一種枯草芽孢桿菌制劑及制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物學領域，更具體地涉及一種具有益生菌作用的枯草芽孢桿菌制 劑，同時還涉及一種具有益生菌作用的枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，還涉及一種枯草芽 孢桿菌制劑的用途。
【背景技術】
[0002] 近年來，機體腸道微生物對生長、消化、免疫和抗病力方面的研宄越來越受到人們 的關注（Patel, S.，Shukla，R. &Goyal，A. (2015) · Probiotics in valorization of innate immunity across various animal models. Journal of Functional Foods 14, 549-61)〇 將有益細菌（益生菌）添加到食品或飼料中而調節宿主腸道菌群生態平衡（人類到低 等生物，如魚類、貝類）（Cross ML(2002)Microbes versus microbes: immune signals generated by probiotic lactobacilli and their role in protection against microbial pathogens. FEMS immunology and medical microbiology 34 (4):245-53)，這 樣不僅可以改善動物新陳代謝，提高營養物質吸收和利用，提高免疫力，而且能夠抑制抗生 素和藥物等帶來的不利作用。因此益生菌作為促進健康的功能性生物，在促進機體生長及 治療和預防機體疾病方面都顯示出廣闊的應用前景。
[0003] 枯草芽孢桿菌是一種具有較強的耐酸、耐鹽、耐高溫和耐擠壓等特性的革蘭氏 陽性菌。它可以在動物腸道內定植（Barbosa TM, Serra CR, La Ragione RM, Woodward MJ,Henriques AO (2005)Screening for bacillus isolates in the broiler gastrointestinal tract. Applied and environmental microbiology 71 (2):968-78)， 形成生物膜，通過產生大量的次級代謝產物，如維生素、氨基酸、促生長因子等，從而促進 機體生長；同時，枯草芽孢桿菌在動物腸道內定植后，能產生多種消化酶。草魚這種典 型的草食性魚類，其本身無法形成纖維素酶以降解纖維素，飼料中添加枯草芽抱桿菌，能 夠顯著提高草魚腸道中纖維素酶、淀粉酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶以及酯酶等，有利于機體 對營養物質的消化吸收（Zhou Y，Yuan XC，Liang XF，Fang L，Li J，Guo XZ，Bai XL，He S(2013)Enhancement of growth and intestinal flora in grass carp: The effect of exogenous cellulase.Aquaculture 416:1-7)。有研宄結果表明：枯草芽抱桿菌可 以通過調節種微生物菌群的平衡來實現水生動物腸道微生物區系的優化，枯草芽孢桿菌 能通過分泌一些抑菌物質，如枯草菌素（subtilin)、表面活性素（surfactin)等，或者 通過與病原菌競爭宿主細胞的粘附位點，來有效降低水生動物腸道中有害菌的數量，如 大腸桿菌（Escherichia coli)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)、焚光假單胞菌 (Pseudomonas fluorescens)、弧菌(Vibrio) (Cutting SM(2011)Bacillus probiotics. Food microbiology 28(2):214-20)等；同時枯草芽孢桿菌進入腸道后可以迅速消耗腸 道內的游離氧，產生乳酸等有機酸，降低腸道PH值，間接抑制病原菌的生長，促進乳酸桿 菌等有益厭氧菌的生長，如雙歧桿菌、乳酸桿菌等（于明超，李卓佳，林黑著，等.飼 料中添加芽孢桿菌和中草藥制劑對凡納濱對蝦生長及腸道菌群的影響[J].熱帶海洋 學報，2010, 29(4) : 132-137)。此外，枯草芽孢桿菌對機體局部免疫和系統免疫都具有 一定的調節作用，可以影響免疫應答的調制元件，如巨噬細胞、NK細胞活性和免疫球 蛋白的產生，淋巴細胞的增殖，細胞因子和抗體的產生等（Kanzato H，Fujiwara S, Ise ff,Kaminogawa S,Sato R, Hachimura S (2008)Lactobacillus acidophilus strain L-92 induces apoptosis of antigen-stimulated T cells by modulating dendritic cell function. Immunobiology 213(5) :399-408)。有文獻報道，枯草芽孢桿菌分泌的表面活性 素能夠通過抑制NF-κ B信號通路中的I κ Ba和P65的磷酸化從而降低促炎因子TNFa、 IL-I β的水平，此外，表面活性素還可通過誘導血紅素氧合酶-I(HO-I)的表達，而血紅 素氧合酶-1可顯著誘導抗炎因子的上調而下調促炎因子，從而使得枯草芽孢桿菌具有抗 炎作用（Park SY，Kim YH，Kim EK，Ryu EY，Lee SJ(2010)Heme oxygenase-lsignals are involved in preferential inhibition of pro-inflammatory cytokine release by surfactin in cells activated with Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide. Chemico-biological interactions 188(3) :437-45)。Benoit Folign6 等研宄表明，人 外周血單核細胞受到枯草芽孢桿菌PB6刺激后，抗炎因子IL-IO顯著上調，而促炎因子 TNFa、IFNy以及IL-12并沒有發生顯著變化；另外，喂服枯草芽孢桿菌PB6芽孢能夠顯 著降低患大腸炎小鼠血液中炎癥標志物IL-6及血清淀粉樣蛋白A(SAA)的含量（Foligne B 1Peys E1Vandenkerckhove J,Van Hemel J1Dewulf J1Breton J,Pot B (2012) Spores from two distinct colony types of the strain Bacillus subtilis PB6substantiate anti-inflammatory probiotic effects in mice. Clinical nutrition 31(6):987-94)， 即PB6具有抗腸炎作用。2010年6月，歐盟已批準使用枯草芽孢桿菌PB6防制家禽細菌性 腸炎。
[0004] 本發明的菌劑所用的枯草芽孢桿菌GC21和GC22均分離自草魚腸道，作為草魚飼 料益生菌添加劑使用時，避免了其它來源的細菌所造成的免疫原性及安全性問題。本發明 的菌劑能夠耐酸、酸膽鹽，能抵抗草魚胃腸道內的極端環境，具備益生菌的潛力，能夠增強 草魚營養代謝功能、調節草魚腸道菌落平衡、提高草魚機體免疫能力而發揮抗炎作用，可用 于防治草魚腸炎，可以用來代替抗生素，在水產領域具有廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是在于提供了一種具有益生作用的枯草芽孢桿菌制劑，包含從草魚 體內分離的野生型枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GC21和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)GC22,該制劑包含2種不同類型的枯草芽孢桿菌，這2種菌株均為能夠抑制病原 菌且具有益生效果的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌GC21，已于2015年1月25日保藏在 中國典型培養物保藏中心，保藏號為：CCTCC N0:M2015068 :枯草芽孢桿菌GC22,已于2015 年1月25日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為：CCTCC N0:M2015069。
[0006] 本發明的另一個目的是在于提供了一種枯草芽孢桿菌制劑的制備方法，野生型枯 草芽孢桿菌GC21和枯草芽孢桿菌GC22均分離自武漢大學工學部集貿市場購得草魚體內， 經過高溫處理獲得芽孢，經進一步基因序列鑒定及多次劃線分離純化獲得。這2株菌通過 在 DSM (0· 8 % 肉湯營養液（Difco)，0· 1% KCl，0· 025% MgSO4 · 7H20,1. OmM Ca(NO3)2,10 μ M MnCl2,1. 0 μ M FeSO4)分別培養72h，離心獲得芽孢，將這兩種芽孢按照重量1:1的比例混 合。
[0007] 本發明還有一個目的是在于提供了一種枯草芽孢桿菌GC21或GC22或包含這兩 種枯草芽孢桿菌的制劑在制備治療或預防水生動物致病菌藥物中的應用，其具有廣譜抑菌 效果，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，主要針對水生動物致病菌，包括但不限于對嗜水 氣單胞菌（Aeromonas hydrophila XS91-4-1)、愛德華氏菌（Edwardsiella HSN-1)、腸型點 狀氣單胞菌（Aeromonas punctata f. intestinali 5820-9)、河弧菌（Vibrio fIurialis WY91-24-3)、無乳鏈球菌（Streptococcus agalactia XQ-1)的抑制作用。
[0008] 本發明再一個目的是在于提供了一種枯草芽孢桿菌的制劑作為益生菌在魚飼料 添加劑中的應用，該制劑由枯草芽孢桿菌GC21和枯草芽孢桿菌GC22芽孢構成。該芽孢能 夠粘附腸道上皮細胞，即具有腸道定植能力，能夠在腸道中繁殖；能夠抑制水生動物腸道有 害細菌，有助于調節動物腸道菌群平衡；具有較高的產纖維素酶、淀粉酶能力，有助于提高 機體的消化能力，增強動物營養代謝功能，可作為飼料添加劑，提高動物免疫力，促進生長。 此外，該芽孢能夠激活草魚腸道內抗炎因子的表達，抑制腸道炎癥，可用于防治草魚腸道炎 癥。
[0009] 為了實現上述的目的，本發明采用以下技術措施：
[0010] 一種枯草芽孢桿菌的制備方法，其步驟是：
[0011] (1)從集貿市場購買健康草魚，用MS-222麻醉；
[0012] (2)取草魚腸道洗絳，勻衆，離心，取上清于EP管，80°C處理20min ;
[0013] (3)梯度稀釋涂布在TSA平板上，37°C培育18~24h ;
[0014] (4)根據文獻所報道的枯草芽孢桿菌的形態，挑取單克隆，并用TSB培養，劃線分 離純化5次，并通過序列分析（gyrB、rpoB、phoR測序、進化樹分析）及生化實驗（革蘭氏染 色、過氧化氫酶、需氧性、明膠液化、淀粉水解、甲基紅、枸櫞酸鹽利用實驗）鑒定；
[0015] (5)確定其為枯草芽孢桿菌，分離得到2株菌，分別命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis GC21和枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis GC22。所述的枯草芽抱桿菌GC21，已 于2015年1月25日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為：CCTCC N0:M2015068 ;枯草 芽孢桿菌GC22,已于2015年1月25日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為：CCTCC N0:M2015069〇
[0016] 這2株菌株的微生物學特征為：革蘭氏陽性菌，無莢膜，最適生長溫度為37°C，菌 落表面粗糙不透明，邊緣不整齊，呈齒狀，微黃色，在液體培養基中生長時形成皺醭。培養基 為LB培養基，配方：1L溶液中，IOg Tryptone (胰蛋白胨），5g Yeast Extract (酵母提取 物），IOg NaCl (氯化鈉），再加入 16g Agar (瓊脂），ρΗ7· 2。
[0017] -種枯草芽孢桿菌GC21或GC22或包含這兩種枯草芽孢桿菌的制劑在制備治療 或預防水生動物致病菌藥物中的應用，其具有廣譜抑菌效果，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏 陰性菌，主要針對水生動物致病菌，包括但不限于對嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila XS91-4-1)、愛德華氏菌（Edwardsiella HSN-1)、腸型