來源于大豆的根特異性啟動子GmTIPp-1546及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種來源于大豆的根特異性啟動子GmTIPp-1546及其應用。
【背景技術】
[0002] 啟動子是基因的組成部分，控制基因表達的起始和表達程度。在轉基因育種中，夕卜 源基因在植物體中的精確調控主要是通過合適的啟動子實現的。目前，在基因工程中廣泛 使用的是組成型啟動子，但是由于組成型啟動子驅使目的基因在植物組織中的表達是恒定 和持續的，不受時空和外界因素的限制，會過度消耗細胞內的物質和能量，產生大量異源蛋 白質或代謝產物，破壞了植物原有的生理代謝平衡，導致植物生長異常甚至死亡。與組成型 啟動子相比，根特異性啟動子它所驅動的外源基因在受體植物根中表達，克服了組成型啟 動子由于持續、高效的啟動外源基因非特異性表達而造成的細胞物質的過度消耗。隨著轉 基因植物安全標準的提高，包括所有商業化轉基因農作物在內，要求必須對所用啟動子的 表達活性、潛在重組能力、對周邊環境以及安全性影響進行詳細的研究。
[0003] 大豆是一種重要的糧油飼兼用作物，在我國大豆產區大多處于干旱、鹽堿及高寒 等區域，應用的大豆品種耐逆性不強，嚴重的旱澇病蟲害等非生物和生物逆境脅迫顯著影 響大豆產量。目前在轉基因大豆中使用的都是CaMV35S啟動子，根特異啟動子應用到大豆 轉基因中，為大豆轉基因研究提供更加豐富的啟動子元件，同時也為培育耐旱、耐鹽、耐冷 等轉基因大豆新品種提供一種手段。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種具有啟動子功能的DNA分子。
[0005] 本發明所提供的具有啟動子功能的DNA分子，來源于豆科大豆屬栽培大豆 (Glycine max (L. )Merr· ) Williams82,是下述 a) -c)中任一 DNA 片段：
[0006] a)至少含有序列表中序列2的第509-2054位核苷酸序列，并且從序列2的第509 位開始按照序列2的核苷酸序列向序列2的5'端延長，得到長度為1546至2054bp的任意 一個DNA片段；
[0007] b)與a)限定的核苷酸序列具有90%以上同源性，且具有啟動子功能的DNA片段；
[0008] c)在嚴格條件下與a)或b)限定的核苷酸序列雜交，且具有啟動子功能的DNA片 段。
[0009] 上述嚴格條件可為在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65°C下雜交，然后用2XSSC， 0· 1%SDS 和 I X SSC，(λ 1%SDS 各洗膜一次。
[0010] 所述啟動子的最后一位核苷酸是序列2的第2054位。
[0011] 在本發明中，所述具有啟動子功能的DNA分子為序列表中序列2的第509-2054位 核苷酸所示的DNA分子，命名為GmTIPp-1546。
[0012] 其中，序列2由2054個核苷酸組成，為序列1的第1-2054位。
[0013] 含有所述DNA分子(啟動子)的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于本 發明的保護范圍。
[0014] 在本發明中，所述重組載體為在PC13P1載體的多克隆位點（如Kpn I和Pst I) 插入所述DNA分子得到的重組質粒。
[0015] 所述pC13Pl載體是以pCAMBIA1301載體為基礎改造得到的環形載體，所述pC13Pl 載體上不含有任何啟動子的序列，用來滿足研究啟動子功能的需要。
[0016] 具體的,所述PC13P1載體的序列如序列表中序列3所示。
[0017] 所述表達盒可以由具有啟動子功能的所述DNA分子，由所述DNA分子啟動表達的 目的基因，以及轉錄終止序列組成；所述DNA分子以功能性方式與所述目的基因連接，且所 述目的基因與所述轉錄終止序列連接。
[0018] 在本發明的一個實施例中，所述目的基因具體為⑶S基因（來源于所述pC13Pl載 體）；所述轉錄終止序列具體為NOS轉錄終止子(來源于所述pC13Pl載體)。
[0019] 所述DNA分子在植物中啟動目的基因表達中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0020] 在所述應用中，所述表達為根特異性表達。
[0021] 進一步，所述根特異性表達為根中高表達，具體為根中的表達量顯著高于其他組 織(如葉柄、葉片主脈、花、果莢外殼)，在其他組織中表達量極低。
[0022] 在所述應用中，所述目的基因可為GUS基因。所述植物可為雙子葉植物或單子葉 植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥或大豆。
[0023] 在本發明的一個實施例中，所述植物具體為擬南芥（Arabidopsis thaliana(L.) Heynh. ) Columbia。
[0024] 另外，擴增所述DNA分子(啟動子）的引物對也屬于本發明的保護范圍。
[0025] 在本發明中，擴增所述DNA分子(啟動子）的引物對為如下：
[0026] 5'-GGTACCGAGTATAAAACCCAAAATC-3' ；
[0027] 5'-CTGCAGTTTGGCACCTCACCTCAC-3' 。
[0028] 實驗證明，本發明所提供的GmTIPp-1546啟動子能夠有效啟動目的基因在根中的 特異性表達。本發明為植物在根部的分子改良提供了一種手段，對植株的抗逆研究就有一 定意義，在農業領域具有廣闊的應用空間和市場前景。
【附圖說明】
[0029] 圖1為第一輪PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖。箭頭所示為目的條帶。
[0030] 圖2為第二輪PCR產物GmTIPp-2054的瓊脂糖凝膠電泳圖。箭頭所示為目的條帶。
[0031] 圖3為GmTIPp-2054和GmTIPp-1546啟動子的PCR檢測結果。其中，泳道M為 DL2000plus的DNA分子量標準；泳道1、2分別為用引物對F-2054/R和F-1546/R進行PCR 擴增所得的PCR產物的電泳圖。
[0032] 圖 4 為重組質粒 pMD18-GmTIPp-2054 和 pMD18-GmTIPp-1546,以及 pC13Pl 載體的 Kpn I和Pst I雙酶切電泳圖。其中，泳道M為DL2000plus的DNA分子量標準；泳道1、2、 3 分別為 pMD18-GmTIPp-2054、pMD18-GmTIPp-1546 和 pPC13Pl。
[0033] 圖5為pC13Pl載體的質粒圖譜。
[0034] 圖6為pC13 (Delta)⑶S載體的質粒圖譜。
[0035] 圖7為轉基因擬南芥T1代的分子檢測結果。其中，A、B分別代表轉 pCAM-TIPp-2054、pCAM-TIPp-1546 擬南芥植株檢測結果。A 和 B 中，泳道 M 為 DL2000plus 的DNA分子量標準；泳道CK+為陽性對照；泳道CK-為陰性對照；其他泳道分別為不同轉基 因株系，有目的條帶(箭頭所示位置）出現的為陽性。
[0036] 圖8為轉基因擬南芥T3代的營養生長階段不同發育時期GUS染色結果。
[0037] 圖9為轉基因擬南芥T3代的生殖生長階段不同發育時期⑶S染色結果。
[0038] 圖10為轉基因擬南芥T3代的植株根和葉中的GUS活性定量測定結果。其中，WT 表示未轉基因的野生型擬南芥Columbia ;T2054-7、T2054-10、T2054-18是三株鑒定陽性 的轉pCAM-TIPp-2054擬南芥植株；T1546-19、T1546-43和T1546-45是三株鑒定陽性的轉 pCAM-TIPp-1546擬南芥植株。
【具體實施方式】
[0039] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0040] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0041] 下述實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。下述實施例中的 引物合成及測序工作均由華大公司完成。
[0042] 栽培大豆（Glycine max(L. )Merr. ) Williams82 :記載于"許碩·野生大豆鹽脅迫 相關microRNA的功能分析.2011年中國農業科學院碩士論文"一文，由中國農業科學院作 物科學研究所供給。
[0043] pC13Pl載體和pC13 (Delta)⑶S載體：均為環形載體，由中國科學院亞熱帶農業 生態研究所Pedro S. C. F. Rocha研究員提供。pC13Pl載體上不含有任何啟動子，但含有⑶S 報告基因(如圖5) ;pC13 (Delta)⑶S載體不含有⑶S基因，但含有卡那霉素抗性和潮霉素 抗性(如圖6)。所述pC13Pl載體的序列如序列表中序列3所示；所述pC13 (Delta)⑶S載 體的序列如序列表中序列4所示。
[0044] 擬南芥（Arabidopsis thaliana(L. )Heynh. ) Columbia :記載于"郭曉_ · Columbia 型擬南芥愈傷組織培養研究.河南農業科學，2009年01期"一文，由中國農業科學院作物科 學研究所供給。
[0045] 根癌農桿菌GV3101 :記載于"趙湛，李文生.不同根癌農桿菌菌株類型對木霉菌 遺傳轉化效率的影響.北方園藝，2006年03期" 一文，由中國農業科學院作物科學研究所 供給。
[0046] 實施例1、GmTIPp全長啟動子的克隆及序列測定
[0047] 以栽培大豆（Glycine max(L. )Merr. ) Williams82為材料，采用CTAB法提取大豆 根系基因組DNA。根據大豆基因組數據庫查找TIP基因及其上游序列，設計特異引物上游引 物Fl和下游引物R1，以提取的總DNA為模板，進行PCR擴增。