一種利用滸苔多糖制備富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種利用滸苔多糖制備富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002]滸苔多糖是一種由鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸組成并富含硫酸基的聚陰離子糖鏈。Tang et al.(2013)研究發現滸苔多糖的單糖組成為鼠李糖、木糖、葡萄糖醛酸，質量百分比分別為64.2%、18.2%、12.6%，硫酸基含量為19.6%,多糖分子量為103.51 KDa0 Ray etal.(2006)研究表明滸苔中鼠李糖為(I — 2,4)鍵連接，葡萄糖醛酸為(I — 4)鍵連接，木糖為(I — 4)鍵連接，硫酸基處于鼠李糖C-3端形成鼠李糖硫酸酯。
[0003]研究發現滸苔多糖具有抗腫瘤、抗凝血、降血糖血脂、提高免疫力、抗氧活性等功效。滸苔多糖含有兩種潛在功能糖成分:葡萄糖醛酸、鼠李糖硫酸酯。其中，葡萄糖醛酸有護肝解毒作用，是功能飲料、食品、化妝品的主要添加劑。而鼠李糖可參與合成香料、強心苷類藥物和外源凝集素等，具有明顯的免疫活性。與鼠李糖硫酸酯結構相似的巖藻糖硫酸酯被證實具有神經傳導、免疫調節等重要生理功能，因此鼠李糖硫酸酯是一種潛在的功能成分。
[0004]然而，在應用過程中，多糖較高的分子量和粘度降低了其生理功能。尋找一種專一性制備寡糖的方法成為解決其應用的有效手段。相比于化學法和物理法，微生物酶法有其潛在優勢:(1)反應高效、穩定，產物聚合度可控的優勢；(2)產物均一度好、收率高，易于分離、純化；(3)條件溫和，具有環境友好性，產物較好保留了糖鏈的活性基團。
[0005]然而，目前國內外尚未發現有關利用滸苔多糖通過微生物酶制備富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的研究報道。
【發明內容】
[0006]本發明提供一種利用滸苔多糖裂解酶制備富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法。該方法以滸苔多糖為原料，在微生物酶的作用下被專一性降解，進而獲得富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。本發明方法具有專一性好、條件溫和、產量高、寡糖活性基團完整、成本低等優點。對新型活性寡糖的開發、構效關系及應用開發都具有重要的現實意義。
[0007]本發明涉及的產將苔多糖裂解酶的菌株為feiefloraJw? sp.LP214,該菌株已于2014年4月20日保藏在中國武漢武漢大學中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNO:M2014136o
[0008]本發明提供的技術方法是采用如下步驟實現富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的制備:
(I)將Catenovulmi sp.LP214菌株接種到產酶培養基中進行發酵，其中產酶培養基組成為滸苔多糖10 g、酵母膏3 g，硫酸鎂4 g，氯化鈣0.5 g，氯化鈉20 g，硫酸銨1.5 g，磷酸高鐵0.2 g，自來水1000 ml, pH 7.5 ;發酵條件為32°C、36 h ;將發酵液10000 r/min離心5min,得上清液。
[0009](2)將步驟(I)中的上清液于40°C保溫30-45 min后取出冷卻至室溫得滸苔多糖裂解酶。
[0010](3)滸苔多糖溶于水制備0.1-2.5% (w/v)的滸苔多糖溶液，將步驟(2)獲得的滸苔多糖裂解酶按8-16 U/g (滸苔多糖)加入至滸苔多糖溶液中，于25-45°C，pH 5.0-7.5，酶解1-8 h ;其中I個酶活力單位定義為35°C條件下，每分鐘產生I ymol還原糖(以葡萄糖計)所需要的酶量。酶解完畢后，升溫至100°c,保溫1-2 min使酶滅活,冷卻后,8000 r/min離心10 min，取上清酶解液；將上清酶解液用截留分子量為3000 Da的超濾膜除去大分子物質，得到富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。
[0011]本發明方法制備的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖通過以下具體方法進行定量定性分析:
(I)將上述制備的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖經水解后，采用高效液相色譜法測定寡糖的單糖組成。以購買Sigma公司的甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖作為標準品，檢測寡糖的單糖組成(如圖1、圖2)。酶解產物分析結果表明，該類寡糖的單糖組成主要為鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖，其中鼠李糖含量> 30%。
[0012](2)將上述制備的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖采用氯化鋇比濁法進行硫酸基含量測定，寡糖硫酸基含量> 15%。
[0013](3)將上述制備的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖進行ES1-MS (負離子)分析，結果見圖3。其中豐度較高的片段有7種，分子量分別為402、628、760，982，1124，1268，1430，聚合度分別為2-8。根據寡糖的單糖組成和取代基分析結果，例如，402 Da的寡糖是由一個鼠李糖硫酸酯和一個葡萄糖醛酸組成的二糖。其它寡糖片段中分別含有2-4個不等的鼠李糖硫酸酯單元。
【附圖說明】
[0014]圖1為單糖標準品的液相色譜圖，其中出峰時間為21.668、25.986、27.971、29.957,31.077,32.949,34.884,35.469,36.126 min 分別為甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、
半乳糖醛酸、內標乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖。
[0015]圖2為水解后富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的液相色譜圖，在25.986、27.971、35.469 min分別出現吸收峰表明水解后富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖中含有鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖。
[0016]圖3為富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的質譜圖。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的制備方法，包括以下步驟:
CatenovuIum sp.LP214菌株接種到產酶培養基中進行發酵，其中產酶培養基組成為滸苔多糖10 g、酵母膏3 g，硫酸鎂4 g，氯化鈣0.5 g，氯化鈉20 g，硫酸銨1.5 g，磷酸高鐵0.2 g，自來水1000 ml, pH 7.5 ;發酵條件為32°C、36 h ;將發酵液10000 r/min離心5min,得上清液。
[0018](2)將步驟(I)中的上清液于40°C保溫30-45 min后取出冷卻至室溫得滸苔多糖裂解酶。
[0019](3)將I Kg滸苔多糖溶于100 L蒸餾水中，調pH為6-7。向滸苔多糖溶液中加入10個單位的由步驟(2)制備的滸苔多糖裂解酶進行酶解，I個酶活力單位定義為35°C條件下，每分鐘產生I μ mo I還原糖(以葡萄糖計)所需要的酶量；具體方法為于30°C, 100 r/min震蕩反應5 h ;酶解完畢后，升溫至100°C，保溫1-2 min使酶滅活，冷卻后，8000 r/min離心10min，取上清酶解液；將上清酶解液用截留分子量為3000 Da的超濾膜除去大分子的物質，得到富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。
[0020]實施例2
富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的制備方法，包括以下步驟:
CatenovuIum sp.LP214菌株接種到產酶培養基中進行發酵，其中產酶培養基組成為滸苔多糖10 g、酵母膏3 g，硫酸鎂4 g，氯化鈣0.5 g，氯化鈉20 g，硫酸銨1.5 g，磷酸高鐵0.2 g，自來水1000 ml, pH 7.5 ;發酵條件為32°C、36 h ;將發酵液10000 r/min離心5min,得上清液。
[0021](2)將步驟(I)中的上清液于40°C保溫30-45 min后取出冷卻至室溫得滸苔多糖裂解酶。
[0022](3)將2 Kg滸苔多糖溶于100 L蒸餾水中，調pH為6_7。向滸苔多糖溶液中加入10個單位的由步驟(2)制備的滸苔多糖裂解酶進行酶解，I個酶活力單位定義為35°C條件下，每分鐘產生I μ mo I還原糖(以葡萄糖計)所需要的酶量；具體方法為于35°C, 100 r/min震蕩反應5 h ;酶解完畢后，升溫至100°C，保溫1-2 min使酶滅活，冷卻后，8000 r/min離心10 min，取上清酶解液；將上清酶解液用截留分子量為3000 Da的超濾膜除去大分子物質，得到富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。
【主權項】
1.產滸苔多糖裂解酶的菌株，該菌株是Gatenovulumsp.LP214，保藏號CCTCC NO:M2014136，保藏單位:中國典型型培養物保藏中心。
2.一種利用滸苔多糖裂解酶制備富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法，步驟如下: (1)滸苔多糖裂解酶的獲得 將權利要求1所述的菌株接種到產酶培養基中進行發酵，發酵條件為32°C、36 h ;其中產酶培養基組成為滸苔多糖10 g、酵母膏3 g，硫酸鎂4 g，氯化鈣0.5 g，氯化鈉20 g，硫酸銨1.5 g，磷酸高鐵0.2 g,自來水1000 ml, pH 7.5 ;將發酵液10000 r/min離心5 min,得上清液，將上清液于40°C保溫30-45 min后取出冷卻至室溫得滸苔多糖裂解酶； (2)富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的制備 將滸苔多糖溶于水制備0.1-2.5% (w/v)滸苔多糖溶液，將步驟(I)獲得的滸苔多糖裂解酶加入滸苔多糖溶液中，于25-45°C，pH 5.0-7.5，酶解1_8 h ;酶解完畢后，升溫至100°C，保溫1-2 min使酶滅活，冷卻后，8000 r/min離心10 min,取上清酶解液；將上清酶解液用截留分子量為3000 Da的超濾膜除去大分子物質，得到富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖。
3.根據權利要求2的方法，其中所述的富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖，聚合度為2-8，分子量含有402、628、760 Da,鼠李糖硫酸酯的含量> 30%。
【專利摘要】本發明涉及一種利用滸苔多糖制備富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的方法，屬于生物技術領域。本發明利用菌株<i>Catenovulum</i><i></i>sp.LP214進行滸苔多糖裂解酶的發酵制備，利用該酶降解滸苔多糖制備富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖，條件為25-45℃，pH5-7.5，酶解時間1-8h。該富含鼠李糖硫酸酯嵌段寡糖的聚合度為2-8，其中鼠李糖硫酸酯的含量≥30%。制備方法具有操作簡單、條件溫和、產量高、單糖結構完整、成本低等優點，易于工業化生產。CCTCC NO：M201413620140420
【IPC分類】C12P19-14, C12R1-01, C12N1-20
【公開號】CN104560774
【申請號】CN201410298678
【發明人】王鵬, 李銀平
【申請人】中國海洋大學
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年6月30日