一種人源抗蟲基因及其編碼的抗Cry1C毒素獨特型單鏈抗體與應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的人源抗蟲基因，以及由該人源抗蟲基因編碼的氨基酸序列為SEQIDNO.2的抗Cry1C毒素獨特型單鏈抗體；該抗體為“β”類型，具有殺蟲活性，經原核系統表達后，其初級培養物具有與稻縱卷葉螟中腸圍食膜特異性受體BBMV的結合活性；本發明不經動物免疫而獲得“β”類型的抗Cry1C毒素獨特型單鏈抗體，制備周期短，氨基酸序列小，適合體外大規模生產，同時，本發明作為全新的新抗蟲基因資源，對降低現有Bt毒素廣泛使用存在的各類安全風險、替代Bt毒素用于農業害蟲的生物防治、減少殺蟲劑的使用具有重要意義。
【專利說明】一種人源抗蟲基因及其編碼的抗CryIC毒素獨特型單鏈抗體與應用【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程和生物防治領域，特別是一種人源抗蟲基因及其編碼的抗CrylC毒素獨特型單鏈抗體與應用。
【背景技術】
[0002]目前全球廣泛用于生物防治病蟲害的殺蟲基因是蘇云金芽孢桿菌OfeciJAz1Sthuringiensi5, Bt)的 Bt 毒素基因(例如 CrylC、CrylAb、CrylB、CrylF 等)。蘇云金芽孢桿菌是一種昆蟲性病原細菌，其產生的Bt毒素對多種農、林害蟲都有具有特異性毒殺作用。到1987年比利時植物遺傳系統公司(Plant Genetic Systems)就在世界上首次報道了轉Bt基因抗蟲煙草獲得成功，到現在，Si基因已經被轉到玉米、水稻、棉花、番茄、馬鈴薯、煙草等世界主要農作物中。據2012年國際生物技術應用服務組織統計，中國種植的轉Si棉面積就已經超過390萬公頃，占棉花種植總面積的71.5 %。然而，隨著轉Si基因作物的應用和推廣，其在基因逃逸、改變土壤微生物生態結構、物種的耐藥性以及危害正常免疫系統等方面可能存在的潛在危害備受社會關注。“轉Bt基因玉米根際微生物和細菌生理群多樣性”(王敏等，生態學雜志，2010年03期)和“轉Bt基因玉米對土壤細菌數量多樣性的影響”(劉玲等，生態與農村環境學報，2011年03期)分別對室內、室外種植轉Bt玉米的土壤進行了細菌數量和多樣性分析，結果都發現種植轉Bt玉米的與空白對照組相比出現顯著差異。
[0003]uCrylAc protoxin from Bacillus thuringiensis sp.kurstaki HD73 bindsto surface proteins in the mouse small intestine” (Vazquez-Padron 等，BiochemBiophys Res Commun, 2000年01期)在動物試驗發現，當小鼠攝取的Bt內、外毒蛋白達到10 mg/kg和100 mg/kg時，小鼠的T細胞ANAE陽性率、脾臟指數及巨噬細胞的吞噬功能均出現了明顯的抑制反應，隨著攝取劑量的增加，這種抑制作用越發明顯。試驗還發現，當Bt毒素蛋白在動物體內的蓄積系數`大于6.24時，可以導致肝臟、腎臟及胃腸道等損傷，在肝臟和腎臟中可以觀察到細胞腫脹和空泡樣變性異象，并且能看見腎小球血管上皮細胞的病變，當然這也不能排除是由免疫反應造成的。長期大劑量使用Bt毒素蛋白，還會導致動物白細胞總數和血紅蛋白含量顯著性下降，這也說明Bt毒素蛋白具有明顯的免疫抑制毒性。開拓具有Bt毒素生物活性的替代生物效應物(例如:抗獨特型抗體)是開發生物農藥領域研究的熱點。
[0004]1974年，丹麥免疫學家Jerne在其“免疫網絡學說(Immune Network Theory)”中首次提出抗獨特型抗體的概念。抗獨特型抗體(Ant1-1diotype antibody,以下簡稱Ant1-1d)是指針對位于抗體分子可變區的獨特型(Idiotype, Id)產生的特異性抗體。Bona等根據Id與Ant1-1d的血清學反應以及AId的功能，將抗獨特型抗體分為4種類型(α，β，Υ和ε)。β型抗獨特型抗體由于具有“內影像”作用，即具有與(半)抗原相同的抗原決定簇，因而可以具有抗原的功能和生物活性。
[0005]目前普遍認為采用噬菌體展示技術，通過構建噬菌體抗體庫，經特異性篩選，可以獲得具有靶標抗原類似效應的抗獨特型抗體。采用噬菌體展示技術篩選特異性抗體的過程稱為“淘選(Panning)”，主要包括結合、洗滌、洗脫和擴增4個步驟。Raats等采用抗皮質醇單克隆抗包被做為固相抗原直接進行篩選，在進行篩選之前，用相同種屬的陰性單克隆抗體進行負篩選以避免篩選到與抗體恒定區結合的重組抗體片段，最終成功篩選到針對皮質醇的Ant1-1d。Goletz等同樣利用噬菌體抗體展示系統并研究比較了不同洗脫方法對抗獨特型抗體片段篩選結果的影響，最終篩選到的96個克隆中有28個為具有抗獨特型特性的陽性克隆。目前針對可替代Bt活性效應物，特別是抗Bt毒素類型的抗獨特型單鏈抗體(以下簡稱Ant1-1d ScFvs)小分子多肽等相關材料及產品還未見報道。
【發明內容】
[0006]針對目前轉Bt毒素作物及其毒素制劑的廣泛應用存在的安全隱患及超敏反應等問題，開拓具有Bt毒素生物活性的可替代生物效應物及其在生物防治害蟲中的應用，本發明是這樣實現的: 一種人源抗蟲基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本發明中，由SEQ ID N0.1編碼的抗CrylC毒素獨特型單鏈抗體，其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2 所示。
[0008]本發明中，一種含有人源抗蟲基因SEQ ID N0.1的原核表達載體。
[0009]本發明中，一種人源抗蟲基因SEQ ID N0.1在農業害蟲防治方面的應用。
[0010]本發明中，一種含氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的抗CrylC毒素獨特型單鏈抗體的殺蟲劑。
[0011]本發明從公開的人類基因庫中，篩選獲得I種具有殺蟲活性的“ β ”類型抗CrylC毒素獨特型單鏈抗體，該單鏈抗體經原核系統表達，其初級培養物具有與稻縱卷葉螟中腸圍食膜特異性受體BBMV的結合活性，本發明不經動物免疫而獲得“ β ”類型的抗CrylC毒素獨特型單鏈抗體，制備周期短，氨基酸序列小，適合體外大規模生產；同時，本發明作為全新的新抗蟲基因資源，對探索拓展具有模擬Bt毒素生物活性的新型抗蟲基因資源，降低現有Bt毒素廣泛使用存在的各類安全風險乃至以后可能替代Bt用于農業害蟲的生物防治，減少殺蟲劑的使用等具有重要的科學及現實意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0012]圖1為Ε8 ELISA檢測結果示意圖。
[0013]圖2為Ε8生物學測定結果示意圖。
[0014]圖3為分別喂食經ES、CK+、CK-浸泡過的水稻葉片后的稻縱卷葉螟三齡幼蟲死亡情況示意圖。
[0015]圖4為分別喂食經ES、CK+、CK-浸泡過的甘藍片后的小菜蛾三齡幼蟲死亡情況示意圖。
【具體實施方式】
[0016]實施例1篩選人源抗蟲基因 實施例所涉及的試劑和培養基配方:(D2XTY液體培養基:
在900 mL雙蒸水中加入16 g胰蛋白胨，10 g酵母提取物和5 g NaCl，攪拌混勻，用雙蒸水定容到I L，置于高壓滅菌鍋中，12rC，20min滅菌，冷卻后，置于4°C保存備用。
[0017](2 ) 2 X TY-AG 液體培養基:
在2XTY的培養基中加入終濃度為100 μ g/ml氨芐青霉素和質量比為I %葡萄糖。
[0018](3 ) 2 X TY-AK 液體培養基:
在2XTY的培養基中加入終濃度為100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素。
[0019](4 ) 2 X TY-AKG 液體培養基:
在2XTY的培養基中加入終濃度為100 μ g/ml氨芐青霉素、50 μ g/ml卡那霉素和質量比為I %葡萄糖。
[0020](5 ) TYE固體培養基:
在900 ml雙蒸水中加入15.0 g瓊脂糖，8 g NaCl，10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，用雙蒸水定容到I L，置于高壓滅菌鍋中，12rC，20min滅菌，冷卻后，置于4°C保存備用。
[0021 ] (6) TYE-AG 固體培養基:
在TYE固體培養基中加入終濃度為100 μ g/ml氨芐青霉素和質量比為I %葡萄糖。
[0022](7) PBS 溶液
稱取 NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4.12H20 2.9 g，KH2PO4 0.2 g，分別加入到蒸餾水中，充分溶解后，定容到I L。
[0023](8) PBST 溶液
在PBS溶液中加入體積比為0.05%的吐溫-20。
[0024](9)PEG/NaCl 溶液:
稱取20 g PEG 8 000,14.61 g NaCl，加80 ml去離子水，定容到100 ml，置于高壓滅菌鍋中，121°C，20min滅菌，冷卻后，置于4°C保存備用。
[0025](10)檸檬酸鹽緩沖液(CPBS，底物緩沖液，ρΗ5.5):
取C6H7O8 (檸檬酸)21 g, Na2HPO4.12Η20 71.6 g，分別加入到蒸餾水中充分溶解后定容至Ij I L。
[0026](11)四甲基聯苯胺(TMB)溶液:
稱取10 mg四甲基聯苯胺溶于I ml 二甲基亞砜中，避光，置于4 °C保存備用。
[0027](12)底物顯色溶液:
10 ml 配方成分:9.875 ml CPBSU00 μ I TMB 溶液、25 μ I 體積比為 20% Η202。
[0028]實施例所涉及材料來源:
抗CrylC多克隆抗體、BBMV、不相關的抗獨特型單鏈抗體、非“β ”類型的Ant1-1dScFv、甘藍葉片、小菜蛾三齡幼蟲均由江蘇省農業科學院農業部農產品質量安全控制技術與標準重點實驗室提供；
人源化的噬菌體抗體庫、TGl細菌和輔助噬菌體KM13購于英國Source BioScience公
司；
HRP-羊抗M13-1gG購于武漢博士德公司；
CrylC毒素和CrylAb毒素購于上海佑隆生物科技有限公司；
水稻葉片和縱卷葉螟三齡幼蟲由揚州綠源生物化工有限公司提供。[0029]實施例1篩選抗CrylC毒素獨特型單鏈抗體
(1)取人源化的噬菌體抗體庫菌液20μ I加入到200 ml 2 X TY-AG液體培養基中，37°C恒溫培養到OD600為0.4，取50 ml菌液，加入I X 1012pfu輔助噬菌體KMl3進行超感染，于37 °C孵育30 min后以3300 g離心10 min,棄上清液，用100 ml 2XTY-AKG液體培養基重懸沉淀，30 °C培養過夜；次日3300 g離心30 min，收集上清液并加入20 ml PEG/NaCl溶液，冰浴I h后再3300 g離心30 min，用4 ml PBS重懸沉淀；重懸液以11600 g離心10min，上清液即為擴增的噬菌體抗體庫；
(2)取步驟I獲得的擴增的噬菌體抗體庫進行4輪淘篩:第I輪淘篩將4 ml 100Ug /ml的抗CrylC多克隆抗體包被于細胞培養瓶底部，4 °C過夜，次日分別用I ml PBS清洗細胞培養瓶3次后加入混勻的I ml擴增的噬菌體抗體庫與4 ml 3%的MPBS溶液，置于搖床于室溫下緩慢搖動I h，再靜置I h后傾去培養瓶中液體，分別用I ml PBST溶液洗瓶20次,加入Iml 10mg/ml的胰蛋白酶(Trypsin)洗脫特異性結合的曬菌體抗體,洗脫液即為第I輪淘篩的噬菌體抗體；第2、3、4輪淘篩的包被抗CrylC多克隆抗體濃度分別為50 yg /ml,25 yg /ml UO yg /ml，所使用的噬菌體抗體為前一輪淘篩獲得的噬菌體抗體，淘篩方法與第I輪相同；取第4輪淘篩的噬菌體抗體10 μ I侵染I ml處于對數生長期的TGl細菌，37 °C孵育I h后，涂布于TYE-AG固體培養基上，37 1:培養過夜；次日隨機挑取單菌落，接種到含100 μ I/孔2 X TY-AG液體培養基的96孔板中，37 °C培養過夜；次日從板孔中吸出2 μ I菌液轉接到新的96孔板孔中，37 °C孵育2 h，每孔加入25 μ I滴度為IO12的輔助噬菌體KM13，30 °C孵育2 h，1800 g離心10 min，用150 μ I 2ΧΤΥ-ΑΚ液體培養基重懸沉淀后30 1:培養過夜，次日1800 g離`心30 min，分別取上清液；
(3)取4μ g /ml的抗CrylC多克隆抗體加入到96孔板中，100 μ I/孔，4 °C過夜，次日每孔分別加入100 μ I步驟2獲得的上清液，陰性對照加100 μ I 2 X TY-AK液體培養基，37 °C水浴2 h，每孔用250 μ I PBST洗板后，每孔加入100 μ I 1:5000稀釋的HRP-羊抗M13-1gG，37°C孵育2 h ;每孔加入100 μ I底物顯色溶液，室溫下反應1(T20 min至出現藍色，最后每孔加入50 μ I濃度為2 mol/L的H2SO4快速終止反應后用酶標儀測定OD450值，其中溶液OD45tl值/陰性對照OD45tl值大于2.1的，判斷為陽性，與該溶液對應的步驟2中的上清液即為篩選到的含有抗CrylC毒素獨特型單鏈抗體的上清液。
[0030]以Sanger測序法測定篩選到的抗CrylC毒素獨特型單鏈抗體核苷酸序列為SEQID N0.1 如下:
tctatttcaa ggagacagtc ataatgaaat acctattgcc tacggcagcc gctggattgt60
tattactcgc ggcccagccg gccatggccg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct 120 tggtacagcc tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc acctttagca 180 gctatgccat gagctgggtc cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg gtctcatcga 240 ttagtaagca tggtagtagg acaacttacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct 300 ccagagacaa ttccaagaac acgctgtatc tgcaaatgaa cagcctgaga gccgaggaca 360 cggccgtata ttactgtgcg aaacggagta ggctgtttga ctactggggc cagggaaccc 420 tggtcaccgt ctcgagcggt ggaggcggtt caggcggagg tggcagcggc ggtggcgggt 480 cgacggacat ccagatgacc cagtctccat cctccctgtc tgcatctgta ggagacagag 540 tcaccatcac ttgccgggca agtcagagca ttagcagcta tttaaattgg tatcagcaga 600
【權利要求】
1.一種人源抗蟲基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.一種由權利要求1所述人源抗蟲基因編碼的抗CrylC毒素獨特型單鏈抗體，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.一種含有權利要求1所述人源抗蟲基因的原核載體。
4.一種如權利要求1所述人源抗蟲基因在農業害蟲防治方面的應用。
5.一種含權利要求2所述抗 CrylC毒素獨特型單鏈抗體的殺蟲劑。
【文檔編號】C12N15/13GK103773776SQ201410037240
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月26日 優先權日:2014年1月26日
【發明者】劉賢金, 徐重新, 張霄, 劉媛, 謝雅晶, 張存政, 余向陽, 王冬蘭 申請人:江蘇省農業科學院