一種褐藻多糖硫酸酯的質量分析方法
【專利摘要】本發明涉及一種褐藻多糖硫酸酯的質量分析方法，所述質量分析方法利用HPLC-柱后衍生-熒光檢測法對褐藻多糖硫酸酯進行含量分析，其色譜條件為：色譜柱采用至少一根以上適合多糖的分離范圍為2,000–1,000,000道爾頓的色譜柱組成；流動相采用50mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH6.7）-乙腈（87:17，V/V）；HPLC柱溫為室溫；流速為0.1mL/min–1.0mL/min。本發明具有靈敏度高、重現性好、穩定性好等優點，適用于褐藻多糖硫酸酯的含量測定和藥代動力學研究。
【專利說明】一種褐藻多糖硫酸酯的質量分析方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫藥生物檢測領域，具體涉及一種褐藻多糖硫酸酯的的質量分析方 法。
【背景技術】
[0002] 褐藻多糖硫酸酯是一類硫酸化多糖，存在于部分海洋褐藻和海洋無脊椎動物中， 首先由Kylin在1913年用稀酸從掌狀海帶中提取出來。Kylin將提取物水解后分離出L-巖 藻糖，他將這種多糖命名為fucoidin，現根據多糖的命名原則一般定名為fucoidan，中文 名稱為褐藻多糖硫酸酯，也被稱為巖藻多糖、巖藻聚糖、巖藻聚糖硫酸酯或褐藻糖膠。現在 人們對褐藻多糖硫酸酯的組成有較為清晰的了解，它是一類化學組成和結構非常復雜的多 糖，以巖藻糖和硫酸基為主，隨著褐藻的種類不同還含有少量半乳糖、木糖、糖醛酸等其他 成分。
[0003] 褐藻多糖硫酸酯是具有多種生物活性的一類類肝素多糖，現已報道褐藻多糖硫酸 酯具有抗凝血、提高免疫力、抗腫瘤、抗病毒、降血糖、降血脂、抗輻射、以及用于治療慢性腎 衰、糖尿病腎病、心肌缺血和帕金森病等多種疾病。
[0004] 含量測定是藥物可靠性的重要依據。目前測定褐藻多糖硫酸酯含量的主要方法有 半胱氨酸硫酸法、Cameron法、氣相色譜法和液相色譜法。這些方法都需要將待分析的褐藻 多糖硫酸酯樣品先水解，再分離或衍生化，間接測定褐藻多糖硫酸酯中巖藻糖的含量， 因操作繁瑣，對定量分析不方便。而且由于不同褐藻多糖硫酸酯中巖藻糖含量有所不同， 依據巖藻糖來確定褐藻多糖硫酸酯的含量難免會有所偏差。
[0005] 同時，藥物開發必須對藥物的體內代謝產物和代謝機理進行研究，確保藥物在體 內的活性和安全性，也能夠指導新藥設計、優選給藥方案、改善藥物劑型等。褐藻多糖硫酸 酯經體內代謝后，血清、器官等生物組織中藥物濃度低，在分析前還要去除蛋白質、類脂等 其他影響結果測定的雜質，這必然造成褐藻多糖硫酸酯藥物一定程度的損失，使分析樣品 中藥物濃度更低。所以要進行這些樣品的微量檢測，難度很大，致使褐藻多糖硫酸酯的藥代 動力學研究一直進展緩慢。之前采用的半胱氨酸硫酸法、Cameron法由于檢測限度高，不能 用于微量分析。
[0006] 氣相色譜法和液相色譜法需將褐藻多糖硫酸酯水解為巖藻糖，再進行色譜分析。 由于巖藻糖在強酸條件下不穩定，導致水解后的巖藻糖測定結果重現性差、誤差較大，難以 對生物樣品中微量褐藻多糖硫酸酯進行準確分析。這就要求建立一種高靈敏度、重現性好 的微量分析方法，檢測體內樣品的褐藻多糖，為藥代動力學研究提供條件。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的是提供一種高靈敏度、重現性好、穩定性佳的褐藻多糖硫酸酯質量 分析方法。
[0008] 為實現上述目的，本發明提供的技術方案是，一種褐藻多糖硫酸酯的質量分析方 法，所述質量分析方法利用HPLC-柱后衍生-熒光檢測法對褐藻多糖硫酸酯進行含量分析， 其色譜條件為：色譜柱采用至少一根以上適合多糖的分離范圍為2, 000 - 1，000, 000道 爾頓的色譜柱組成；流動相采用50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6. 7)-乙腈（87:17, V/ V) ;HPLC 柱溫為室溫；流速為 0· 1 mL/min - 1. 0 mL/min ; 柱后衍生條件：衍生試劑：50 - 500 mmol/L鹽酸胍；反應液：0. 1 - 2.0 mol/L氫氧 化鈉；衍生液流速：〇. 2-0. 5 mL/min ;冷卻液：0. 5 mol/L氫氧化鈉；冷卻液流速：0. 1 - 0. 5 mL/min ;柱后反應器溫度：70-130 °C ; 熒光檢測條件：激發波長Ex=255 nm ;檢測器發射波長Em=430 nm ; 檢測方法采用外標法，以高純度褐藻多糖硫酸酯作為標準。
[0009] 其中，所述質量分析方法還有生物樣品前處理步驟：將血清或組織勻漿液中加入 0. 1-1.0 mol/L氯化鈉；根據褐藻多糖硫酸酯分子量大小，采用截留分子量大于褐藻多糖 硫酸酯分子量范圍的膜進行超濾離心。
[0010] 優選的，色譜條件為：色譜柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ(300 mmX7. 6 mm);柱 溫箱溫度：室溫；流動相：50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6. 7) -乙腈（87:17, V/V);高 效液相系統的流速：〇· 5 mL/min ;進樣體積：20 μ L。
[0011] 柱后衍生條件： 反應系統條件：衍生反應液濃度：〇. 5 mol/L氫氧化鈉和200 mmol/L鹽酸胍，衍生液流 速：0. 3 mL/min ;冷卻液：0. 5 mol/L氫氧化鈉，冷卻液流速：0. 3 mL/min ;柱后反應器溫度： 125。。。
[0012] 熒光檢測條件：檢測器激發波長Ex=255 nm ;檢測器發射波長Em=430 nm ;PMT=14 或17。
[0013] 優選的，所述質量分析方法的色譜條件為：色譜柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ (300 mmX7.6 mm)，加保護住：Shodex Asahipak GS-2G 7B (50mmX7. 6mm);柱溫箱溫度： 室溫；流動相：50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6. 7) -乙腈（87:17, V/V);高效液相系統 的流速：〇. 5 mL/min ;進樣體積：20 μ L ; 檢測器激發波長Ex=255 nm ;檢測器發射波長Em=430 nm ;ΡΜΤ=14或17 ; 衍生反應系統條件： 衍生反應液濃度：0.5 mol/L氫氧化鈉和200 mmol/L鹽酸胍，衍生液流速：0.3 mL/ min ;冷卻液：0. 5 mol/L氫氧化鈉，冷卻液流速：0. 3 mL/min ;柱后反應器溫度：125°C。
[0014] 與現有技術相比，本發明首次建立了一種利用HPLC-柱后衍生-熒光檢測法對褐 藻多糖硫酸酯進行含量測定的方法。該方法具有靈敏度高、重現性好、穩定性好等優點，適 合用于褐藻多糖硫酸酯的含量測定和藥代動力學研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015] 圖1是褐藻多糖硫酸酯鹽酸胍衍生物的最佳激發光譜和最佳發射光譜。
[0016] 圖2是褐藻多糖硫酸酯鹽酸胍衍生物的三維熒光譜圖。
[0017] 圖3是不同鹽酸胍濃度對衍生褐藻多糖硫酸酯熒光強度的影響。
[0018] 圖4是不同氫氧化鈉濃度對褐藻多糖硫酸酯衍生效率的影響。
[0019] 圖5是不同溫度對衍生后熒光效率的影響。
[0020] 圖6是血清中不同濃度褐藻多糖硫酸酯色譜圖（PMT=14)。
[0021] 圖7是柱后衍生法測定血清中褐藻多糖硫酸酯濃度標準曲線。
[0022] 圖8是兔單次靜脈注射褐藻多糖硫酸酯的藥時曲線。
[0023] 圖9是單次靜脈注射50mg/Kg褐藻多糖硫酸酯擬合曲線。
[0024] 圖10是兔血清單次靜脈注射褐藻多糖硫酸酯的藥時色譜圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明的內容之后，本領域技術人員可 以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本發明所限定的范圍。
[0026] 實施例1，褐藻多糖硫酸酯的制備 將500 g海帶除去泥沙，用20倍水在高壓鍋中提取3小時，控制溫度10(Tl05°C，提取 2次。除去藻體，合并2次提取液，用硅藻土抽濾，濾液濃縮，向濃縮液中加入2 mol/L MgCl2 使MgCl2終質量濃度為0. 05 mol/L，同時加入無水乙醇，使乙醇終重量濃度為20%，攪拌生 成沉淀，離心除去沉淀，取上清液，用3500Da透析袋透析2天，濃縮透析袋內溶液，凍干得褐 藻多糖，得率為1.85%。
[0027] 取上述凍干得到的褐藻多糖溶于水，配成濃度為2. 5%的水溶液，上樣到以 DEAE-Sepharose-CL_6B 為載體柱層析，依次用 0.1 mol/L NaCl、0.5 mol/L NaCl、1.0mol/ L NaCl、1.5 mol/L NaCl和2.0mol/L NaCl溶液線性梯度洗脫，收集各洗脫液，分別透析、凍 干。其中由1.0m〇l/L NaCl洗脫所得的白色絮狀沉淀即為純化的褐藻多糖硫酸酯。
[0028] 實施例2,羊棲菜褐藻多糖硫酸酯的制備 將500 g羊棲菜，用20倍水在高壓鍋中提取3小時，控制溫度100-105°C，提取2次。 除去藻體，合并2次提取液，用硅藻土抽濾，濾液濃縮，加入2 mol/L MgCl2使MgCl2終質量 濃度為〇. 05 mol/L，同時加入無水乙醇，使乙醇終重量濃度為20%，攪拌生成沉淀，離心除去 沉淀，上清液，用3500Da透析袋透析2天，濃縮透析袋內溶液，凍干得羊棲菜粗褐藻多糖硫 酸酯，得率為3.29%。
[0029] 實施例3,高效液相-柱后熒光衍生法測定褐藻多糖硫酸酯含量的條件優化與測 定 本實施例中所用褐藻多糖硫酸酯樣品為實施例1中所制備的純化的褐藻多糖硫酸酯。
[0030] (1)最佳激發波長和發射波長的確定。
[0031] 以鹽酸胍為衍生試劑的反應液配制：在試管中分別加入褐藻多糖硫酸酯樣品，鹽 酸胍，氫氧化鈉及硼砂，使得終濃度分別為褐藻多糖硫酸酯5 μ g/mL，鹽酸胍濃度50 mmol/ L，氫氧化鈉濃度為0. 5 mol/L，硼砂2 %。同時以空白作為對照。在110°C反應30 min，冷 卻至室溫。使用二維和三維掃描確定最佳激發和發射波長。實驗結果如附圖1和圖2。圖 1是褐藻多糖硫酸酯鹽酸胍衍生物的最佳激發光譜和最佳發射光譜，圖2是褐藻多糖硫酸 酯鹽酸胍衍生物的三維熒光譜圖。通過實驗確定最佳激發波長和最佳發射波長分別為激發 波長Ex=249nm ;發射波長Em=435nm。
[0032] (2)最佳反應體系條件的優化 色譜條件： 色譜柱：以倍壓管代替；進樣體積：20 μ L ;流動相：水；流動相流速：0. 5 mL/min ;衍 生液流速：〇. 3 mL/min ;冷卻液：0. 3mL/min ;檢測器激發波長Ex=249nm ;檢測器發射波長 Em=435nm; PMT=14 或 17。
[0033] 衍生反應液配制： 褐藻多糖硫酸酯樣品的配制：采用實施例1中所制備純化的褐藻多糖硫酸酯，配制濃 度為1 mg/mL的母液，分別稀釋到5 μ g/mL和10 μ g/mL。不同濃度鹽酸胍、氫氧化鈉，以 及反應溫度如表1，采用單一變量進行選擇最佳反應條件。實驗結果如附圖3、圖4和圖5 所示。圖3是不同鹽酸胍濃度對衍生褐藻多糖硫酸酯熒光強度的影響，圖4是不同氫氧化 鈉濃度對褐藻多糖硫酸酯衍生效率的影響，圖5是不同溫度對衍生后熒光效率的影響。通 過條件優化確定鹽酸胍濃度為50-50 m mol/L ;氫氧化鈉濃度為0· 1 - 2. 0 mol/L ;反應溫 度為 70-130 ° C。
[0034] 表1高效液相-柱后熒光衍生法優化衍生反應條件選擇
【權利要求】
1. 一種褐藻多糖硫酸酯的質量分析方法，其特征在于，所述褐藻多糖硫酸酯的質量分 析方法利用HPLC-柱后衍生-熒光檢測法對褐藻多糖硫酸酯進行含量分析，其色譜條件為： 色譜柱采用至少一根以上適合多糖的分離范圍為2, 00(Tl，000, 000道爾頓的色譜柱組成； 流動相采用50臟〇1/1磷酸二氫鉀緩沖液（？!16.7)-乙腈（87:17，￥八〇 ;流速為0.111117 min - 1. 0 mL/min ;柱溫為：20_40°C ; 柱后衍生條件：衍生試劑：50 - 500 mmol/L鹽酸胍；反應液：0. 1 - 2.0 mol/L氫氧 化鈉；衍生液流速：〇. 2-0. 5 mL/min ;冷卻液：0. 5 mol/L氫氧化鈉；冷卻液流速：0. 1 - 0. 5 mL/min ;柱后反應器溫度：70-130 °C ; 熒光檢測條件：激發波長Ex=255 nm ;檢測器發射波長Em=430 nm ; 檢測方法采用外標法，以高純度褐藻多糖硫酸酯作為標準。
2. 如權利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯的的質量分析方法，其特征在于，應用于藥代 動力學分析時，生物樣品前處理步驟為：將血清或組織勻漿液中加入O.fl.O mol/L氯化 鈉；根據褐藻多糖硫酸酯分子量大小，采用截留分子量大于褐藻多糖硫酸酯分子量范圍的 膜進行超濾離心。
3. 如權利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯的的質量分析方法，其特征在于，所述質量分 析方法的色譜條件為：色譜柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ (300 mmX7. 6 mm);柱溫箱溫 度：室溫；流動相：50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液（pH 6. 7) -乙腈（87:17, V/V);高效液相 系統的流速：〇. 5 mL/min ;進樣體積：20 μ L ; 柱后衍生條件： 反應系統條件：衍生反應液濃度：0.5 mol/L氫氧化鈉和200 mmol/L鹽酸胍，衍生液流 速：0. 3 mL/min ;冷卻液：0. 5 mol/L氫氧化鈉，冷卻液流速：0. 3 mL/min ;柱后反應器溫度： 125。。； 熒光檢測條件：檢測器激發波長Ex=255 nm;檢測器發射波長Em=430 nm;PMT=14或17。
4. 如權利要求1所述的褐藻多糖硫酸酯的的質量分析方法，其特征在于，所述質量分 析方法的色譜條件為：色譜柱：Shodex Asahipak GS-320 HQ(300 mmX7. 6 mm),加保護住： Shodex Asahipak GS-2G 7B(50mmX7. 6mm);柱溫箱溫度：室溫；流動相：50 mmol/L 磷酸二 氫鉀緩沖液（pH 6· 7) -乙腈（87:17, V/V);高效液相系統的流速：0· 5 mL/min ;進樣體積： 20 μ L ； 檢測器激發波長Ex=255 nm ;檢測器發射波長Em=430 nm ;ΡΜΤ=14或17 ; 衍生反應系統條件： 衍生反應液濃度：〇. 5 mol/L氫氧化鈉和200 mmol/L鹽酸胍，衍生液流速：0. 3 mL/ min ;冷卻液：0. 5 mol/L氫氧化鈉，冷卻液流速：0. 3 mL/min ;柱后反應器溫度：125°C。
【文檔編號】G01N30/88GK104280490SQ201310275429
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2013年7月2日 優先權日:2013年7月2日
【發明者】張全斌, 張文靜, 金維華, 王晶 申請人:南通中國科學院海洋研究所海洋科學與技術研究發展中心, 中國科學院海洋研究所