抗蟲基因mCry2Ab及其應用的制作方法

抗蟲基因mCry2Ab及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了抗蟲基因mCry2Ab及其應用，本發明提供了Cry2Ab蛋白、其編碼基因或含有其編碼基因的表達盒、重組載體、重組菌、轉基因細胞系或重組菌在提高植物抗蟲性中的應用；所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。本發明的實驗證明，本發明的抗蟲基因mCry2Ab更適合在植物細胞中高效穩定的表達；將mCry2Ab導入玉米后，可以得到穩定遺傳的mCry2Ab轉化體，使其具備相應的抗粘蟲活性，從而降低農藥的使用量，以減少環境污染，具有重要的經濟價值和廣闊的應用前景；3)還可以將本發明mCry2Ab基因轉化細菌或真菌，通過大規模發酵生產Bt蛋白，并將其制備成殺粘蟲劑，用于農作物害蟲的防治。
【專利說明】抗蟲基因 mCry2Ab及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及抗蟲基因 mCry2Ab及其應用。

【背景技術】
[0002] 隨著人口不斷增長，耕地面積日益減少，糧食安全問題日顯突出，持續提高糧食產 量顯得的尤為迫切，而蟲害是造成農業減產、品質下降的重要因素之一，所以，很早以前，人 們就致力于尋找一種理想的害蟲防治方法。20世紀40年代，由于化學工業的發展，人工合 成了有機殺蟲劑，一時間化學農藥就成為了農作物有害生物防治的主要手段。但經長期大 量不合理使用后，不但未徹底控制害蟲的危害，反而產生了害蟲抗性（Resistance)、害蟲再 猖獗（Resurgence)、農藥殘留（Residue)的3R問題，甚至污染了環境。因此，人們開始積極 探索新的害蟲防治方法和綜合治理體系。20世紀80年代發展起來的分子生物學技術為人 類有效防治農作物害蟲開拓了新的途徑。
[0003] 1983年美國華盛頓大學宣布成功將卡那霉素抗性基因導入煙草細胞，以及同年4 月美國威斯康星大學宣布成功將大豆基因轉入向日葵共同標志著植物轉基因技術的誕生。 1986年，首批轉基因植物（抗蟲、抗除草劑）被批準進入田間試驗。1989年哺乳動物抗體 重鏈和輕鏈基因在煙草中成功表達并正確組裝成有功能的抗體。隨后，轉基因技術開始迅 猛發展，大量轉基因植物陸續研制開發成功。
[0004] 玉米遺傳轉化起步于上世紀90年代，1990年Gordon-Kamm首次報道用基因槍轉化 玉米懸浮細胞系獲得了可育的轉化體，Koziel (1993)等培育出了抗蟲轉基因玉米，轉基因 植株能高水平表達CrylAb抗蟲基因。Ishida(1996)等首次利用超雙元載體建立了根癌農 桿菌轉化玉米自交系的幼胚。Frame(2002)等成功實現了根癌農桿菌利用普通的雙元載體 轉化幼胚。我國在轉基因玉米研究方面，已經建立了比較成熟的玉米轉基因技術體系，中國 農業大學較早的開展了玉米遺傳轉化的工作，1994年在國內外首次用子房注射的方法把抗 蟲基因 Bt轉入玉米并獲得轉基因植株。同時，在無選擇標記、選擇標記基因刪除和目標基 因產物定時降解、植物組織特異性優勢表達等核心技術創新方面已具有較強的創新能力。 張秀君（1999)等用基因槍法將兩個含高賴氨酸蛋白質基因導入玉米的胚性愈傷組織。劉 大文（2000)等將Zml3-Barna Se基因轉化玉米胚性愈傷組織，經過除草劑篩選得到陽性植 株。張艷貞（2002)等對根癌農桿菌介導法將Bt殺蟲基因導入優良玉米自交系進行了較為 系統的研究。Huang和Wei (2005)利用根癌農桿菌成功轉化了常規玉米自交系。
[0005] 截止目前，全球已有27個國家種植轉基因作物，種植面積從1996年的170萬公頃 增加到2013年的1. 75億公頃，增加了 100倍以上，使轉基因作物成為現代農業史上采用最 為迅速的作物技術。從農民和消費者的收益來講，其采用率不言而喻。利用植物轉基因技 術培育的抗蟲植物具有以下優點：（1)抗蟲基因資源豐富；(2)縮短了育種時間，且可同時 導入多個優良基因；（3)轉基因植物只殺死靶標害蟲，對其它生物無毒害或毒害作用小，目 的性強；(4)在植株內部表達殺蟲蛋白，不易被環境因素所破壞，同時也不污染環境。因此， 轉基因植物具有良好的應用前景。
[0006] 在培育轉基因作物時關鍵是針對目標害蟲篩選到優良的Bt抗蟲基因，并 使其在作物中高表達。Bt基因編碼殺蟲晶體蛋白，來自蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)，該菌為革蘭氏陽性土壤桿菌，屬于芽孢桿菌屬，其菌體為短桿狀，生鞭毛， 單生或形成短鏈。它在芽孢形成過程中產生稱為S-內毒素的殺蟲伴胞晶體蛋白，這些蛋 白對鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等多種昆蟲具有特異性的殺蟲活性。1981年Schenpf 和Whiteley從蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis)中克隆了第一個編碼δ -內毒 素的 cry 基因 CrylAal。1989 年 Widner W. R和 Whiteley Η. R從蘇云金芽抱桿菌（Bacillus thuringiensis)中克隆了 Cry2Ab基因。目前已分離的抗蟲基因很多，主要的抗蟲基因有： @細菌來源的抗蟲基因，主要是財毒蛋白基因（07認13、(：巧認(3、(：巧2、(：巧3等） ；@植物來 源的蛋白酶抑制劑基因，特點在于抗蟲譜廣、來源于植物本身易于被公眾接受；③細菌來源 的營養殺蟲蛋白（Vipl、Vip2、Vip3等），廣譜抗鱗翅目，特別是對小地老虎、甜菜夜蛾具有 較強作用。
[0007] 隨著高通量測序技術的發展，確定某核苷酸序列為Bt基因將越來越容易，截止到 目前，已確定千余種抗蟲基因，但大部分并沒有在實際生產中應用，如何利用抗蟲基因將成 為關鍵。首先，在利用抗蟲基因前要確定其對某種害蟲的抗性，因為一種抗蟲基因往往只對 一種或幾種靶標害蟲起作用，明確其作用對象是利用該基因的前提條件；其次，要使抗蟲基 因適合在受體細胞中高表達，抗蟲基因大多來源于細菌等微生物，其密碼子與植物有較大 差異，在轉化前需根據受體的密碼子特征進行優化。
[0008] 粘蟲Mythimnaseparata(Walker)屬鱗翅目夜蛾科，又稱剃枝蟲，行軍蟲，主要危 害玉米、水稻、小麥、粟、高粱、甘蔗等作物，是我國及亞洲其他國家糧食作物的重大害蟲， 曾給我國的糧食生產帶來了重大的經濟損失（李光博等，1964 ;李光博，1979 ;Sharma and Davies, 1983 ;Hirai，1995 ;Lee and Uhm，1995)。粘蟲每年由南到北的季節性遷飛，不僅使 得其危害十分嚴重，而且危害范圍十分廣闊（李光博，1979,1995;常雪等，2007)。東北春 玉米區和華北夏玉米區常遭受二、三代粘蟲的危害。粘蟲是一種暴食性害蟲，尤其在幼蟲成 群結隊遷移時，更是饑不擇食，除極少數幾種植物外，幾乎所有綠色作物均被掠食一空，造 成大幅減產，甚至顆粒無收。粘蟲的5、6齡幼蟲進入暴食期，食量劇增，取食量分別占全幼 蟲期的14. 3 %和75%，常造成作物葉片被大量取食。目前，在北美及歐洲，粘蟲危害發生較 輕，國外對粘蟲抗性基因的報道較少。國內主要進行了 CrylAb蛋白對粘蟲的抗性研究，王 冬研等（2004)和王振營等（2005)利用M0N810和Btll對初孵幼蟲和5齡幼蟲進行抗性研 究，結果表明CrylAb蛋白對粘蟲有很好的控制效果，喂食3天后初孵幼蟲全部死亡，喂食12 天后5齡幼蟲全部死亡，目前還沒有其他基因對粘蟲抗性的研究。鑒定對粘蟲有抗性的基 因并在玉米中高表達對保證玉米產量有著重要意義。


【發明內容】

[0009] 本發明的一個目的是提供Cry2Ab蛋白、其編碼基因或含有其編碼基因的表達盒、 重組載體、重組菌、轉基因細胞系或重組菌的用途。
[0010] 本發明提供了 Cry2Ab蛋白、其編碼基因或含有其編碼基因的表達盒、重組載體、 重組菌、轉基因細胞系或重組菌在提高植物抗粘蟲性中的應用；
[0011] 所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0012] 上述應用中，所述Cry2Ab蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末 端第1114-3015位核苷酸或序列表中序列3自5'末端第1114-3015位核苷酸。
[0013] 上述應用中，所述重組載體為將所述Cry2Ab蛋白編碼基因插入表達載體得到的 重組載體；
[0014] 所述重組菌為將所述重組載體導入目的菌中得到的重組菌。
[0015] 上述表達載體為PCAMBIA3301或pEASY-El，在本發明的實施例中，所述重組載體 為 pEASY-El-mCry2Ab、pCAMBIA3301+Cry2Ab 或 pCAMBIA3301+mCry2Ab ;
[0016] pEASY-El_mCry2Ab為將序列表中序列1自5'末端第1114-3015位所不mCry2Ab 基因插入PEASY-El原核表達載體（直接TA連接）得到的重組載體；
[0017] pCAMBIA3301+Cry2Ab為將序列表中序列3所示的核苷酸插入PCAMBIA3301 (北 京鼎國昌盛生物技術有限公司貨號MCV039)的Spel和BstEII酶切位點得到的載體，表達 Cry2Ab 蛋白。
[0018] pCAMBIA3301+mCry2Ab為將序列表中序列1所示的核苷酸插入pCAMBIA3301的 Spel和BstEII酶切位點得到的載體。
[0019] 上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為玉米。
[0020] Cry2Ab蛋白、其編碼基因或含有其編碼基因的表達盒、重組載體、重組菌、轉基因 細胞系或重組菌在制備抗粘蟲或滅粘蟲產品中的應用也是本發明保護的范圍。
[0021] 上述應用中，所述廣品為藥品。
[0022] 本發明另一個目的是提供一種培育轉基因植物的方法。
[0023] 本發明提供的方法，為將Cry2Ab蛋白編碼基因轉入目的植物中，得到轉基因植 物，所述轉基因植物抗蟲性高于所述目的植物；所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列為序列表中 序列2。
[0024] 上述方法中，所述蟲為粘蟲；
[0025] 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為玉米。
[0026] 所述Cry2Ab蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第 1114-3015位核苷酸或序列表中序列3自5'末端第1114-3015位核苷酸。
[0027] 本發明的第三個目的是提供一種DNA分子。
[0028] 本發明提供的DNA分子，命名為mCry2Ab，其為如下1) -3)中任一所述的DNA分子：
[0029] 1)編碼區為序列表中序列1自5'末端第1114-3015位核苷酸；
[0030] 2)在嚴格條件下與1)雜交且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子；
[0031] 3)與1)具有90%以上同源性且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子。
[0032] 上述嚴格條件可為用0. IX SSPE (或0. I XSSC)，0. 1 % SDS的溶液，在DNA或者RNA 雜交實驗中65°C下雜交并洗膜。
[0033] 含有上述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉基因細胞系或重組菌也是本發 明保護的范圍；
[0034] 所述重組載體具體為將上述的DNA分子插入表達載體得到的重組載體；所述表達 載體尤其具體為PCAMBIA3301。重組載體pCAMBIA3301+mCry2Ab為將序列表中序列1所示 的核苷酸插入PCAMBIA3301的Spel和BstEII酶切位點得到的載體。
[0035] 上述技術方案表明，
[0036] 首先，在利用抗蟲基因前要確定其對某種害蟲的抗性，因為一種抗蟲基因往往只 對一種或幾種靶標害蟲起作用，明確其作用對象是利用該基因的前提條件，而這并不能通 過同源比對等生物信息技術實現，必須通過田間或室內的抗蟲性鑒定才能確定。
[0037] 其次，要使抗蟲基因適合在受體細胞中高表達，抗蟲基因大多來源于細菌等微生 物，其密碼子與植物有較大差異，在轉化前需根據受體的密碼子特征進行優化。遺傳密碼有 64種，但是絕大多數生物傾向于利用這些密碼子中的一部分。那些被最頻繁利用的稱為最 佳密碼子，那些不被經常利用的稱為稀有或利用率低的密碼子。實際上用做蛋白表達或生 產的每種生物（包括大腸桿菌，酵母，哺乳動物細胞，植物細胞和昆蟲細胞）都表現出某種 程度的密碼子利用的差異或偏愛。大腸桿菌、酵母、果蠅、靈長類等每種生物都有獨特的8 個密碼子極少被利用。靈長類和酵母有6個同樣的利用率低的密碼子。大腸桿菌、酵母和 果蠅中編碼豐度高的蛋白質的基因明顯避免低利用率的密碼子。因此，重組蛋白的表達可 能受密碼子利用的影響（尤其在異源表達系統中）。某一基因利用的密碼子可能不是其正 在利用的蛋白生產系統進行高水平表達所偏愛的密碼子，將會影響目標蛋白的獲得。
[0038] 在同源表達系統中，同較低水平表達的基因相比，較高表達的基因可能有很不同 的密碼子偏愛。通過對密碼子利用的歸類分析，可以真正預測任何基因在某一物種中的表 達水平。通過對玉米不同組織RNA-seq數據分析發現，大量高表達基因強烈偏愛以G或C 結尾的密碼子，這為在玉米中表達外源基因提供了指導。
[0039] 本發明的實驗證明，
[0040] 1)本發明對Cry2Ab密碼子進行了改造，改造后的mCry2Ab核苷酸序列與原始的 Cry2Ab同源性僅為66%，G+C含量也由原來的34. 23%變為62. 99%，使用植物偏愛性密 碼子，減少了原始DNA序列中的富含AT序列和存在的反向重復序列，本發明的抗蟲基因 mCry2Ab更適合在植物細胞中高效穩定的表達；
[0041] 2)本發明將mCry2Ab導入玉米后，可以得到穩定遺傳的mCry2Ab轉化體，使其具備 相應的抗粘蟲活性，從而降低農藥的使用量，以減少環境污染，具有重要的經濟價值和廣闊 的應用前景；
[0042] 3)還可以將本發明mCry2Ab基因轉化細菌或真菌，通過大規模發酵生產Bt蛋白， 并將其制備成殺粘蟲劑，用于農作物害蟲的防治。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0043] 圖1為Cry2Ab基因與mCry2Ab基因核苷酸序列比較分析圖
[0044] 圖2為原核表達Cry2Ab蛋白
[0045] 圖3為Cry2Ab及mCry2Ab基因的植物表達載體圖譜
[0046] 圖4為利用免疫檢測試紙檢測Bt Cry2Ab蛋白表達
[0047] 圖5為轉Cry2Ab玉米和轉mCry2Ab玉米不同事件表達量檢測
[0048] 圖6為轉mCry2Ab玉米植株田間抗蟲性鑒定
[0049] 圖7為TO代轉mCry2Ab玉米株系目的基因的PCR檢測
[0050] 圖8為TO代轉空載體玉米選擇標記基因的PCR檢測
[0051] 圖9為TO代轉Cry2Ab玉米目的基因的PCR檢測

【具體實施方式】
[0052] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0053] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0054] 實施例1、通過密碼子優化得到mCry2Ab基因
[0055] 本發明對Cry2Ab蛋白（氨基酸序列為序列表中序列2,其編碼基因 Cry2Ab的核苷 酸序列為序列表中序列3自5'末端第1114-3015位核苷酸）的活性區域進行了細致的分 析，在保證進一步提高其表達水平的前提下，按照玉米高表達基因編碼特征對Cry2Ab基因 進行了基因密碼子改造，得到mCry2Ab基因，該基因的核苷酸序列為序列表中序列1自5' 末端第1114-3015位核苷酸，表達的蛋白仍然是序列表中序列2所示的Cry2Ab蛋白。
[0056] Cry2Ab與mCry2Ab核苷酸序列比對如圖1所示，改造前后密碼子使用率見下表1， 二者僅有66%同源性，G+C含量也由原來的34. 23%變為62. 99%，密碼子使用率發生了明 顯變化。
[0057] 表1為改造前后密碼子使用率
[0058]

【權利要求】
1. Cry2Ab蛋白、其編碼基因或含有其編碼基因的表達盒、重組載體、重組菌、轉基因細 胞系或重組菌在提高植物抗粘蟲性中的應用； 所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特征在于：所述Cry2Ab蛋白編碼基因的核苷酸序列 為序列表中序列1自5'末端第1114-3015位或序列表中序列3自5'末端第1114-3015位。
3. 根據權利要求1或2所述的應用，其特征在于： 所述重組載體為將所述Cry2Ab蛋白編碼基因插入表達載體得到的重組載體； 所述重組菌為將所述重組載體導入目的菌中得到的重組菌。
4. 根據權利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于： 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為玉米。 5. Cry2Ab蛋白、其編碼基因或含有其編碼基因的表達盒、重組載體、重組菌、轉基因細 胞系或重組囷在制備抗粘蟲或滅粘蟲廣品中的應用。
6. 根據權利要求5所述的應用，其特征在于：所述產品為藥品。
7. -種培育轉基因植物的方法，為將Cry2Ab蛋白編碼基因轉入目的植物中，得到轉基 因植物，所述轉基因植物抗蟲性高于所述目的植物；所述Cry2Ab蛋白的氨基酸序列為序列 表中序列2。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述蟲為粘蟲； 所述Cry2Ab蛋白編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列1自5'末端第1114-3015位 或序列表中序列3自5'末端第1114-3015位； 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述單子葉植物具體為玉米。
9. 一種DNA分子，其為如下1)-3)中任一所述的DNA分子： 1) 編碼區為序列表中序列1自5'末端第1114-3015位核苷酸； 2) 在嚴格條件下與1)雜交且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子； 3) 與1)具有90%以上同源性且編碼權利要求1所述蛋白的DNA分子。
10. 含有權利要求9所述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉基因細胞系或重組 菌； 所述重組載體具體為將權利要求9所述的DNA分子插入表達載體得到的重組載體；所 述表達載體尤其具體為PCAMBIA3301。
【文檔編號】C12N15/32GK104313036SQ201410483143
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月19日 優先權日:2014年9月19日
【發明者】賴錦盛, 趙海銘, 宋偉彬, 崔陽 申請人:中國農業大學