專利名稱：通過用絲狀真菌對苯甲醛進行生物轉化的微生物方法生產r－苯基乙酰基甲醇的制作方法
技術領域：
本發明涉及用絲狀真菌對苯甲醛進行生物轉化生產R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)的方法。
R-苯基乙酰基甲醇是生產制藥化合物麻黃堿和偽麻黃堿的中間物，目前通過酵母培養物對苯甲醛進行生物轉化來生產。該生物轉化是由丙酮酸脫羧酶所催化的。該催化作用的實施既可以使用完整的微生物個體(如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、產朊假絲酵母(Candida utilis))也可以用不含細胞個體的微生物(如釀酒酵母、產朊假絲酵母和運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis))提取物。
丙酮酸脫羧酶的基因已經從絲狀真菌粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)(Alvarez等，1993)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)(Sanchis等，1994)和構巢曲霉(Aspergillus nidulans)(Lockington等，1997)中分離出來了。
文獻中報道了下列絲狀真菌菌株可以進行偶姻縮合用黑曲霉(Aspergillus niger)對苯甲醛進行發酵，在用NaBH4處理后檢測到二醇(Cardillo等，1991)。據報導卷枝毛霉(Mucor circinelloides)可以用無環不飽和醛而非苯甲醛作底物進行偶姻縮合(Stumpf和Kieslich 1991)。
本發明的目的是提供通過對苯甲醛進行生物轉化來微生物生產R-苯基乙酰基甲醇的方法，該方法在總產率、對映體的純度、微生物催化劑的穩定性和安全性或該方法的成本方面應優于現有技術的方法。
本發明的第一個實施方案是用絲狀真菌對苯甲醛進行生物轉化生產R-苯基乙酰基甲醇(R-PAC)的方法。
絲狀真菌是按照Alexopoulos和Mims的分類法來分類的(Alexopoulos和Mims，1979)。
本發明優選子囊菌亞門(Ascomycotina)、接合菌亞門(Zygomycotina)和擔子菌亞門(Basidiomycotina)的絲狀真菌，尤其是選自如下的絲狀真菌根霉屬(Rhizopus)、脈孢菌屬(Neurospora)、多孔菌屬(Polyporus)、鐮孢霉屬(Fusarium)、叢梗孢屬(Monilia)、擬青霉屬(Paecilomyces)和毛霉屬(Mucor)。
特別優選的是下列菌種的絲狀真菌爪哇根霉(Rhizopus javanicus)、粗糙脈孢菌、Polyporus eucalyptorum、磚紅鐮孢(Fusarium lateritium)、好食叢梗孢(Monilia sitophila)、淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)和Mucor rouxii，在以下的實驗部分中將對它們作進一步詳細說明。
這些絲狀真菌對本領域的技術人員來說非常熟悉并能容易地用現有技術加以分離(Onions等，1981)，或可以從公共保藏單位獲得。
可以根據各種真菌由糖產生乙醇的能力(Singh等，1992；Skory等，1997)，預選出適宜的絲狀真菌。
將苯甲醛生物轉化成R-苯基乙酰基甲醇需要有乙醛來源，這可以是乙醛本身也可以是丙酮酸。優選加入丙酮酸，尤其是每摩爾的苯甲醛加入1-2，優選1.5摩爾的丙酮酸。
用來做生物轉化的絲狀真菌可以是完整的真菌菌絲體形式或是含丙酮酸脫羧酶的提取物形式。提取物是指可溶解的或已溶解的真菌酶。由于經過了更高級別的提純，與完整的真菌菌絲體相比，通常提取物含有更高比活性的酶。
提取物中的酶，尤其是丙酮酸脫羧酶，可以任選地通過加入如酶的天然輔因子、緩沖液、鹽類來穩定。提取物中的丙酮酸脫羧酶也能以固定化的形式使用。
該生物轉化的方法通常在作為溶劑的水中，優選在pH6.5～7.0之間進行。溫度可在0～60℃的較大范圍內變化，優選10～40℃并尤以20～30℃為優。
該方法既可以連續實施也可以分批進行。
以下實施例進一步提供了本發明的實施方案和具體細節。
實施例1丙酮酸脫羧酶活性的測定丙酮酸脫羧酶的活性(醛連接活性)通過從底物丙酮酸和苯甲醛在25℃時20分鐘內形成苯基乙酰基甲醇的情況來測定。樣品中含有200μl酶溶液和200μl的2倍濃縮底物溶液(80mM苯甲醛，200mM丙酮酸，3M乙醇，2mM硫胺焦磷酸素，20mM MgSO4，在50mM MES/KOH中，pH7.0)。一個單位(U)被定義為每分鐘能產生1微摩爾苯基乙酰基甲醇的酶量。蛋白質的濃度是按照Bradford方法來估計的。苯基乙酰基甲醇的濃度是由HPLC在使用Alltima C8柱時參照苯基乙酰基甲醇標準根據峰面積來確定的。為確定苯基乙酰基甲醇對映體，使用的是手性OD柱。
實施例2用真菌菌絲體的提取物來進行生物轉化對下列絲狀真菌菌株的粗提取物將苯甲醛和丙酮酸轉化為苯基乙酰基甲醇的能力進行測試爪哇根霉NRRL 13161爪哇根霉NRRL 2871米根霉(Rhizopus oryzae)NRRL 6201米根霉NRRL 1501米曲霉(Aspergillus oryzae)NRRL 694溜曲霉(Aspergillus tamarii)NRRL 429粗糙脈孢菌 ATCC 9277粗糙脈孢菌 ATCC 9683Polyporus eucalyptorum UNSW 805400磚紅鐮孢UNSW 807100鐮孢霉UNSW 871900好食叢梗孢NRRL 1275淡紫擬青霉NRRL 1746
Mucor rouxii ATCC 44260NRRL是指農業研究機構保藏中心(現在的國家農業應用研究中心(National Center For Agricultural Utilization Research))。
UNSW是指新南威爾士大學。
菌株在用棉花塞口的錐型瓶中30℃條件下液體培養基中生長，所述液體培養基的組成為酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l、葡萄糖90g/l，起始pH值為6。用230rpm的速率振蕩培養20-70小時，為快速生物質產生提供氧氣。然后將錐型瓶用石蠟封口膜進行封口，并用60rpm的速率振蕩培養23-29小時。
用布氏漏斗收集菌絲體，并用緩沖液沖洗兩遍。將冰凍的菌絲在研缽中以玻璃珠作研磨劑磨成粉末。加入裂解緩沖液后用離心法將提取物澄清，并將其調整到設定的體積。如此，這種粗提取物相對培養液體積發生四倍濃縮。將其等分儲存于-70℃的條件下。
生物轉化是在旋緊蓋的2ml小玻璃瓶中以1.2ml的級別進行的，瓶中包含有80％v/v粗提取物，濃度為100mM苯甲醛和150mM丙酮酸的底物，還有20mM MgSO4、1mM TPP、1片完全蛋白酶抑制劑(Boehringer)/25ml和50mM MES/KOH，pH7.0。
這些小瓶在22.5℃條件下以35rpm的速率垂直旋轉。20分鐘后及20小時后取出300μl的樣品，并加入到30μl 100％[w/v]的三氯乙酸中。通過離心法除去蛋白質后，用HPLC對上清液中的苯基乙酰基甲醇進行分析。
如
圖1所示，最大的醛連接比活性來自具有0.27至0.45U/mg蛋白質的根霉屬、鐮孢霉屬和毛霉屬。根霉屬的菌株還產生了最高的丙酮酸脫羧酶總量(8.1-15.5U)，其可從20ml的培養液回收得到。
使用根霉屬和毛霉屬的粗提取物在20分鐘內得到3.8-6.5g/l苯基乙酰基甲醇的最好初始產量(見表3)。根霉屬和鐮孢霉屬導致最高的最終苯基乙酰基甲醇濃度78-84mM(11.7-12.6g/l，見圖4)。這是基于最初苯甲醛濃度的理論產量的78-84％。這些結果是在沒有對實驗條件進行任何優化的情況下獲得的。
生物轉化的最終樣品中R-苯基乙酰基甲醇的對映體過量見下表
實施例3用完整的真菌菌絲體進行生物轉化對使用完整的菌絲體時以下絲狀真菌將苯甲醛轉化為苯基乙酰基甲醇的能力進行檢測爪哇根霉NRRL 13161爪哇根霉NRRL 2871米根霉NRRL 6201米根霉NRRL 1501米曲霉NRRL 694溜曲霉NRRL 429
這些菌株在用棉花塞口的錐型瓶中30℃條件下生長在YEPG培養基中，該培養基的組成為葡萄糖90g/l，酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，起始pH值為6。根霉屬菌株用230rpm的速率振蕩培養12小時，而曲霉屬菌株振蕩培養48小時。為了誘導丙酮酸脫羧酶，培養物被轉入到無菌擰緊蓋的小玻璃瓶中，于30℃條件下靜置3.5小時。氣體以高的速度產生，這表明高的丙酮酸脫羧酶活性。
將液體培養基拋棄后加入等量的YEPG培養基(包括100mM苯甲醛)。將培養物在擰緊蓋的小玻璃瓶中在30℃條件下以230rpm的速率振蕩培養。12小時從100mM苯甲醛只產生了0.2-0.7mM苯基乙酰基甲醇，并且再過12小時苯基乙酰基甲醇的濃度也沒有增加。盡管產量低，但實驗表明不預先破碎菌絲體也可以從苯甲醛產生苯基乙酰基甲醇。
實施例4用爪哇根霉的丙酮酸脫羧酶PDC對苯甲醛進行生物轉化通過丙酮沉淀反應對爪哇根霉的丙酮酸脫羧酶(PDC)進行部分純化。
反應組成0.6-2M(優選2M)MOPS/KOH，pH720mM MgSO41mM TPP150-600mM 丙酮酸(丙酮酸/苯甲醛的比＝1.5)100-394mM 苯甲醛7.2U/ml PDC 醛連接酶活性(1個單位醛連接酶活性被定義為在25℃和pH值為7的條件下，1分鐘內由40mM苯甲醛和100mM丙酮酸產生出1μmol苯基乙酰基甲醇PAC所用的酶量。)加入丙酮酸脫羧酶(PDC)以起始反應。在6℃條件下混合18小時后，用10％[w/v]的三氯乙酸將樣品稀釋20倍以終止反應。用離心法將蛋白質去除后，用HPLC對苯基乙酰基甲醇PAC的濃度進行分析。
結果結果如表5所示。使用爪哇根霉的丙酮酸脫羧酶(PDC)時，得到濃度高達43g/l的苯基乙酰基甲醇PAC。基于起始的苯甲醛，PAC的產量在苯甲醛起始為295mM時是86％，在苯甲醛起始為394mM時是73％。對映體過量(ee-值)為98.7。
已報道的生物轉化產生的苯基乙酰基甲醇(PAC)的最高濃度，使用來自產朊假絲酵母(Shin and Rogers，1996；Rogers，Shin and Wang，1997)的部分純化的丙酮酸脫羧酶(PDC)時為28.6g/l，而使用球擬酵母屬(Torulopsis)酵母(JP 2000-93189A)進行發酵時為30.2g/l。
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圖1顯示粗提取物的醛連接比活性。誤差條表示的是來自每個菌株的三個培養物的最小和最大值。
圖2顯示每個含20ml培養液的錐形瓶中總的醛連接活性。誤差條表示的是來自每個菌株的三個培養物的最小和最大值。
圖3顯示苯基乙酰基甲醇(PAC)的最初產量。誤差條表示的是來自每個菌株的三個培養物的最小和最大值。
圖4顯示苯基乙酰基甲醇(PAC)的最初濃度及基于起始苯甲醛濃度的理論產量。誤差條表示的是來自每個菌株的三個培養物的最小和最大值。
圖5顯示用爪哇根霉的丙酮酸脫羧酶(PDC)時底物濃度對苯基乙酰基甲醇(PAC)產量的影響。
權利要求
1.通過絲狀真菌對苯甲醛進行生物轉化生產R-苯基乙酰基甲醇的方法。
2.依照權利要求1的方法，其中所述絲狀真菌選自根霉屬、脈孢菌屬、多孔菌屬、鐮孢霉屬、叢梗孢屬、擬青霉屬和毛霉屬。
3.依照權利要求2的方法，其中所述絲狀真菌選自根霉屬、鐮孢霉屬和毛霉屬。
4.依照權利要求3的方法，其中所述絲狀真菌是爪哇根霉或Mucorrouxii。
5.依照權利要求1-4的方法，其中在有丙酮酸的條件下對苯甲醛進行所述生物轉化。
6.依照權利要求5的方法，其中每摩爾苯甲醛中加入1-2摩爾丙酮酸。
7.依照權利要求1-6的方法，其中用絲狀真菌的提取物來進行所述生物轉化。
8.依照權利要求7的方法，其中所述提取物中含有丙酮酸脫羧酶。
9.依照權利要求8的方法，其中使所述丙酮酸脫羧酶處于穩定狀態。
全文摘要
用絲狀真菌對苯甲醛進行生物轉化生產R－苯基乙酰基甲醇(PAC)的方法。
文檔編號C12R1/77GK1440460SQ01812291
公開日2003年9月3日 申請日期2001年7月4日 優先權日2000年7月5日
發明者M·布羅伊爾, B·豪爾, B·羅舍, P·羅杰斯 申請人:巴斯福股份公司