禽類胚胎細胞的制備
【專利說明】禽類胚胎細胞的制備
[0001] 相關申請的交叉引用
[0002] 本申請要求于2013年3月5日提交的美國申請編號13/785513的權益。
[0003] 本發明涉及由禽胚制備細胞的組合物和方法。本發明還涉及這些細胞的培養物及 其用途，尤其是用于生產病毒如MDV的用途。本發明還涉及使用這些細胞或病毒制備疫苗 的方法。
【背景技術】
[0004] 受精的禽蛋，如雞蛋，是生產人類和獸用疫苗的主要基質之一。使用它們的原因是 它們能夠支持包括復制缺陷型病毒的多種多樣的人和動物病毒的復制。在禽類胚胎細胞中 生產的疫苗的實例包括例如MDV疫苗、禽呼腸孤病毒疫苗和傳染性法氏囊病病毒疫苗。
[0005] 在禽類胚胎細胞中生產疫苗需要由無特定病原體的（SPF)禽群持續可靠地提供 受精卵。SPF禽群被飼養于特殊環境下并且定期被證明為無禽類病原體（D.H. Thornton， "馬立克氏病：科學依據和控制方法：疫苗的質量控制和標準化（Marel s Diseases: Scientific Basis and Methods of Control ：quality control and standardization of vaccines.) "（L. N. Payne，Ed.)，Martinus Nijoff Publishing，波士頓，MA，第 267-292 頁 (1985))。從蛋中獲得胚胎，將其斷頭，然后進行處理（通常通過機械和/或酶處理）從而 生產初生胚胎細胞，通常是胚胎成纖維細胞。通常，將胚胎與頭分離并收集在燒杯中。然后 將僅有身體的胚胎轉移至胰蛋白酶培養瓶，其中在冷胰蛋白酶（比室溫冷）中所述胚胎被 胰蛋白酶化（trypsinized)3次，每次10分鐘。將包含分離的細胞的消化緩沖液傾倒通過 篩網（Imm目徑）至含血清的酸瓶中。通過離心濃縮收集的CEF，并且將其冷凍直至使用。
[0006] 然后可以培養這些細胞并將其用于生產病毒。
[0007] 例如，目前的馬立克氏病疫苗是感染的雞胚細胞（CEF)的懸液，或由感染有馬立 克氏病病毒疫苗株的超聲粉碎的CEF制得的無細胞病毒懸液（A.E. Churchill，"馬立克 氏病：科學依據和控制方法：疫苗的生產（Marel s Diseases :Scientific Basis and Methods of Control production of vaccines) (L. N. Payne, Ed. ), Martinus Nijoff Publishing，波士頓，MA，第 251-266 頁（1985))。
[0008] 與所有初生動物細胞一樣，禽胚成纖維細胞會經歷衰老，倍增時間逐代增加直至 細胞最終死亡。初生禽胚細胞如雞胚細胞（CEF)的有限壽命為大約兩到三周。因此，為了 維持疫苗生產，必須每隔一或兩周制備這些細胞，這增加了生產疫苗的成本。
[0009] 為了克服對初生細胞的需要及對受精卵的使用，已經嘗試開發永生化的禽類細胞 系（參見例如K.Nazerian，Avian Pathol. 16:527-544(1987))。然而，這些細胞系來自病 毒轉化的細胞，或在接種到雞中時產生腫瘤，或產生不足以商業生產的病毒滴度。因此，在 疫苗生產中這些細胞系不能替代初生禽胚成纖維細胞。
[0010] 本發明提供了一種改進適合于疫苗生產的禽類胚胎細胞生產的可選方法。本發明 公開了一種用于從完整胚胎生產適合疫苗接種的初生禽類細胞的改進方法。該方法提高了 產生的細胞的數量且因此降低了疫苗生產的成本。
【發明內容】
[0011] 本發明涉及生產初生禽胚細胞的改進方法。本發明還涉及這些細胞及其生產疫苗 或其它生物產品的用途。
[0012] 本發明尤其源于從完整胚胎生產細胞的新方法的開發。呈現的結果顯示這種方 法提供了提高的每個胚胎的細胞數量，并且顯示這些細胞展示了適于商業疫苗生產的特征 (密度、融合度、病毒生產滴度）。更具體地呈現的結果顯示該方法產生的CEF/胚胎產量是 現有技術實現的產量的大約兩倍，并且允許以更高的密度接種細胞，和在感染后大約50小 時進行收獲，從而實現高于最低釋放量的滴度。因此與使用建立的細胞系或常規僅有身體 的胚胎細胞的現有技術的方法相比，這種方法具有很大優勢。
[0013] 因此本發明的一個目的在于制備禽類胚胎細胞的方法，其包含：
[0014] a)由禽蛋獲得禽胚，和
[0015] b)由完整胚胎制備細胞。
[0016] 在一個優選的實施方案中，該方法還包含步驟c):以20微米以上，更優選以50微 米以上對細胞制備物進行過濾。
[0017] 本發明的另一個目的在于由胚胎制備禽類胚胎細胞的改進的方法，改進在于由完 整胚胎制備細胞及隨后以20微米以上過濾細胞制備物。
[0018] 在本發明方法的特定實施方案中，在過濾步驟c)之前或之后可以培養或擴增禽 類胚胎細胞；和/或在過濾步驟c)之前或之后禽類胚胎細胞可以被病毒感染。
[0019] 禽蛋優選為無特定病原體的禽蛋。并且，禽類胚胎細胞優選為成纖維細胞。本發 明可用于任何禽類，優選雞或鴨。在生產后，可以將細胞維持在培養物中，優選維持在無血 清培養基中。
[0020] 本發明的另一個目的涉及通過以上公開的方法可獲得或獲得的禽類胚胎細胞或 所述細胞的祖細胞的培養物或組合物。
[0021] 本發明還涉及禽類胚胎細胞的培養物或組合物，其中所述細胞或其祖先由完整胚 胎制備得到且已經以20微米以上進行過過濾。
[0022] 優選地，細胞為雞胚成纖維細胞，任選地被病毒如馬立克氏病病毒（MDV)感染。
[0023] 本發明的另一個目的涉及生產或擴增病毒的方法，包括用病毒感染上述細胞以及 任選地收集所產生的病毒。隨后可將生產或擴增的病毒滅活。病毒可以為任何動物或人類 病毒，例如但不限于MDV、火雞皰疹病毒、MDV(SB-I)或MDV(Rispens)、禽呼腸孤病毒和傳染 性法氏囊病病毒。
[0024] 本發明還涉及生產病毒疫苗的方法，包含（i)在允許病毒生產或擴增的條件下用 病毒感染上述細胞；（ii)任選地，收集生產或擴增的病毒；（iii)任選地，將在（i)或（ii) 中所生產或擴增的病毒滅活；以及（iv)將生產或擴增的病毒配制為疫苗組合物。
[0025] 在該方法的一個特定的實施方案中，將生產或擴增的病毒收集、分離、以20微米 以上過濾、任選地滅活、并配制為疫苗組合物。
[0026] 根據另一個特定的實施方案，在步驟（i)之前將細胞以20微米以上進行過濾，并 且將細胞上清液或細胞碎片用于生產疫苗。
[0027] 本發明還涉及疫苗組合物，其包含上述的或通過上述方法獲得的病毒或細胞，以 及合適的賦形劑或載體。
[0028] 本發明尤其適合生產CEF和使用這些細胞生產MDV疫苗。
【附圖說明】
[0029] 本專利或申請文件包含至少一副彩圖。具有彩圖的本專利或專利申請出版物的副 本經要求并支付必要費用后會由專利局提供。
[0030] 圖1 :由完整胚胎制備的CEF的存活研究。
[0031] 圖2 :由完整胚胎制備的CEF的融合度研究
[0032] 圖3 :由完整胚胎制備的CEF細胞上馬立克氏病毒的生長。 具體實施方案