桑枝中具酪氨酸酶抑制作用有效部位制備方法及其應用
【專利摘要】本發明公開了桑枝中具酪氨酸酶抑制作用有效部位制備方法及其應用，屬于醫藥和食品技術領域。本發明提供的桑枝中具酪氨酸酶抑制作用有效部位，包括五種從桑枝中提取的具有酪氨酸酶抑制活性的多酚類化合物，包括：氧化白藜蘆醇，草大戟素，桑辛素M，2，4，2'，4'?四羥基查爾酮，摩查爾酮A。能夠有效用于果蔬的酶促褐變的抑制，化妝品中的美白，以及用于預防和治療黑色素過多導致的人體色素沉著性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病癥藥物的各種制劑。
【專利說明】
桑枝中具酪氨酸酶抑制作用有效部位制備方法及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及桑枝中具酪氨酸酶抑制作用有效部位制備方法及其應用，屬于醫藥和 食品技術領域。
【背景技術】
[0002] 桑枝，為桑樹的枝葉、桑枝、桑條、嫩桑枝的總稱，在我國大部分地方廣泛分布和種 植;主產江蘇、浙江、安徽、湖南、河北、四川等地。現代藥理學研究表明，從該植物中獲得的 一些成分具有抗炎、抗氧化、抗癌等諸多藥理作用。桑枝化學成分有黃酮，萜類，二苯乙烯 類，長鏈脂肪酸類等。桑枝提取物對酪氨酸酶和B-16黑色素細胞中黑色素的合成具有抑制 作用，但到目前為止，桑枝中對酪氨酸酶具有抑制作用的成分一直不清楚。
[0003] 酪氨酸酶為黑色素合成的關鍵酶，其表達和活性與果蔬的褐變和人體色素沉著性 疾病密切相關。因此，酪氨酸酶抑制劑可作為黑色素抑制劑應用于食品、化妝品、醫藥等領 域。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的首先在于提供一種具酪氨酸酶抑制活性的有效部位，是從桑枝中提 取的具有較強酪氨酸酶抑制活性的含有五種多酚類化合物的有效部位，所述五種多酚類化 合物是氧化白藜蘆醇、草大戟素、桑辛素 M，以及2,4,2'，4'_四羥基查爾酮，摩查爾酮A，其結 構分別如下：
[0005
[0006] 本發明的另外一個目的是提供所述具酪氨酸酶抑制活性的有效部位的制備方法， 通過以下步驟實現：
[0007] (1)桑枝粉碎后用2倍質量的70 %乙醇浸沒超聲提取3次，每次1小時，提取液減壓 濃縮至干燥物，稱重；
[0008] (2)干燥物用95%乙醇溶解，過濾；
[0009] (3)步驟(2)所得過濾液與大孔樹脂DlOl混合拌樣，減壓濃縮至干;其中，過濾液的 用量按過濾液中所含固體提取物的質量與大孔樹脂DlOl的質量比例為1:2來設定；
[0010] ⑷將上述攪拌物上D101大孔樹脂，分別用8倍柱體積量的20 %、40 %、60%、80 %、 95%乙醇洗脫。
[0011] 步驟(4)收集40 %乙醇洗脫部分8個體積，濃縮得干燥樣品，稱重，干燥樣品進一步 用硅膠柱層析分離，先后分別用30倍柱體積的體積比30:1的二氯甲烷-甲醇和體積比50:1 的二氯甲烷-甲醇洗脫，先后分別得到組分A和組分B，組分A用凝膠柱層析進行分離，體積比 1:1的甲醇-水洗脫，即得氧化白藜蘆醇和2,4,2'，4'-四羥基查爾酮;組分8用凝膠柱層析進 行分離，體積比1:1的甲醇-水洗脫，即得草大戟素、桑辛素 M、摩查爾酮A。
[0012] 本發明的另外一個目的是提供所述的具有酪氨酸酶抑制活性的化合物及其有效 部位在制備抗果蔬酶促褐變抑制劑、化妝品美白劑、預防和治療黑色素異常導致的人體色 素沉著性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病癥的藥物中的應用。
[0013] 本發明的五種從桑枝中提取的具有酪氨酸酶抑制活性的多酚類化合物及其有效 部位可以作為活性成分，不加或加入食品添加劑輔料，化妝品輔料或藥劑上接受的輔料，按 照相應劑型的制備方法制成制劑。
[0014] 所述的劑型包括固體粉末、水溶液、醇溶液、乳液、面膜、巴布劑、注射液、滴注液、 粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、口含 劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、□崩劑、微丸等。
[0015] 本發明的有益之處在于:提供含有五種從桑枝中提取的具有酪氨酸酶抑制活性的 多酚類化合物的有效部位，具有比桑枝提取物具有更強的活性，制成相應制劑易于質量控 制，可在抗果蔬酶促褐變抑制劑、化妝品美白劑、預防和治療黑色素異常導致的人體色素沉 著性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病癥的藥物中的應用。
【附圖說明】
[0016] 圖1為桑枝粗提取物和有效部位的高效液相色譜對照圖
[0017] 圖2為蘋果切片用各種溶液處理后抗褐變的a*值(初始用5%乙醇溶解）
【具體實施方式】
[0018] 下面將結合實施例進一步詳細說明本發明的實質內容和有益效果，這些實施例僅 用于說明本發明而非對本發明的限制。此外，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限 定的范圍。
[0019] 實施例1有效部位的制備
[0020] 將10公斤桑枝用2倍量70%乙醇超聲波提取3次，每次lh，減壓濃縮至干燥，稱重。 取適量干燥物用95%乙醇溶解，過濾，加入大孔樹脂DlOl中，自然晾干或減壓蒸干，然后上 大孔樹脂D101層析柱，分別用8個柱體積的20 %、40 %、60 %、80 %、95 %乙醇洗脫，收集洗脫 液，分別減壓回收乙醇至干，40%洗脫部分用高效液相色譜檢測，含有五個化合物氧化白藜 蘆醇、草大戟素、桑辛素 M、2,4,2'，4'_四羥基查爾酮、摩查爾酮A的組分為有效部位部分(圖 1)〇
[0021] 高效液相檢測條件：
[0022] 儀器:Waters 1525液相色譜儀配以紫外檢測器(2487)。
[0023] 色譜柱：Alltima C18(250X4.6mm，5ym)〇
[0024] 流動相:A相：含0.1 %甲酸的去離子水;B相：甲醇。線性洗脫梯度:Omin，10 %B; 2011^11，30%8;3011^11，50%8;4011^11，70%8 ;5011^11，100%8。流速：1.01111711^11，檢測波長： 280nm〇
[0025] 實施例2氧化白藜蘆醇和2,4,2'，4'_四羥基查爾酮的制備
[0026]桑枝的提取，大孔樹脂分離過程同實施例1，收集40 %乙醇洗脫部分8個柱體積，濃 縮干燥得樣品，稱重，用200-300目硅膠柱層析分離，分別用體積比為50:1和30:1的氯仿-甲 醇洗脫，收集體積比為30:1的氯仿-甲醇洗脫得到的洗脫液，再用Sephadex LH-20凝膠柱層 析進行分離，體積比1:1的甲醇-水洗脫，即得。
[0027] 氧化白藜蘆醇的核磁共振光譜數據如下：
[0028] 4^^(40010^,00300)5:7.32(111,(1,1 = 9.1^,11-6),7.26(111,(1,1=16.4?,!!-7)，6.81(lH，d，J=16.4Hz，H-8)，6.45(2H，d，J = 2.0Hz，H-2,，6，），6.31(2H，overlap，H-3， 5) ,6.14( lH，t，J = 2.OHz，H-4'）· 13C NMR(100MHz，CD30D)S :159.8(C，C-3'，5'），159.4(C，C-4)，157.6(C，C-2)，142.5(C，C-1，），128.7(CH，C-6)，126.8(CH，C-8)，125.1(CH，C-7)，118.1 (C，C-l)，108.7(CH，C-5)，106.0(CH，C-2,，6'），103.9(CH，C-3)，102.6(CH，C-4'）。
[0029] ESI-MS:m/z 243.1 [M_H] - (Ci4Hii〇4)。
[0030] 結構解析表明該化合物為氧化白藜蘆醇。
[0031] 2,4,2'，4'_四羥基查爾酮的核磁共振光譜數據如下：
[0032] 1H NMR(Acetone-Cl6，400MHz)δ: 13 · 797(IH，s，0H-2，），9 · 690(IH，0H-4)，9 · 490(IH， s，0H-2)，9·163(1Η，0Η-4，），8.211 (lH，d，J= 15 ·6Ηζ，Η-α) ,8.007( lH，d，J = 9.2Hz，Η-6)， 7.775(lH,d J= 15.4Hz,Η-β), 7.667( lH,d,J = 8.8Hz,^6^,6.521 (lH,d,J = 2.0Hz,H-3), 6.441(lH,dd ,J = 8.8,2.4Hz,H-5) ,6.431 (lH,dd ,J = 8.4,2.4Hz ,H-5') ,6.345( lH,d J = 2.4Hz，H-3'）；13C NMR(Acetone-d6，100MHz)S:193.31(C = 0), 167.60(C，C-4'），165.62(C, C-2'），162.63(C，C-4)，16O.3O(C，C-2)，141.25(CH，C-0)，132.96(CH，C-6)，131.79(CH，C-6，），117.24(CH，C-a)，115.17(C，C-r)，114.61(C，C-1)，109.21(CH，C-5)，108.70(CH，C-5'），103.86(CH，C-3'），103.76(CH，C-3)。
[0033] ESI-MS:m/z 271.1 [M_H] - (Ci5Hii〇5)。
[0034] 結構解析表明該化合物為2,4,2'，4'_四羥基查爾酮。
[0035] 實施例3草大戟素，桑辛素 M和摩查爾酮A的制備
[0036]桑枝的提取，大孔樹脂分離過程同實施例1，收集40 %乙醇洗脫部分8個柱體積，濃 縮干燥得樣品，稱重，用200-300目硅膠柱層析分離，分別用體積比為50:1和30:1的氯仿-甲 醇洗脫，收集以體積比為50:1的氯仿-甲醇洗脫得到的洗脫液，再用Sephadex LH-20凝膠柱 層析進行分離，體積比1:1的甲醇-水洗脫，即得草大戟素、桑辛素 M和摩查爾酮A。
[0037] 草大戟素的核磁共振光譜數據如下：
[0038] 1H NMR(Acetone-d6,400MHz)5：12.210(lH,0H-5),9.019(2H,0H),7.290(lH,dJ = 8·4Ηζ，Η-6'），6.465(lH，d，J = 2.4Hz，H-2'），6.415(lH，dd，J = 8.4,2.4Hz，H-5'），5.955 (lH，d，J = 2.0Hz，H-8)，5.936(lH，d，J = 2.0Hz，H-6) ,5.692(lH，dd，J= 13.2,2.8Hz，H-2)， 3· 163(lH，dd，J= 17.2,13.2Hz，H-3) ,2.703(lH，dd，J= 17.2,2·8Ηζ，Η-3) ;13C NMR (Acetone-d6,100MHz)5：197.8(C=0,C-4),167.6(C,C-7),165.3(C,C-5),164.9(C,C-9), 159.7(C，C-2'），156.5(C，C-4'），129.0(CH，C-6'），117.3(C，C-l'），107.9(CH，C-5'），103.6 (CH，C-3'），103.1(C，C-10)，96.8(CH，C-6)，95.9(CH，C-8)，75.4(CH，C-2)，42.7(CH2，C-3)。
[0039] ESI-MS :m/z[M-H]-287 · I (Ci5HiiO6)。
[0040] 結構解析表明該化合物為草大戟素。
[0041 ]桑辛素 M的核磁共振光譜數據如下：
[0042] 1H NMR(Acetone-d6,400MHz)5：8.60(3H,br s ,0H), 7.40( 1H, d ,J = 8.4Hz ,H-4), 7.20(lH，s，H-3)，6.99(lH，d，J = 2.0Hz，H-7)，6.86(2H，d，J = 2.0Hz，H-2'，6'），6·81(1Η, dd，J = 8.4,2.0Hz，H-5)，6.37(lH，t，J = 2.0Hz，H-4'）；13C 匪R(Acetone-d6，100MHz)S: 159.83(C，C-3'，5'），156.78(C，C-7a)，156.71(C，C-2)，155.58(C，C-6)，133.47(C，C-1'）， 100.8(CH,C-3),122.65(C,C-3a),122.09(CH,C-4), 113.31(CH,C-5),98.51(CH,C-3), 103.92(CH，C-2'，6'），103.61(CH，C-7)，102.42(CH，C-4'）。
[0043] ESI-MS:m/z 241.0[M-H] - (Ci4H9〇4)。
[0044] 結構解析表明該化合物為桑辛素 M。
[0045] 摩查爾酮A的核磁共振光譜數據如下：
[0046] 1H NMR(Acetone-d6,400MHz)S:14.155(lH，br s，0H-2,），9.381，9·081(3Η，0Η-4,， 2,4)，8.213(lH，d，J=15.6Hz，H-a)，7.875(lH，d，J = 9.2Hz，H-6'），7.785(lH，d，J = 15·2Ηζ，Η-β) ,7.667( lH，d，J = 8.4Hz，H-6) ,6.525( lH，d，J = 2.4Hz，H-3)，6.522(lH，d，J = 8.8Hz，H-5'），6.444(lH，dd，J = 8.4,2.4Hz，H-5)，5.276(lH，m，H-2〃），3.363(2H，d，J = 7 · 2Hz，H-l〃），I · 775，I · 638 (6H，br s，H-4〃，5〃）； 13C NMR(Acetone-Cl6，100MHz) δ: 193 · 54(C， C=0)，165.19(C，C-4'），162.64(C，C-2'），162.45(C，C-4)，160.13(C，C-2)，140.97(CH，C-β)，131.79(CH，C-6,），131.44(C，C-3〃），129.98(CH，C-6)，123.53(CH，C-2〃），117.56(CH，C-a)，116.15(C，C-1)，115.29(C，C-3，），114.56(C，C-1，），109.23(CH，C-5)，108.00(CH，C-5'），103.76(CH，C-3)，25.96(CH2，C-l〃），22.40(CH 3，C-4〃），18.01(CH3，C-5〃）。
[0047] ESI_MS:m/z 339.1 [M_H] - (C2〇Hi9〇5)。
[0048] 結構解析表明該化合物為摩查爾酮A。
[0049] 實施例4桑枝提取物和有效部位酪氨酸酶抑制活性評價
[0050] 將桑枝粉碎后乙醇浸提得到的桑枝粗提取物和有效部位溶于DMS0,先配成lmg/mL 溶液，使用時稀釋到需要濃度。檢測三種濃度的粗提取物和有效部位抑制酪氨酸酶的活性， 三種濃度為50、30、lOyg/mL。陽性對照曲酸配成25、20、10、7.5、5yg/mL濃度的溶液。將上述 三種溶液各30yL，用970yL磷酸鹽緩沖溶液配成lmL，加進0.1mg/mL的酪氨酸lmL，然后加入 由磷酸鹽緩沖溶液配成的ImL酪氨酸酶(200U/mL)，在37°C下孵育20min，于492nm處測定吸 光值。
[0051] 酶活性抑制率=[(A2-A1)-(B2-B1)]/(A2-A1)X100%
[0052] Al為Omin時候未加抑制劑的吸收值;A2為20min后未加抑制劑的吸收值；
[0053] Bl為Omin時候加抑制劑的吸收值;B2為20min后加了抑制劑的吸收值。
[0054]桑枝粗提取物和有效部位在3個濃度的抑制率分別為20.2%、11.5%、9.6%和 35.8%、22.7%、15.1%，陽性對照曲酸的IC5Q為7·0lyg/mL。
[0055]實施例5五個活性化合物酪氨酸酶抑制活性評價
[0056] 將氧化白藜蘆醇、草大戟素、桑辛素 M分別配成3.33、1.67、0.84、0.33、0.17、0.03μ g/mL的濃度的溶液，按上述方法測定IC5Q。得到活性化合物抑制酪氨酸酶的IC5Q分別為0.10 ±0.01μΜ、0.98±0.01μΜ、8.00±0.22μΜ。將2,4,2'，4'_四羥基查爾酮和摩查爾酮A分別配 成1.67、0.84、0.33、0.17、0.03、0.01、0.005yg/mL的濃度的溶液，按上述方法測定IC 5q。得到 活性化合物抑制酪氨酸酶的IC5q分別為0.07 ±0.02μΜ和0.08 ±0.02μΜ，曲酸的IC5q為49.3μ Μ。
[0057]實施例6有效部位提取物對蘋果切片的抗褐變效果評價
[0058]將蘋果切成4毫米厚薄片，分別浸入水，0.01 %4_己基間苯二酚，0.01 %桑枝有效 部位，0.1 %維生素 C，0.01 %桑枝有效部位+0.1 %維生素 C，0.01 %的4-己基間苯二酚+ 0.1%維生素(：，然后在011，311，611，121 1，2411時分別用色差儀檢測其顏色變化程度，結果表明， 〇. 01 %桑枝有效部位+〇. 1 %維生素與〇. 01 %4_己基間苯二酚的抗褐變效果在24小時內沒 有顯著性差別。
[0059] 實施例7含桑枝有效部位提取物的美白乳液配制
[0060] 配方如表1。
[0061] 表 1
[0063]制備方法:將A相中提取物混合物加入到70 °C加熱的聚乙二醇400中，然后加入甘 油、去離子水，混合均勻;B相80 °C溶解混合均勻；將A相加入B相并均質10分鐘，降溫至50 °C 時加入C相并均質5分鐘，陳化24h后灌裝，即可。
【主權項】
1. 一種具酪氨酸酶抑制活性的有效部位，其特征在于，是從桑枝中提取的具有酪氨酸 酶抑制活性的含有五種多酚類化合物的有效部位，所述五種多酚類化合物是氧化白藜蘆 醇、草大戟素、桑辛素 M，以及2,4,2'，4'_四羥基查爾酮，摩查爾酮A，其結構分別如下： 2. 根據權利要求1所述的一種具酪氨酸酶抑制活性的有效部位，其特征在于，所含的五 種多酚類化合物的質量分數達I 〇 %~15 %。3. -種制備權利要求1或2所述的具酪氨酸酶抑制活性的有效部位的方法，其特征在 于，通過以下步驟實現： (1) 桑枝粉碎后用2倍質量的70%乙醇浸沒超聲提取3次，每次1小時，提取液減壓濃縮 至干燥物，稱重； (2) 干燥物用95 %乙醇溶解，過濾； (3) 步驟(2)所得過濾液與大孔樹脂DlOl混合拌樣，減壓濃縮至干;其中，過濾液的用量 按過濾液中所含固體提取物的質量與大孔樹脂DlOl的質量比例為1:2來設定； (4) 將上述攪拌物上D101大孔樹脂，分別用8倍柱體積量的20%、40%、60%、80%、95% 乙醇洗脫，收集40 %乙醇洗脫部分。4. 根據權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟(4)收集40%乙醇洗脫部分8個體積， 濃縮得干燥樣品，稱重，干燥樣品進一步用硅膠柱層析分離，先后分別用30倍柱體積的體積 比30:1的二氯甲烷-甲醇和體積比50:1的二氯甲烷-甲醇洗脫，先后分別得到組分A和組分 B，組分A用凝膠柱層析進行分離，體積比1:1的甲醇-水洗脫，即得氧化白藜蘆醇和2,4,2'， 4 四羥基查爾酮;組分B用凝膠柱層析進行分離，體積比1:1的甲醇-水洗脫，即得草大戟 素、桑辛素 M、摩查爾酮A。5. 權利要求1或2所述的具有酪氨酸酶抑制活性的具酪氨酸酶抑制活性的有效部位在 制備抗果蔬酶促褐變抑制劑、化妝品美白劑、預防和治療黑色素異常導致的人體色素沉著 性疾病、黑色素瘤以及其他需要抑制酪氨酸酶活性的病癥的藥物中的應用。6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于，不加或加入食品添加劑輔料、化妝品輔料 或藥劑上接受的輔料，按照相應劑型的制備方法制成制劑。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述制劑的劑型包括固體粉末、水溶液、醇 溶液、乳液、面膜、巴布劑、注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、沖劑、散劑、口服液、糖衣 劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、□含劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、口崩劑、微 丸等。8. -種美白乳液，其特征在于，含有權利要求1或2所述的具酪氨酸酶抑制活性的有效 部位。9. 一種抗果蔬酶促褐變抑制劑，其特征在于，含有權利要求1或2所述的具酪氨酸酶抑 制活性的有效部位。10. -種預防和治療黑色素異常導致的人體色素沉著的藥物，其特征在于，含有權利要 求1或2所述的具酪氨酸酶抑制活性的有效部位。
【文檔編號】A61K31/343GK106008172SQ201610331482
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月18日
【發明人】鄭宗平
【申請人】江南大學