肽的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及來自髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG)的肽。具體地，本發明涉及包含 MOG的40-60區段的一部分的肽，其能夠與MHC分子體外結合并被呈遞給T細胞而無須抗原 加工。本申請還涉及該肽在治療和/或預防疾病中的用途。
【背景技術】
[0002] 多發性硬化（MS)是影響中樞神經系統的慢性退行性疾病，特征在于神經軸突的 脫髓鞘。MS會造成眾多生理和精神癥狀，并且通常發展為生理缺陷和認知功能障礙。疾病 通常在年輕人（20至40歲）中發病，在女性中更常見，并且在世界范圍內影響超過一百萬 人。
[0003]MS的病程各不相同，并且會潛伏或隨時間穩步發展。已根據進展模式描述了MS的幾種亞型。患有MS的人會患有幾乎任何神經癥狀或跡象，包括知覺變化，如喪失敏感度 或發麻、刺痛或麻痹（感覺遲鈍和感覺異常）、肌肉虛弱、陣攣、肌肉痙攣或移動困難；協調 和平衡困難（共濟失調）；語言問題（構音障礙）或吞咽問題（吞咽困難）問題、視覺問題 (眼球震顫、視神經炎（包括光幻視）或復視）、疲勞、急性或慢性疼痛以及膀胱和腸困難。
[0004] 目前MS被認為是免疫介導性病癥，其中人體自身的免疫系統攻擊并損傷了髓鞘 質。
[0005] 沒有已知的針對MS的治愈方法。已證明，幾種現有療法在疾病侵襲（復發）后的 功能恢復中、在防止或降低新的疾病侵襲（復發）的程度或頻率中、或者在預防或降低殘疾 程度中是有效的。然而，很多現有MS療法有副作用或耐受不良。因而需要對能有效治療MS 并有效緩解或減少MS的癥狀的MS替代療法。
【發明內容】
[0006] 本發明人已確定了一系列衍生自髓鞘少突膠質細胞糖蛋白的肽，所述肽可以通過 固定的抗原呈遞細胞呈遞給T細胞。這些肽可有效預防和/或治療脫髓鞘疾病，如多發性 硬化。
[0007] 因此，在第一方面，本發明提供了能夠與MHC分子體外結合并被呈遞給T細胞而無 需抗原加工的肽（即apitope)，所述肽包含髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG)的40至60區 段的一部分。
[0008] 所述肽可包含髓鞘少突膠質細胞糖蛋白的41至59區段的一部分。
[0009] 所述肽可選自以下髓鞘少突膠質細胞糖蛋白肽：MOG41-55、43-57、44-58和 45-59〇
[0010] 所述肽可為MOG41-55。
[0011] 在第二方面，本發明提供了根據本發明的第一方面的肽以用于治療和/或預防脫 髓鞘疾病。
[0012] 在第三方面，本發明提供了包含一種或多種根據本發明的第一方面的肽的藥物組 合物。
[0013] 在第四方面，本發明提供了治療和/或預防有此需要的受試者中的脫髓鞘疾病的 方法，所述方法包含向所述受試者給藥根據本發明的第一方面所述的肽的步驟。
[0014] 在第五方面，本發明涉及根據本發明的第一方面的肽在制造用于預防和/或治療 脫髓鞘疾病的藥物中的用途。
[0015] 與本發明的第二、第四和第五方面有關，所述疾病可為多發性硬化。
【附圖說明】
[0016] 圖1為顯示不同MOG特異性雜交瘤克隆的肽特異性的圖。
[0017] 圖2顯示了增殖恢復測定（recallproliferationassay)的結果，所述測定用于 測試用R0K5(M0G41-55)治療小鼠的效果，在所述治療之后用M0G35-55免疫接種，隨后用 M0G35-55體外恢復。
[0018] 圖3顯示了來自小鼠的脾細胞的上清液的細胞因子分布，所述小鼠用R0K5或PBS 體內預處理，并用M0G35-55免疫接種，隨后用M0G35-55體外恢復。
[0019] 圖4圖解說明體內EAE預防方案。
[0020] 圖5顯示了肽M0G35-55在鼠模型中誘導了EAE。
[0021] 圖6顯示了小鼠和人類R0K5apitope均可降低由M0G35-55誘導的疾病的嚴重性。
[0022] 圖7顯示了huR0K5降低了疾病的嚴重性，并造成疾病負擔（diseaseburden)峰 的延遲。
【具體實施方式】
[0023] 在第一方面，本發明涉及一種肽。
[0024] 肽
[0025] 術語"肽"根據其標準含義是用來指一系列殘基（通常為L-氨基酸），通常通過 a_氨基和相鄰氨基酸的羧基之間的肽鍵彼此相連。該術語包括修飾的肽和合成的肽類似 物。
[0026] 本發明的肽的長度為能夠與主要組織相容性復合體（MHC)I類或II類分子體外結 合并被呈遞給T細胞而無需抗原加工。換句話說，該肽能夠直接與MHC分子的肽結合槽結 合而無需在一個端點或兩個端點進行任何修剪。
[0027] 與MHCI類分子結合的肽通常為7至13個氨基酸、更通常地為8至10個氨基酸 的長度。該肽的結合通過以下方式在其兩個端點得到穩定，所述方式為肽的主鏈原子與所 有MHCI類分子的肽結合槽內的非可變位點之間的接觸。在所述槽的兩個端點處都具有非 可變位點，其與肽的氨基和羧基末端結合。肽長度的變化通過肽主鏈的卷曲來調節，通常在 允許所需柔性的脯氨酸或甘氨酸殘基處發生。
[0028] 與MHCII類分子結合的肽通常為8至20個氨基酸之間的長度，更通常地為10至 17個氨基酸之間的長度。這些肽以沿著兩端開放的MHCII肽結合槽（與MHCI類肽結合 槽不同）伸展的構象存在。主要通過主鏈原子與排列形成肽結合槽的保守殘基接觸而使肽 維持在合適的位置。
[0029] 本發明的肽可以通過化學方法制備（PeptideChemistry,Apractical Textbook.MikosBodansky,Springer-Verlag,Berlin.)。例如，可以通過固相技術合成 肽（RobergeJY等人（1995)Science269:202-204)，從樹脂上切除，并通過制備性高效液 相色譜純化（如Creighton(1983)ProteinsStructuresAndMolecularPrinciples,WH FreemanandCo,NewYorkNY)。例如，根據制造商提供的說明書使用ABI431A肽合成儀 (PerkinElmer)可實現自動合成。
[0030] 或者，可通過重組方式、或通過從更長的多肽上切除來制備所述肽。例如，可以通 過從髓鞘堿性蛋白上切除來獲得所述肽。肽的組成可通過氨基酸分析或測序來確定（如 Edman降解法）。
[0031] 髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG)
[0032] 髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG)是具有單個胞外Ig可變域（Ig-V)的I型完整膜 蛋白。MOG的氨基酸序列在動物物種間高度保守（>90%)，這表明其重要的生物功能。MOG 在CNS中在髓鞘以及胞體最外層上和少突膠質細胞過程中特異性表達。
[0033] 成熟MOG的序列（缺少29氨基酸信號肽）如下（SEQIDNo. 5)。
[0034] SEQIDNo.5
[0039] 本發明的肽衍生自髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG)的40-60區段。所述肽可衍生 自經抗原呈遞細胞對抗原天然加工而產生的抗原片段。
[0040] MOG的40-60區段具有以下序列：
[0041]SEQIDNo.6
[0049] 所述肽可包含來自MOG41-55的最小表位。所述肽可由MOG41-55組成。
[0050]Apitope
[0051] 在適應性免疫應答中，T淋巴細胞能夠識別蛋白抗原的內在表位。抗原呈遞細胞 (APC)吸收蛋白抗原并將它們降解成短的肽片段。肽可與細胞內的主要組織相容性復合體 (MHC)I類或II類分子結合并被轉運至細胞表面。當與MHC分子一起被呈遞至細胞表面時， 該肽可被T細胞識別（通過T細胞受體（TCR))，在這種情況下該肽為T細胞表位。
[0052]T細胞表位在對任何抗原（無論是自身的或外來的）的適應性免疫應答中扮演了 重要的角色。已通過使用實驗模型證實了T細胞表位在超敏性疾病（包括過敏、自身免疫 性疾病和移植排斥）中扮演的重要角色。通過注射與佐劑組合的合成肽（基于T細胞表位 的結構）可以誘導炎癥或過敏性疾病。
[0053] 相比之下，已顯示可以通過給藥可溶形式的肽表位來誘導對特定肽表位 的免疫耐受。在實驗性自身免疫腦脊髓炎（EAE--種多發性硬化（MS)的模型） (Metzler和Wraith(1993)Int.Immunol.5:1159-1165;Liu和Wraith(1995)Int. Immunol. 7:1255-1263;Anderton和Wraith(1998)Eur.J.Immunol. 28:1251-1261);以及關 節炎、糖尿病和葡萄膜視網膜炎的實驗模型（如以上Anderton和Wraith(1998)中所述） 中，給藥可溶性的肽抗原被證實是一種抑制疾病的有效方法。這也被證實是一種治療EAE 中疾病進展的方法（如上所述的Anderton和Wraith(1998))。
[0054] 致耐受性肽在治療或預防疾病中的用途已吸引了相當多的注意力。其一個原因是 已顯示某些致耐受性表位可下調針對相同組織內的不同抗原的T細胞應答。這種被稱為 "旁觀者抑制"的現象是指使用特定的致耐受性肽（如上所述的Anderton和Wraith(1998)) 可以誘導針對給定抗原內的多于一個表位（優選所有表位）的耐受性和針對給定疾病的多 于一個抗原的耐受性。這避免了需確定特定疾病中的全部病原性抗原的需要。
[0055] 肽也是一種有利的治療選擇，這是由于肽相對較低的成本以及可生產出具有改變 的免疫性狀的肽類似物的事實。因而可以對肽進行修飾以改變其與MHC或TCR的相互作用。
[0056] 這種方法的一個可能的問題是，已經顯示并不是所有作為T細胞表位的肽都能夠 誘導耐受性。髓鞘堿性蛋白（MBP)肽89-101是一種免疫接種后的免疫顯性抗原，同時在引 發T細胞反應和誘導EAE方面也具有非常有效的免疫原。然而，已顯示，當以溶液形式給藥