一種轉化人參皂苷Rb1制備稀有人參皂苷CK的方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，設及一種利用雙歧桿菌所產生的0 -葡萄糖巧酶 轉化人參皂巧化1制備稀有人參皂巧CK(CompoundK)的方法，同時還設及該雙歧桿菌所產 生的0 -葡萄糖巧酶在W化1為底物制備稀有人參皂巧CK的應用。
【背景技術】
[0002] 人參皂巧為S祗糖巧類化合物，是人參的主要藥用活性成分。根據其巧元上C-3、 C-6和C-20位置的糖巧鍵（Glycosidicbond)的種類和數量的不同，衍生出不同類型的人 參皂巧。根據其在植物中的含量分為主要人參皂巧（Majorginsenoside，如化1、化2、Rc、 Rd、Re和Rgl等）和稀有人參皂巧（Rareginsenoside，如Rg3、化1、化2、F1、F2、CK、C-0、 CY和C-Mc)等。其中稀有人參皂巧是指在人參中含量極低或者不存在的皂巧。由于巧元 和糖基的種類、糖基的數量和糖基連接的碳位不同，其活性差別很大。人參皂巧化1可W改 善神經變性動物運動障礙，降低神經變性動物死亡率及減小紋狀體損害體積；減少永久性 大腦中動脈閉塞大鼠大腦梗塞體積，改善動物的位置導航殘疾，促進燒傷創面愈合。人參皂 巧Rd可W選擇性地括抗紅藻氨酸引起的致死性興奮性中毒，改善神經變性動物運動障礙， 降低神經變性動物死亡率等功能。人參皂巧F2具有抗疲勞、安神補腦、抗腫瘤等功效。陳 茜等發現人參皂巧F2對胃癌SGC-7901細胞和肺癌SPC-A-I細胞均具有抑制作用；成宗煥 等發現人參皂巧F2具有抑制腫瘤細胞的增殖，倒轉腫瘤細胞及細菌中所表現出來的多重 耐藥性等效果。在目前已知的人參皂巧中，稀有人參皂巧CK等在抗癌、抗衰老、預防和緩解 老年癡呆等方面具有其它人參皂巧無法取代的獨特優勢。研究表明人參皂巧CK具有很好 的抗細胞突變、抑制腫瘤細胞轉移、誘導腫瘤細胞調亡、逆轉腫瘤細胞耐藥性和抗腫瘤誘導 的血管生成等活性。它與放療和化療結合試驗，可W增強放療和化療的效果。除此之外，人 參皂巧CK還有具有抗過敏和抗炎活性，并且可W起到神經保護作用，抗糖尿病作用和抗皮 膚衰老作用。并且人參皂巧CK的藥理活性具有多祀點、高活性和低毒性的特點。
[0003] 研究表明，人參皂巧CK是人參二醇系皂巧在人腸道內的代謝產物。多數原人參二 醇型皂巧只有被代謝為CK后才能被人體吸收，所W人參皂巧CK是直接被體內吸收和發揮 藥理作用的真正分子，而其它二醇型人參皂巧只是藥物前體。雖然人參皂巧CK具有很高的 藥用價值，但由于它們在自然界中含量極其稀少，很難通過傳統的方法從人參等植物中分 離得到，運對稀有人參皂巧CK的生產造成很大限制。
[0004] 目前，生產稀有人參皂巧的方法主要是化學水解法和糖巧酶生物轉化法。化學水 解法通常選擇性較差、產率低、不易純化、同時容易造成環境污染。糖巧酶轉化法則具備區 域選擇性和立體選擇性高、得率高、副產物少、無污染和容易工業化生產等優點，雖然轉化 途徑復雜，但產物多樣，可W獲得化學法難W得到的稀有人參皂巧如C-Mc、C-0、F2、CY、CK 等。被認為是生產稀有人參皂巧最具有潛力的方法。 陽0化]利用糖巧酶轉化法生產稀有人參皂巧，目前的一些研究主要是利用從±壤微生 物、真菌和少數高等生物中篩選菌株或酶來轉化稀有人參皂巧。化eng等從±壤中篩選 到Caulobacterlei如iaGP45,可W通過0-葡萄糖巧酶將化I轉化為CK。Liu等使用Aspergillusniger中人參皂巧酶（ginsenosidase)經不同的途徑將PPD型主要人參皂巧 化1、化2、Rc和Rd轉化為C-0、Fz、C-Mc、CY和CK等稀有人參皂巧。Hong等使用真菌Monas州S PilosusKMU103轉化紅參中人參皂巧，得到了一系列稀有人參皂巧，如化1、化2、R拓等。Luan 等從中華白玉蝸牛中分離純化出兩種0-葡萄糖巧酶，用于人參皂巧化1的轉化。其中，一 種酶僅能將化1轉化為Rd,而另外一種酶能將化1、化2、Rc分別轉化為不同的稀有人參皂巧。 盡管已有利用人參皂巧化1生物轉化法制取人參皂巧CK的相關報道。但是，目前，利用糖 巧酶體外生物轉化生產稀有人參皂巧所使用的微生物大多不可食用，并且轉化效率普遍偏 低。為了使稀有人參皂巧的轉化過程安全可控，轉化產物無污染，發現并研究利用可食用微 生物轉化稀有人參皂巧將是人參皂巧生物轉化研究的一個重要方向。
[0006] 近年來，基于腸道益生菌的生物轉化已得到廣泛的關注。化segawa等從腸道菌群 中分離的雙歧桿菌屬因產酶豐富，且酶具有較高的催化活力和穩定性，在體內生物轉化方 面發揮重要的作用，成為開發新型生物轉化酶的熱點。其中雙歧桿菌是常見的益生菌，由于 所產的酶有較高的催化活力、選擇性和穩定性，利用其進行生物轉化相對安全和可靠，在黃 酬巧、人參皂巧等天然產物的體內轉化中具有重要的應用潛力。Bae等采用腸道乳酸菌轉 化PPD型人參皂巧制備人參皂巧CK，結果發現運用雙歧桿菌B.minimumKK-I和豚雙歧桿菌 8.。11〇61'；[]1111]1邸-2共發酵轉化化1時效果最好，轉化率可達到41%左右。盡管部分雙歧桿 菌具有轉化人參皂巧化1制備人參皂巧CK的能力，但是其轉化效率較低，仍不能滿足生產 的要求。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是克服現有技術的缺陷和不足，提供一種利用雙歧桿菌所產生的 0 -葡萄糖巧酶轉化人參皂巧化1制備稀有人參皂巧CK的方法與應用。
[0008] 本發明的目的之一在于提供一種轉化人參皂巧化1制備稀有人參皂巧CK的方法， 通過0-葡萄糖巧酶實現轉化，所述的0-葡萄糖巧酶來自雙歧桿菌，所述的雙歧桿菌為 B.breveATCC15700雙歧桿菌。
[0009] 一種轉化人參皂巧化1制備稀有人參皂巧CK的方法，包括W下步驟：
[0010] (1)將雙歧桿菌度.breveATCC15700)菌株厭氧培養24-4化后；超聲波破碎細 胞后離屯、，20-30°C條件下，上清液中加入硫酸錠至飽和度為10% -50%，調抑為4. 5-4. 6， 4-8°C靜置6-化；離屯、，棄去上清液，將蛋白沉淀加入醋酸一醋酸鋼緩沖液中溶解，得到含 0-葡萄糖巧酶的粗酶液；
[0011] (2)含0-葡萄糖巧酶的粗酶液用凝膠過濾柱層析純化，重復2~10次，分離得到 0-葡萄糖巧酶；
[0012] (3)將人參皂巧化1溶于甲醇中，再與醋酸-醋酸鋼緩沖液混合，配制成濃度為 lOmg/mL的人參皂巧化1底物溶液，將步驟（2)所得0 -葡萄糖巧酶配制成20U/mL的酶 液，再將人參皂巧化1底物溶液與0-葡萄糖巧酶液按照體積比為（10-50) :1的比例混合， pH4-5,35-55°C條件下反應24-4化，然后置于80-100°C水浴中滅活15-20min，室溫條件下 8000-10000巧m離屯、5-lOmin，取上清液在50-60°C下烘干，得到稀有人參皂巧CK。
[0013] 進一步地，所述的厭氧培養，溫度為30-40°C。
[0014] 進一步地，所述步驟（I)的醋酸一醋酸鋼緩沖液，抑為6。
[0015] 進一步地，所述的凝膠過濾柱層析，凝膠為Se地adexG-200凝膠，洗脫液為P冊.8 的憐酸鹽緩沖液。
[0016] 進一步地，所述步驟（3)的醋酸-醋酸鋼緩沖液，濃度為0.02mol/L，抑為 4. 0-6. 0。
[0017] 本發明的另一目的在于提供一種上述的方法在轉化人參皂巧化1制備稀有人參 皂巧CK中的應用。
[0018] 本發明的有益效果在于：
[0019] (1)本發明的方法，化1生成稀有人參皂巧CK的轉化率高，能夠達到62-68%左右， 遠高于現有技術的水平。
[0020] (2)本發明所用的雙