

根據中國專利201510431360.1公開的雜合trna序列1(seqidno：1)所述的trna堿基序列，在生物公司用dna合成儀人工合成能在uag通讀工程菌株中表達序列1(seqidno：1)所述雜合trna的基因序列，確保雜合trna基因的5′端含有lpp啟動子序列和clai酶切位點，3′端含有rrnc終止子序列和clai酶切位點，合成雜合trna序列1(seqidno：1)的基因序列如下：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatgtggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttcgcaggttcgaatcctgtcatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；用限制性核酸內切酶clai單酶切雜合trna的基因后，連接到同樣用clai單酶切的pcoldiii載體上(takara,cat.#3369，clai為pcoldiii多克隆位點以外的單獨存在酶切位點，在該處插入外源序列不影響載體本身其他功能)，所獲得的載體為pcoldiii-trna。

在生物公司用dna合成儀人工合成能在uag通讀工程菌株(c321.δa.exp)中通讀表達的gpx1-l-apsod基因(seqidno：17)，確保其5′端含有起始密碼子(atg)和ecori酶切位點，3′端含有終止密碼子和hindiii酶切位點，其第49位sec的編碼序列tga替換為琥珀型終止密碼子(tag)，用限制性核酸內切酶ecori和hindiii雙酶切后，連接到同樣用限制性核酸內切酶ecori和hindiii雙酶切的pcoldiii-trna載體上，構建的質粒為pcoldiii-trna-gpx1-l-apsod。

用裝有雜合trna和gpx1-l-apsod基因的載體(pcoldiii-trna-gpx1-l-apsod)轉化uag通讀工程菌c321.δa.exp的感受態細胞，涂含有100μg/mlamp的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株。將陽性轉化子接種于1.2l營養瓊脂培養基(含100μg/ml氨芐青霉素和50um亞硒酸鈉)中，在37℃空氣浴中160rpm震蕩培養至od600為0.5。將菌液置于30℃低溫搖床中80rpm震蕩培養5h，之后加入終濃度為0.1mmol/liptg，30℃振蕩培養5h，使gpx1-l-apsod蛋白以可溶性形式表達在菌體的周質腔里。收集菌體(6000rpm，10min)并用等體積的緩沖液t(50mmtris，ph7.5，含1mmedta)洗滌兩次。用緩沖液t重懸菌體沉淀，加入終濃度1mm的pmsf(苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4℃，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理gsh親合柱，應用緩沖液(50mmol/ltris含5mmol/lcu²⁺和zn²⁺，ph7.5)平衡，將上清液加入gsh親合柱上，用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用10mmol/lgsh洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得gpx1-l-apsod蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)和蛋白印跡(westernblot)鑒定靶蛋白，其分子量為41.8kda，且與抗gpx1抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖1的第1泳道。其gpx和sod活力分別為9896和8996u/umol蛋白，顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。高活力的gpx活性可避免因局部過氧化氫濃度過高導致的sod酶失活，同時gpx對底物過氧化氫的分解可以促進sod催化的超氧陰離子分解為過氧化氫的反應加速。實施例2-16：

用合成的雜合trna序列2-16和靶基因聯合uag通讀原核表達系統制備基因工程gpx1-l-apsod蛋白。具體方法與實施例1完全相同，只是分別根據中國專利201510431360.1公開的雜合trna的堿基序列2-16(seqidno：2-16)所述的trna堿基序列，在生物公司用dna合成儀人工合成能在uag通讀工程菌株中表達序列2-16(seqidno：2-16)所述雜合trna的基因，確保雜合trna基因的5′端含有lpp啟動子序列和clai酶切位點，3′端含有rrnc終止子序列和clai酶切位點，合成的具體基因序列序列分別是：

實施例2合成的能表達seqidno：2所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatgtggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttcgcaggttcgactcctgtcatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例3合成的能表達seqidno：3所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatgtggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttcgcaggttcgattcctgtcatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例4合成的能表達seqidno：4所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatgtggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttcgcaggttcgagtcctgtcatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例5合成的能表達seqidno：5所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatctggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttcgcaggttcgaatcctgtgatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例6合成的能表達seqidno：6所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatctggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttcgcaggttcgactcctgtgatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例7合成的能表達seqidno：7所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatctggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttcgcaggttcgattcctgtgatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例8合成的能表達seqidno：8所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatctggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttcgcaggttcgagtcctgtgatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例9合成的能表達seqidno：9所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatgtggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttctccggttcgaatccggacatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例10合成的能表達seqidno：10所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatgtggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttctccggttcgactccggacatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例11合成的能表達seqidno：11所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatgtggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttctccggttcgattccggacatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例12合成的能表達seqidno：12所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatgtggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttctccggttcgagtccggacatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例13合成的能表達seqidno：13所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatctggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttctccggttcgaatccggagatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例14合成的能表達seqidno：14所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatctggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttctccggttcgactccggagatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例15合成的能表達seqidno：15所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatctggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttctccggttcgattccggagatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例16合成的能表達seqidno：16所述的trna堿基序列的基因序列為：

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatctggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttctccggttcgagtccggagatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

實施例2-16制備的gpx1-l-apsod蛋白見圖1和圖2的第2-16泳道。其gpx活力分別為8715、7935、8713、8687、8696、8537、8332、8298、8205、8167、8215、8197、8186、8237、8359u/umol，sod活力分別為8802、8798、8991、8923、8857、8912、8884、8759、8925、8829、8906、8793、8869、8895、8972u/umol，顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。高活力的gpx活性可避免因局部過氧化氫濃度過高導致的sod酶失活，同時gpx對底物過氧化氫的分解可以促進sod催化的超氧陰離子分解為過氧化氫的反應加速。

實施例17：用合成的雜合trna和pcr法擴增的靶基因聯合uag通讀原核表達系統制備基因工程人gpx1蛋白。

根據中國專利201510431360.1公開的雜合trna序列1(seqidno：1)所述的trna堿基序列，在生物公司用dna合成儀人工合成能在uag通讀工程菌株中表達序列1(seqidno：1)所述雜合trna的基因，確保雜合trna基因的5′端含有lpp啟動子序列和clai酶切位點，3′端含有rrnc終止子序列和clai酶切位點(序列如下)

ccatcgatcccatcaaaaaaatattctcaacataaaaaactttgtgtaatacttgtaacgctgaattcggaagatgtggccgagcggttgaaggcaccggtctctaaaaccggcgacccgaaagggttcgcaggttcgaatcctgtcatcttccgccaggatcctctagagtcgacctgcagatccttagcgaaagctaaggattttttttatcgatgg；

用限制性核酸內切酶clai單酶切后，連接到同樣clai單酶切的pcoldiii載體上(takara,cat.#3369，clai為pcoldiii多克隆位點以外的單獨存在酶切位點，在該處插入外源序列不影響載體本身其他功能)，所獲得的載體為pcoldiii-trna。

用mrna小量提取試劑盒(sigma,cat#mrn-10)從人hepg-2(dsmz#acc180)肝癌細胞中提取mrna，在逆轉錄酶(amvrt,promega,cat#m5101)和oligo(dt)存在下，通過rt-pcr(逆轉錄聚合酶鏈反應)將其轉錄成cdna。根據基因文庫中公開的人gpx1和龐貝蠕蟲的sod(apsod)的基因(參見ncbi,nm_000581.2，eu178106.1)序列設計引物擴增其編碼基因，確保gpx基因的5′端引物含有起始密碼子(atg)和ndei酶切位點，3′端引物不含終止密碼子，但含有部分連接肽基因，apsod基因的5′端引物含有部分引導肽基因，apsod基因的3′端引物含有終止密碼子和hindiii酶切位點；具體的gpx的5′端引物是5’-ggaattccatatggctgctgctcggc-3’，3′端引物是5’-gagccacctccgcctgaaccgcctccacctgagccacctccgcctgaggcacagctgggcccttg-3’；具體的sod的5′端引物是5’-tcaggcggaggtggctcaggcggtggcggctca+atggctatccacgct-3’，3′端引物是5’-ggaattc+catatg+ttactccttggtaat-3’。利用重疊pcr擴增目的基因，回收分子量最大的基因片段，用限制性核酸內切酶ndei和hindiii雙酶切后，用dna連接酶連接到同樣酶切的pcoldiii(takara,cat.#3369)載體上，記為pcoldiii-trna-gpx1。在保持其它氨基酸序列不變的前提下，根據gpx1中49號sec比鄰的氨基酸的基因序列設計完全等長互補的兩條定點突變引物，引物長25-50bp，以49號sec的密碼子(tga)為中心。用這兩條完全互補的引物和快速定點突變試劑盒(invitrogen公司，按試劑盒說明書操作)，將構建在原核表達載體pcoldiii上的gpx1基因的第49號sec的編碼序列tga突變為琥珀密碼子(tag)，通過dna測序確定突變成功，且無其它意外基因突變發生。

用裝有雜合trna和gpx1-l-apsod基因的載體(pcoldiii-trna-gpx1)轉化uag通讀工程菌c321.δa.exp的感受態細胞，涂含有100μg/mlamp的營養瓊脂平板，篩選陽性菌株。將陽性轉化子接種于1.2l營養瓊脂培養基(含100μg/ml氨芐青霉素和50um亞硒酸鈉)中，在37℃空氣浴中160rpm震蕩培養至od600為0.6。將菌液置于30℃低溫搖床中80rpm震蕩培養5h，之后加入終濃度為0.1mmol/liptg，30℃振蕩培養5h，使gpx1蛋白以可溶性形式表達在菌體的周質腔里。收集菌體(6000rpm，10min)并用等體積的緩沖液t(50mmtris，ph7.5，含1mmedta)洗滌兩次。用緩沖液t重懸菌體沉淀，加入終濃度1mm的pmsf(苯甲基磺酰氟)，超聲破碎菌體，4℃，12000rpm離心30min，收集上清。按說明書處理gsh親合柱，應用緩沖液(50mmol/ltris含5mmol/lcu²⁺和zn²⁺，ph7.5)平衡,將上清液加入gsh親合柱上,用平衡緩沖液洗脫雜蛋白，用10mmol/lgsh洗脫目的蛋白。將洗脫液透析并凍干，即得gpx1-l-apsod蛋白。用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)和蛋白印跡(westernblot)鑒定靶蛋白，其分子量為41.8kda，且與抗gpx1抗體特異性結合，證明成功獲得了目標蛋白，見圖2的第17泳道。其gpx和sod活力分別為9768和8912u/umol，顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。高活力的gpx活性可避免因局部過氧化氫濃度過高導致的sod酶失活，同時gpx對底物過氧化氫的分解可以促進sod催化的超氧陰離子分解為過氧化氫的反應加速。

實施例18：

除將實施例1所用的靶基因換成seqidno：18外，其余與實施例1完全相同，即最終將獲得apsod-l-gpx1蛋白，即seqidno：18。該蛋白與gpx1-l-apsod具有相同的分子量，在sds-page和westernblot結果上可以看到，見圖2的第18泳道。其gpx和sod活力分別為10115和8607u/umol，其gpx活力略高于實施例1，顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。高活力的gpx活性可避免因局部過氧化氫濃度過高導致的sod酶失活，同時gpx對底物過氧化氫的分解可以促進sod催化的超氧陰離子分解為過氧化氫的反應加速

實施例19：

除將實施例1所用的靶基因換成seqidno：19外，其余與實施例1完全相同，即最終將獲得gpx1-l1-apsod蛋白，即seqidno：19。該蛋白較gpx1-l-apsod少一個第224位的絲氨酸，分子量僅差約0.11kda，在sds-page和westernblot結果上無明顯差異，見圖2的第19泳道。其gpx和sod活力分別為9205和8182u/umol，其gpx活力略低于實施例1，顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。高活力的gpx活性可避免因局部過氧化氫濃度過高導致的sod酶失活，同時gpx對底物過氧化氫的分解可以促進sod催化的超氧陰離子分解為過氧化氫的反應加速。

實施例20：

除將實施例1所用的靶基因換成seqidno：20外，其余與實施例1完全相同，即最終將獲得gpx1-1-l-apsod蛋白，即seqidno：20。該蛋白較gpx1-l-apsod少第2-13位的12個氨基酸，分子量僅差約1.23kda，在sds-page和westernblot上結果上略低于實施例1，見圖2的第20泳道。其gpx和sod活力分別為9706和8892u/umol，其gpx活力略低于實施例1，顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。高活力的gpx活性可避免因局部過氧化氫濃度過高導致的sod酶失活，同時gpx對底物過氧化氫的分解可以促進sod催化的超氧陰離子分解為過氧化氫的反應加速。

實施例21：

除將實施例18所用的靶基因換成seqidno：21外，其余與實施例18完全相同，即最終將獲得apsod-l-gpx1-1蛋白，即seqidno：21。該蛋白較apsod-l-gpx1少第181-192位的12個氨基酸，分子量僅差約1.23kda，在sds-page和westernblot上結果上略低于實施例18，見圖2的第21泳道。其gpx和sod活力分別為9996和8592u/umol，其gpx活力略低于實施例18，顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。高活力的gpx活性可避免因局部過氧化氫濃度過高導致的sod酶失活，同時gpx對底物過氧化氫的分解可以促進sod催化的超氧陰離子分解為過氧化氫的反應加速。

實施例22：

除將實施例1所用的表達載體pcoldiii(takara,cat.#3369)換成帶組氨酸純化標簽的pcoldi(takara,cat.#3367)，其余與實施例1完全相同，即最終將獲得帶標簽的gpx1-l-apsod蛋白，即seqidno：22。該蛋白在氨基端引入了載體上包括6個組氨酸簽和凝血因子xa切割位點在內的16個外源氨基酸，因此分子量較實施例1有所增加，在sds-page和westernblot結果上可以看到，見圖2的第22泳道，其優點是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其gpx和sod活力分別為9585和8782，略低于實施例1，證明純化標簽對蛋白的活力沒有明顯影響，活力仍顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。高活力的gpx活性可避免因局部過氧化氫濃度過高導致的sod酶失活，同時gpx對底物過氧化氫的分解可以促進sod催化的超氧陰離子分解為過氧化氫的反應加速。

實施例23：

除將實施例18所用的表達載體pcoldiii(takara,cat.#3369)換成帶組氨酸純化標簽的pcoldi(takara,cat.#3367)，其余與實施例18完全相同，即最終將獲得帶標簽的apsod-l-gpx1蛋白，即seqidno：23。該蛋白在氨基端引入了載體上包括6個組氨酸簽和凝血因子xa切割位點在內的16個外源氨基酸，因此分子量較實施例1有所增加，在sds-page和westernblot結果上可以看到，見圖2的第23泳道，其優點是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其gpx和sod活力分別為9785和8592，略低于實施例18，證明純化標簽對蛋白的活力沒有明顯影響，活力仍顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。

實施例24：

除將實施例19所用的表達載體pcoldiii(takara,cat.#3369)換成帶組氨酸純化標簽的pcoldi(takara,cat.#3367)，其余與實施例19完全相同，即最終將獲得帶標簽的gpx1-l1-apsod蛋白，即seqidno：24。該蛋白在氨基端引入了載體上包括6個組氨酸簽和凝血因子xa切割位點在內的16個外源氨基酸，因此分子量較實施例19有所增加，在sds-page和westernblot結果上可以看到，見圖2的第24泳道，其優點是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其gpx和sod活力分別為9103和8007，略低于實施例19，證明純化標簽對蛋白的活力沒有明顯影響，活力仍顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。

實施例25：

除將實施例20所用的表達載體pcoldiii(takara,cat.#3369)換成帶組氨酸純化標簽的pcoldi(takara,cat.#3367)，其余與實施例20完全相同，即最終將獲得帶標簽的gpx1-1-l-apsod蛋白，即seqidno：25。該蛋白在氨基端引入了載體上包括6個組氨酸簽和凝血因子xa切割位點在內的16個外源氨基酸，因此分子量較實施例20有所增加，在sds-page和westernblot結果上可以看到，見圖2的第25泳道，其優點是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其gpx和sod活力分別為9625和8632，略低于實施例20，證明純化標簽對蛋白的活力沒有明顯影響，活力仍顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。高活力的gpx活性可避免因局部過氧化氫濃度過高導致的sod酶失活，同時gpx對底物過氧化氫的分解可以促進sod催化的超氧陰離子分解為過氧化氫的反應加速。

實施例26：

除將實施例21所用的表達載體pcoldiii(takara,cat.#3369)換成帶組氨酸純化標簽的pcoldi(takara,cat.#3367)，其余與實施例21完全相同，即最終將獲得帶標簽的apsod-l-gpx1-1蛋白，即seqidno：26。該蛋白在氨基端引入了載體上包括6個組氨酸簽和凝血因子xa切割位點在內的16個外源氨基酸，因此分子量較實施例21有所增加，在sds-page和westernblot結果上可以看到，見圖2的第26泳道，其優點是也可以用鎳親和層析純化靶蛋白。其gpx和sod活力分別為9865和8192，略低于實施例21，證明純化標簽對蛋白的活力沒有明顯影響，活力仍顯著高于以往報道的雙功能酶的gpx活力。

〈110〉吉林大學

〈120〉兼具谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性的雙功能抗氧化酶及其制備方法

〈160〉26

〈210〉1

〈211〉90

〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

〈400〉1

ggaagauguggccgagcgguugaaggcaccggucucuaaaaccggcgacccgaaaggguu60

cgcagguucgaauccugucaucuuccgcca90

〈210〉2

〈211〉90

〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

〈400〉2

ggaagauguggccgagcgguugaaggcaccggucucuaaaaccggcgacccgaaaggguu60

cgcagguucgacuccugucaucuuccgcca90

〈210〉3

〈211〉90

〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

〈400〉3

ggaagauguggccgagcgguugaaggcaccggucucuaaaaccggcgacccgaaaggguu60

cgcagguucgauuccugucaucuuccgcca90

〈210〉4

〈211〉90

〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

〈400〉4

ggaagauguggccgagcgguugaaggcaccggucucuaaaaccggcgacccgaaaggguu60

cgcagguucgaguccugucaucuuccgcca90

〈210〉5

〈211〉90

〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

〈400〉5

ggaagaucuggccgagcgguugaaggcaccggucucuaaaaccggcgacccgaaaggguu60

cgcagguucgaauccugugaucuuccgcca90

〈210〉6

〈211〉90

〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

〈400〉6

ggaagaucuggccgagcgguugaaggcaccggucucuaaaaccggcgacccgaaaggguu60

cgcagguucgacuccugugaucuuccgcca90

〈210〉7

〈211〉90

〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

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〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

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〈213〉人工序列

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〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

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〈223〉反密碼子

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〈223〉反密碼子

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〈213〉人工序列

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〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

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〈220〉

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〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

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〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

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〈210〉14

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〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

〈400〉14

ggaagaucuggccgagcgguugaaggcaccggucucuaaaaccggcgacccgaaaggguu60

cuccgguucgacuccggagaucuuccgcca90

〈210〉15

〈211〉90

〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

〈400〉15

ggaagaucuggccgagcgguugaaggcaccggucucuaaaaccggcgacccgaaaggguu60

cuccgguucgauuccggagaucuuccgcca90

〈210〉16

〈211〉90

〈212〉rna

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉trna

〈222〉(1)...(90)

〈223〉由大腸桿菌sert堿基序列和selc堿基序列雜合得到，用于搬運sec

〈220〉

〈221〉misc_feature

〈222〉（36）...(38)

〈223〉反密碼子

〈220〉

〈221〉stem_loop

〈222〉(62)...(78)

〈223〉形成trna的t-arm和t-loop

〈400〉16

ggaagaucuggccgagcgguugaaggcaccggucucuaaaaccggcgacccgaaaggguu60

cuccgguucgaguccggagaucuuccgcca90

〈210〉17

〈211〉382

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（1)...(382）

〈223〉將人gpx1和龐貝蠕蟲sod的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（204-229）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（49）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉17

metcysalaalaargleualaalaalaalaalaalaalaglnser

151015

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202530

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170175180

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200205210

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380

〈210〉18

〈211〉382

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（1)...(382）

〈223〉將龐貝蠕蟲sod和人gpx1的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（154-179）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（228）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉18

metalailehisalavalcysvalleulysglyaspserproval

151015

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202530

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354045

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505560

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95100105

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110115120

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125130135

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140145150

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230235240

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245250255

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275280285

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290295300

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320325330

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380

〈210〉19

〈211〉376

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（1)...(381）

〈223〉將人gpx1和龐貝蠕蟲sod的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（204-228）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（49）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉19

metcysalaalaargleualaalaalaalaalaalaalaglnser

151015

valtyralapheseralaargproleualaglyglygluproval

202530

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354045

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657075

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140145150

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155160165

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170175180

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185190195

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200205210

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215220225

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230235240

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245250255

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260265270

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290295300

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335340345

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350355360

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365370375

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380

〈210〉20

〈211〉370

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（1)...(370）

〈223〉將人gpx1和龐貝蠕蟲sod的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（192-217）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（37）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉20

metglnservaltyralapheseralaargproleualaglygly

151015

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202030

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354045

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505560

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657075

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140145150

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155160165

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170175180

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185190195

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200205210

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215220225

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230235240

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245250255

proglylyshisglyphehisvalhisglupheglyaspasnthr

260265270

asnglycysthrseralaglyglyhispheasnprohisglylys

275280285

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290295300

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305310315

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320325330

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335340345

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350355360

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365370

〈210〉21

〈211〉370

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（1)...(370）

〈223〉將龐貝蠕蟲sod和人gpx1的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（154-179）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（216）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉21

metalailehisalavalcysvalleulysglyaspserproval

151015

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202530

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354045

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505560

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657075

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110115120

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125130135

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140145150

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155160165

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170175180

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185190195

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200205210

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215220225

metasngluleuglnargargleuglyproargglyleuvalval

230235240

leuglypheprocysasnglnpheglyhisglngluasnalalys

245250255

asnglugluileleuasnserleulystyrvalargproglygly

260265270

glyphegluproasnphemetleupheglulyscysgluvalasn

275280285

glyalaglyalahisproleuphealapheleuargglualaleu

290295300

proalaproseraspaspalathralaleumetthraspprolys

305310315

leuilethrtrpserprovalcysargasnaspvalalatrpasn

320325330

pheglulyspheleuvalglyproaspglyvalproleuargarg

335340345

tyrserargargpheglnthrileaspilegluproaspileglu

350355360

alaleuleuserglnglyprosercysala

365370

〈210〉22

〈211〉398

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（-15)...(382）

〈223〉將人gpx1和龐貝蠕蟲sod的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（204-229）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（49）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉22

metasnhislysvalhishishishishishisilegluglyarghis

-15-10-5

metcysalaalaargleualaalaalaalaalaalaalaglnser

151015

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202530

serleuglyserleuargglylysvalleuleuilegluasnval

354045

alaserleuxaaglythrthrvalargasptyrthrglnmetasn

505560

gluleuglnargargleuglyproargglyleuvalvalleugly

657075

pheprocysasnglnpheglyhisglngluasnalalysasnglu

808590

gluileleuasnserleulystyrvalargproglyglyglyphe

95100105

gluproasnphemetleupheglulyscysgluvalasnglyala

110115120

glyalahisproleuphealapheleuargglualaleuproala

125130135

proseraspaspalathralaleumetthraspprolysleuile

140145150

thrtrpserprovalcysargasnaspvalalatrpasnpheglu

155160165

lyspheleuvalglyproaspglyvalproleuargargtyrser

170175180

argargpheglnthrileaspilegluproaspileglualaleu

185190195

leuserglnglyprosercysalaserglyglyglyglysergly

200205210

glyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly

215220225

glyglyglysermetalailehisalavalcysvalleulysgly

230235240

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245250255

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380

〈210〉23

〈211〉398

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（-15)...(382）

〈223〉將龐貝蠕蟲sod和人gpx1的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（154-179）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（228）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉23

metasnhislysvalhishishishishishisilegluglyarghis

-15-10-5

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151015

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380

〈210〉24

〈211〉397

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（-15)...(381）

〈223〉將人gpx1和龐貝蠕蟲sod的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（204-228）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（49）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉24

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-15-10-5

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140145150

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155160165

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230235240

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245250255

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260265270

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275280285

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290295300

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320325330

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335340345

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350355360

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365370375

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380

〈210〉25

〈211〉386

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（-15)...(370）

〈223〉將人gpx1和龐貝蠕蟲sod的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（192-217）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（37）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉25

metasnhislysvalhishishishishishisilegluglyarghis

-15-10-5

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170175180

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200205210

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215220225

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230235240

gluglyaspmetvalthrvalthrglygluilethrglyleuthr

245250255

proglylyshisglyphehisvalhisglupheglyaspasnthr

260265270

asnglycysthrseralaglyglyhispheasnprohisglylys

275280285

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290295300

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305310315

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320325330

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335340345

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350355360

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365370

〈210〉26

〈211〉386

〈212〉prt

〈213〉人工序列

〈220〉

〈221〉chain

〈222〉（-15)...(370）

〈223〉將龐貝蠕蟲sod和人gpx1的氨基酸序列經短肽連接而成，作為高活力及超穩定的雙功能抗氧化酶

〈220〉

〈221〉連接肽

〈222〉（154-179）

〈223〉由甘氨酸和絲氨酸組成

〈220〉

〈221〉act_site

〈222〉（216）

〈223〉硒代半胱氨酸

〈400〉26

metasnhislysvalhishishishishishisilegluglyarghis

-15-10-5

metalailehisalavalcysvalleulysglyaspserproval

151015

thrglythrilehisleulysglugluglyaspmetvalthrval

202530

thrglygluilethrglyleuthrproglylyshisglyphehis

354045

valhisglupheglyaspasnthrasnglycysthrseralagly

505560

glyhispheasnprohisglylysgluhisglyalaprogluasp

657075

gluasnarghisalaglyaspleuglyasnvalvalalaglyglu

808590

aspglylysalavalileasnmetlysasplysleuvallysleu

95100105

thrglyproaspservalileglyargthrleuvalvalhisval

110115120

aspgluaspaspleuglyargglyglyhisgluglnserlysile

125130135

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140145150

thrlysgluserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly

155160165

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170175180

glnservaltyralapheseralaargproleualaglyglyglu

185190195

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200205210

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215220225

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230235240

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245250255

asnglugluileleuasnserleulystyrvalargproglygly

260265270

glyphegluproasnphemetleupheglulyscysgluvalasn

275280285

glyalaglyalahisproleuphealapheleuargglualaleu

290295300

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305310315

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320325330

pheglulyspheleuvalglyproaspglyvalproleuargarg

335340345

tyrserargargpheglnthrileaspilegluproaspileglu

350355360

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365370