采用哺乳動物細胞確立人胚胎干細胞系的制作方法

專利名稱：：采用哺乳動物細胞確立人胚胎干細胞系的制作方法采用哺乳動物細胞確立人胚胎干細胞系相關申請的交叉引用本申請要求于2005年5月17日提交的、申請號為595/MUM/2005的印度臨時專利申請的優先權。關于聯邦政府贊助的研究或研發的申明不適用"縮微膠片附件"的引用不適用
背景技術：
：'本發明;步及從剩余胚胎的內細胞團分離、維持和繁殖人胚胎干細胞(hESC)。本發明也涉及鑒定分離的人ES細胞系，從而驗證其體外分化潛能及其在細胞治療和藥物篩選中的預期用途。2.相關文獻的描述來自胚泡內細胞團的多能千細胞稱作胚胎千細胞，而來自發育的生殖(腺)嵴原生殖細胞的千細胞稱作胚胎干細胞(Shamblott等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(23):13726-31)。已經從哺乳動物胚泡的內細胞團(ICM)獲得胚胎干(ES)細胞((Evans和Kauftnan，(1981)Nature,292(5819):151-9;Martin,(1981)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,78:7634-8)。這些細胞是多能的，能夠發育成任何器官或組織類型。ES細胞能夠在未分化狀態體外增殖，在延長培養過程中維持正常核型，和維持分化為所有三層胚胎層(也就是中胚層，外胚層和內胚層)的潛能(Itskovitz-Eldor等，(2000)MoLMed.，6(2):88-95)。ES細胞是有用的模型系統的代表，可用于研究多能細胞生物學的機制和早期胚胎的分化機制，以及提供遺傳操作的機會。ES細胞適當的增殖和分化可用于產生無限制的細胞源，適用于基于細胞的治療由細胞損壞或細胞功能失調導致的疾病。已經從鼠胚泡階段的胚胎ICM中分離出ES細胞(Solter和Knowles，(1975)72(12):5099-5102)，也從其他幾種物種中分離。例如，多能干細胞己經得自幾種家養和實驗室動物的植入前胚胎，例如牛(Evans等，(1990).Theriogenology,33:125-8)，豬(Evans等，(1990)supra;Notarianni等，(1990)J.Reprod.Fertil.SuppL,41:51-6)，綿羊和山羊(Meinecke-Tillmann和Meinecke,(1996),J.AnimalBreedingandGenetics,113:413-26;Notarianni,等，(1991),J.Reprod.Fertil.SuppL，43:255-60)兔(Giles等，(1993)Mol.Reprod.Dev.,36(2):130-8;Graves等，(1993)Mol.Reprod.andDev.,36:424-33)，貂(Sukoyan等，(1992),MoLReprod.andDev.,33:418-31)，鼠(Iannaccona等，(1994),Dev.Biology,163:288-92)，倉鼠(Doetschman等，(1985)J.Embryol,Exp.MorphoL，87:27-45)，和恒河猴和狨猴(Thomson等，(1995)Proc.Natl.Acad.ScL92(17):7844-8;和Thomson,等，(1996)，Biol.Reprod"55:254扁59)。Thomson等(1998)Science,282(5391):1145-7;禾卩Reubinoff等(2000)Nat.Biotech.,18(5):559)已經報道了人ES細胞系的衍生。關于ES細胞的早期工作是在鼠中進行的(Doetschman等，(1985)J.Embr.Exp.MorphoL,87:27-45)。鼠ES細胞是未分化的多能細胞，其得自體外植入前胚胎，且在成纖維細胞飼養層和白血病抑制因子(LIF)的存在下培養時，其能在連續傳代過程中維持未分化狀態。盡管源于鼠ES細胞的研究有助于理解發育過程和遺傳疾病。人和鼠發育的重大差異限制了鼠ES細胞用于人發育的模型。得自其他物種的ES細胞的形態學、細胞表面標記和生長需要與鼠ES細胞的相差很大。此外，鼠和人胚胎的重要差別在于胚胎基因的暫時表達，例如卵柱休與胎盤的形成(Kaufman,TheAtlasofMouseDevelopment;London;AcademicPress,1992)，某些早期譜系的預期分化(O'Rahilly和Muller;DevelopmentalstagesinHumanEmbryos,Washington;CarnegieInstitutionofWashington,1987)，外胚胎膜和胎盤的結構和功能(Mossman,VertebrateFetalmembranes;NewBrunswick;Rutgers,1987)，發育的生長因子需求(例如，造血系統一LapidotLab.AnimalSciences1994)，以及成體結構和功能(例如，中樞神經系統)。為/克服這些差異和對人胚胎發育更好的認識，已經成功地從靈長類制備ES細胞(Thomson等，1995和1998)。目前可獲得的與人ES細胞最相似的細胞系是人胚胎癌(EC)細胞，其是源自畸胎癌的多能的、不死的細胞(Andrews,等，Lab.Invest.50(2):147-162,1984;Andrews,等，in:RobertsonE.,ed.丁eratocarcinomasandEmbryonicStemCells:APracticalApproach.Oxford:IRLpress,pp.207-246,1987)。EC細胞可在培養基中被誘導分化，該分化的特征是特異性細胞表面標記(SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60，禾卩TRA-1-81)的缺失和新標記的出現(Andrews,等，1987見上(supra))。人EC細胞在裸鼠中形成畸胎癌，且在腫瘤中的帶有多發胚細胞系衍生物。類似的鼠EC細胞系已經得自畸胎癌，通常，其發育潛能與鼠ES細胞相比，更受限制(Rossant,等，(1984),CellDiffer.15:155-161)。畸胎癌是源自生殖細胞的腫瘤，盡管生殖細胞(如ES細胞)理論上是全能的(也就是能夠在體內形成任何細胞類型)，EC細胞更受限制的發育潛能和不正常核型被認為是由于畸胎癌腫瘤環境中的選擇壓力造成的(Rossant禾QPapaioaimou,1984)。另一方面，ES細胞被認為維持更強的發育潛能，這是由于它們源自體外正常的胚胎細胞，沒有畸胎癌環境的選擇壓力。1998年(Thomson等，(1998)見前)公開了第一株人多能ES細胞系。幾年后，由人胚泡建立了人胚胎千細胞系("人ES細胞系")(Reubinoff等，(2000)見前)。至今，絕大多數描述的人ES細胞系得自，5到8天的胚泡，該胚泡是在體外受精(IVF)或精子卵漿內注射(ICSI)后用于臨床目的而產生的。另外，已經報道了從桑椹胚階段(4天的胚胎)分離ICM(Giles等，1993)。人ES細胞分離自人胚泡。人胚泡得自人體外植入前胚胎或IVF胚胎、精子卵漿內注射、卵質轉移，或其他本領域技術人員已知的方法。人ES細胞得自胚泡，其中可采用在美國專利5,843,780和6，200，806、Thomson等，(1998)見前，和Reubinoff等，(2000)見前(每篇在此以引用的方式納入本文)中公開的標準免疫外科技術，完整的胚胎培養方法，或獨特的激光消融方法(美國專利申請號10/226,711，在此以引入的方式納入本文)。另外，單細胞人胚胎可擴增到胚泡階段。盡管至今已經獲得出眾多的人ES細胞系，但是在其獨特的標識、自我恢復的能力和分化的潛能方面只表征了其中的幾個(Brimble等，(2004)，StemCellsDev.,13:585-7)。本領域技術人員已知的一種產生人ES細胞的方法是通過免疫外科技術。這種方法涉及通過免疫外科去除胚泡中的透明帶和分離ICM，其中溶解飼養外胚層被融解并通過溫和的吸取從完整的ICM上移去。然后ICM平鋪在組織培養燒瓶中，其中包含能使其向外生長的合適的培養基。9到15天后，通過機械分離或酶促裂解的方式將ICM衍生的生長暈(outgrowth)分裂為塊，所述細胞重新平鋪在新鮮的組織培養基上。用微量吸管分別地選擇已證實形態學未分化的克隆，然后將所述克隆機械裂解成塊，并將其重新平鋪培養。將所得ES細胞每隔l一2周進行常規分離，以維持細胞處于大體上未分化狀態。有關免疫外科的更詳細描述，參見美國專利號5,843,780、Thomson等，(1998)見前、Thomson等，(1998)Curr.Top.Dev.Biol.38:133、Thomson等，(1995)見前、Bongso等，(1989)Hum.Reprod.4(6):706-13、Gardner,等，(1998),Fert.andSterility,69(l):84-8，上述每篇文獻在此以引用的方式納入本文。維持人ES細胞處于未分化的多能階段的方法包括，但不限于在下列情況下培養細胞在詞養層存在下培養，在不含飼養的條件下培養，在條件培養基存在下培養，和/或在加有血清或條件培養基的胞外基質上培養。飼養層可以是，例如，Y—照射的或絲裂霉素一C處理過的鼠胚胎成纖維細胞(MEF)或人成纖維細胞。當培養在不含飼養層的標轉培養基時，人ES細胞可快速分化或不能存活。不像鼠ES細胞，所添加的外源性LIF的存在并不阻止人ES細胞的分化。飼養細胞層用于提供微環境(或生態位)以預防干細胞沿著自然過程分化。這些的飼養層似乎提供干細胞外部信號，所述外部信號例如為因子的分泌和由整合膜蛋白介導的細胞與細胞之間的相互作用。Watt和Hogan，(2000)Science287(5457):1427-30。根據分泌因子和直接的細胞之間的相互作用控制干細胞體外存活、增殖和分化的事實，理想的環境由健康的飼養組織組成，所述組織具有正常的顯微結構和功能，或能夠模擬這樣的環境。飼養細胞的例子包括，但不限于(1)輻射失活的鼠胚胎成纖維細胞；(2)有絲分裂(絲裂霉素C)失活的鼠胚胎成纖維細胞；和(3)輻射失活的STO成纖維細胞飼養層。參見Thomson等，(1998)見前、Reubinoff等，(2000)見前；和Shamblott等，(1998)Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(23):13726-31。盡管有效培養ES細胞的進展，這些方法仍舊存在一些重要的缺點。例如，在MEF條件培養基或基質膠基質中暴露于動物病原體仍舊是可能發生的事。在人類治療中使用人ES細胞的主要障礙在于原始描述的用于增殖人ES細胞的方法包括在非人源的營養血清存在下在非人源的飼養細胞層上培養人EX細胞。最近，關于增強人ES細胞培養系統的大量研究集中在無血清/無詞養條件下生長ES細胞的能力。例如，為了保證人ES細胞生長的無詞養環境，己經嘗試了基于添加有血清替代品(SR)、轉移生長因子P1(TGF-P1)、LIF、bEGF和纖維結合素基質的替代系統(Amit等(2004),Biol.Reprod.70(3):837-45)。對在人飼養或無飼養基質上分化和增殖未分化ES細胞的方法的評價仍在進行。詳細表征人ES細胞可包括在細胞和分子水平上的分析，和細胞周期調節的分析、高端粒末端轉移酶活性的表達、遺傳穩定性、特定的HLA和STR類型、和體外和體內條件下的分化潛能。在未分化人ES細胞上顯示的表面抗原圖譜與人ES細胞和人EC細胞的匹配。未分化的人ES表達球狀系列(globo-series)表面標記，如階段特異性胚胎抗原(SSEAs)，例如SSEA-3和SSEA-4，和腫瘤識別抗原，例如TRA-1-60和TRA-1-81。另外，人ES細胞表達POU5F1，啟動子編碼的(promoter-encoded)轉錄因子OTC-4、E-鈣粘蛋白和間隙接頭蛋白間隙連接蛋白43(connexin-43)(Andrews等，2002)。不象鼠ES細胞，未分化的人ES細胞并不表達SSEA-1。未分化的人ES細胞用堿性磷酸酶著色顯陽性，證實了高的端粒末端轉移酶活性，這表明了其具有增強的自我更新功能。人ES細胞遺傳穩定性的評估可采用標準的G-顯帶技術，所述技術對于本領域技術人員來說事已知的。正常的人ES細胞維持穩定的核型，或為46XX，或為46XY，即使在延長的連續傳代后也是如此。隨著傳代次數的增加，然而，細胞趨向于顯示不正常的核型包括染色體12—17和X染色體的三體性。ES細胞無限的增殖潛能與端粒末端轉移酶活性直接相關。進行端粒末端轉移酶重復擴增步驟(TRAP)分析用于評估特定ES細胞系的端粒末端轉移酶活性。所述分析的進行可采用放射性同位素的方法(Thomson等，(1998)，見前)，或可采用非放射性同位素的方法(Oh等，(2004)StemCells,23(2):211-19)。人ES細胞具有分化為人體所有細胞類型的潛能。研究這些細胞在延長培養后的發育潛能，體外研究通過SCID鼠中胚狀體的形成，體內研究通過SCID鼠中畸胎瘤形成(EvansMJ和KaufmanM,(1983)見前)。為了確證人ES細胞維持其體外分化能力，在懸浮培養中形成胚狀體，并通過RT-PCR分子和免疫組織化學分析代表三個胚層的每一層的標記(Itskovitz-Eldor,(2000)見前，和Shamblott等，(1998)見前)。人ES細胞提供關于發育事件的啟示，所述事件不可能在外植體系統中研究。基于人ES細胞體外分化為特定譜系的篩選可以鑒定目標基因，可用于設計或調整組織產生或再生，和鑒定產生畸形的化合物或毒性化合物。采用ES細胞技術替換無功能細胞、組織或器官可為退化性疾病提供治療的處理方式，所述退化性疾病如帕金森、中風、心臟缺血、肝臟衰竭、青少年糖尿病，或其他由于一種或幾種細胞類型的死亡或功能障礙導致的疾病或狀況(Wobus和Boheler,(2005),Physiol.Rev.,85(2):635-8)。然而，為了實現人ES細胞技術的潛在治療用途，所述技術必須在限定的條件下、無病原體的環境中產生豐富的人ES細胞衍生的專一細胞類型，并且在體外條件下能夠存活。目前，獲得的人ES細胞系的數量有限，所述細胞系代表了人口遺傳多樣性的一小部分樣本。因此，迫切需要產生和鑒定其它的細胞系，這是因為每種細胞系都有自身的特征，在特定人口中具有不同的應用。而且，獲得更多的人ES細胞系用于比較有助于全球致力于定義人ES細胞的標準和建立合適并且充滿活力的維持和擴增人ES細胞的方法。發明簡述本申請針對分離和鑒定特定遺傳性狀的人多能胚胎干(ES)細胞，所述的遺傳性狀使得人ES細胞更有效的應用至特定的人群，如印度人。優選地，人ES細胞具有人白細胞抗原(HLA)等位基因，所述基因表達HLAs，通常大多數目標人口的HLAs是一致的。盡管目標人口中不到一半表達已鑒定的特定HLAs，但是該頻率仍舊是高的，因為由表達一致HLAs的ES細胞系產生的治療性處理對于目標人群中的某-部分更加有效。本中請公開的一個實施方案指的是純化的人多能ES細胞制劑，其中所述細胞包括(i)能夠分化為內胚層、中胚層和外胚層組織衍生物(ii)正常核型(iii)能夠在體外培養物中增殖至少約25代，和(iv)如表4所列的-一種或更多種等位基因人多能ES細胞制劑進一步包括任意種如表4所列的HLA等位基因。優選地，所述細胞包括如表4所列的所有HLA。本申請公開的人ES細胞優選具有一種或更多種另外的特征，所述特征與人ES細胞相同。例如，本申請公開的人ES細胞(1)可在體外培養物種增殖至超過1年；(2)在成纖維細胞飼養層(例如，鼠或人成纖維細胞飼養層)環境中或在無飼養條件下培養能抑制其分化；(3)SSEA-3和SSEA-4標記陽性；(4)TRA-1-60和TRA-I—81標記陽性；(5)表達堿性磷酸酶；(6)高表達端粒末端轉移酶；或(7)在懸浮培養時能夠形成胚狀體。在優選的實施方案中，在傳代培養約40代后，所述制劑基本保持未分化，更優選在傳代培養約60代后，和更優選在傳代培養約100代后。雖然制劑中未分化ES細胞克隆與分化的臨近細胞接連，但是所述制劑在合適條件下培養或傳代時，所述制劑基本上保持未分化，單獨的未分化ES細胞構成細胞群的主要部分。基本上未分化的制劑包括至少約20X未分化的ES細胞，和可包括至少約40%、60%、80%或90%的ES細胞。在另一個優選的實施方案中，本申請公開的人ES細胞進一步包括一個或多個如表5所列的短串聯重復序列(STR)基因座，并可包括任意種(包括所有種)表5中所列的STR。本申請公開的另一個實施方案指的是篩選人多能ES細胞系的方法，其為特定目標人群的個體提供了改良的HLA匹配，如對于印度人，所述方法是通過篩選特定HLA等位基因表達的人ES細胞，其中所述的HLA等位基因通常存在于目標人群中。如果目標人口中至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的個體存在HLA等位基因，則HLA等位基因通常存在于目標人口中，。目標人口是基于特定群體中個體的國籍、種族或遺傳特征的。通常在不同目標人群中發現的HLA等位基因對本領域技術人員來說是已知的。典型的HLA匹配標準決定衍生自人ES細胞的細胞、組織或器官的潛在移植治療，例如潛在的受體必須與供體人ES細胞系的合適HLA基因座相匹配。因此，鑒定這樣的人ES細胞對于治療用途具有極大的潛在價值。附圖簡述下述附圖組成本說明書的一部分，并且在本文中用于進一步說明本申請公開的某些方面，參照一個或多個這些附圖，并結合本文公開的具體實施方案的詳細描述可以更好的理解本發明。附圖1是人胚泡在低(100X)和高(200X)倍率下的顯微照片。所述的胚泡用于建立RdiCellTMhESl細胞系。圖1.2顯示高倍下6天的胚泡，從該圖可見清楚的透明帶、單層飼養外胚層和未發育好的ICM。胚胎的等級是C-級(參見Gardner等，(2000)Fertil.Sterility,73:1155-58)。附圖2鼠胚泡成纖維(MEF)細胞的顯微照片，所述的細胞用于培養和增殖RdiCellTMhESl細胞系。圖2.1顯示鋪滿80—90%、平板接種48小時后的MEF細胞；圖2.2顯示用于形態學分析的MEF上的hESC克隆，證實hESC克隆的健康生長；圖2.3和2.4顯示，分別用Oct-3/4和SSEA-4抗體免疫染色MEF上hESC，結果呈現陽性；圖2.5RT-PCR證實下述在MEF細胞上生長的hESC的ES-細胞標記的表達GAPDH、Oct-4、Nanog、Rexl、TDGFl,、Sox-2、Thyl,禾口FGF4基因。附圖3是在一組相差顯微照片，顯示了RdicellTMhESl細胞平板接種在培養基MEF層上后隨時間的形態學變化，所述培養基中包含人LIF(10ng/ml)。平板接種1天后ICM粘附并逐漸在MEF細胞上擴展，直到第12天。在第12天，人ES細胞克隆分離并傳代繁殖細胞系。平板l:平板接種第l天；平板2:平板接種第4天；平板第3:平板接種第5天；平板4:平板接種6天；平板4:平板接種第8天;平板l:平板接種12天。附圖4是在一組相差顯微照片，顯示了未分化hESl克隆處于從10代到30代時的不同代的形態。圖3.1顯示健康的MEF細胞上的10代致密的hESC克隆，所述MEF細胞不僅提供營養給ES細胞，而且有助于其維持未分化狀態。圖3.2顯示15代的hESC克隆。圖3.3顯示20代的hESC。圖3.4拍攝于更高的倍率(200X)下，其顯示了30代未分化hESC的清晰的細胞邊界、細胞核與細胞質的高比率和顯著的核仁。HESC維持在包含DMEM-F12的培養基中，所述培養基添加有10%FBS和人LIF(10ng/ml)。附圖5是一組8張的顯微照片，顯示了通過免疫細胞化學檢測在MEF細胞上生長的細胞的不同ES細胞標記的表型表達。圖5.1顯示Oct-3/4(+)hESC;圖5.2顯示SSEA-3(+)hESC;圖5.3顯示SSEA-4(+)hESC;圖5.4顯示Tra-1-60(+)hESC;圖5.5顯示Tra-l-81(+)hESC;圖5.6顯示Connexin-43(+)hESC;圖5.7顯示E-l丐粘蛋白(+)hESC;和圖5.8顯示堿性磷酸酶(+)免疫染色hESC，其中所述hESC用4%多聚甲醛固定。所有分析的標記都是富含碳水化合物的細胞表面抗原(除了Oct-3/4之外)，其是POU5Fl啟動子編碼的轉錄因子和Connexin-43，其中Connexin-43是間隙連接分子。在RelicellTMhESl增殖期間，每隔5代時進行免疫熒光分析，并且所有抗體都是FITC標記的。附圖6照片說明RdiCellTMhESl細胞系第22代的未分化基因表達格局，因此證實了長期培養細胞系的多能性。在RdicdlTMhESl細胞系繁殖中每隔5代進行RT-PCR分析。包括如下從左到右的標記條帶l:100bp標記；條帶2:GAPDH(892bp);條帶3:Oct-4(247bp);條帶4:Nanog(262bp);條帶5:Rexl(306bp):條帶6:Sox2(448bp):條帶7:Thyl(272bp);條帶8:FGF4(374bp);條帶9:ABCG2(684bp):條帶10:Dppa5(353bp);條帶ll:UTFl(230bp);條帶12:Criptol(217bp);條帶13:FoxD3(165bp);條帶14:hTERT(187bp);條帶15:Connexin-43(295bp);條帶16:Connexin-45(819bp);和條帶17:100bp標記。hTERT基因的增強表達表明人ES細胞系的高度自我更新能力。GAPDH用作持家基因對照。用于擴增未分化基因的具體引物列在表1。附圖7顯示了對在把RelicdlTMhESl細胞注射到SCID鼠后形成的畸胎瘤的分析。在注射到SCID鼠時，多能hESC系分化為所有三層胚胎胚層衍生的細胞。平板A:低倍率觀察畸胎瘤；平板B:顯示內胚層衍生物(腸上皮)；平板C和D:顯示外胚層衍生物(神經組織)；和平板E和F:顯示中胚層衍生物(分別是血液細胞和骨)。附圖8是1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖，其顯示了通過基于PCR的SYBER—Green染色分析37代ReliCellhESl細胞系的真實端粒末端轉移酶活性。每次分析上樣6"g總蛋白。條帶l:NTERA-2;條帶2:NTERA-2(熱失活的)；條帶3:MEF;條帶4::MEF(熱失活的)；條帶5:ReliCellTMhESl(p37);條帶6:ReliCellhESl(p37，熱失活的)；條帶7:內部對照；條帶8:TSR8對照模板(1.5tM，同試劑盒一起提供)。附圖9是懸浮培養過程中的4張胚狀體照片，所述培養維持在合適培養基(W/OhLIF)中，以誘導體外分化。圖8.1顯示懸浮培養6天后形成的人ES細胞松散凝集體/克隆；圖8.2顯示培養10天形成的致密胚狀體；圖8.3顯示培養14天后形成的血島；和圖8.4顯示培養14天后形成的致密血島，其是體外血管發生的證明。附圖10的顯微照片顯示，通過免疫化學分析2—孔腔式載波片.卜.固定的胚狀體(14天)來說明ReliCdlTMhESl細胞系體外分化潛能。圖10.1顯示巢蛋白(+)免疫染色(外胚層)；圖10.2和10.3顯示分別用平滑肌肌動蛋白和Bmchyury(+)免疫染色(中胚層)；圖10.4和10.5顯示分別用AFP和GATA-4(+)免疫染色(內胚層)，從而驗證RT-PCR的結果。用于研究的所有抗體都連接有FITC。照片拍攝采用了NikonE600倒置顯微鏡。附圖11顯示一組譜系特異性標記的差別基因表達，所述標記標識來自胚狀體(32代)的三個胚層的細胞，所述胚狀體源自ReliCellhESl細胞系，所述標記包括(1)角蛋白8、角蛋白15、角蛋白18、NFH、Sox-l(外胚層)；(2)Brachyury、MyoD、Msxl、HAND1、心肌肌動蛋白(中胚層)；禾口(3)GATA-4、AFP、HNF-3b、HNF-4a、白蛋白和PDX1(內胚層)。照片顯示在胚狀體形成的第10到14天時前述標記的mRNA水平很高，因此證明了人ES細胞系體外分化為三種譜系的潛能。HEF細胞作為陰性對照，和GAPDH作為持家基因對照。附圖12顯示評價ReliCellhESl體外分化潛能。相差顯微照片顯示從不同表型細胞至胚狀體形成的例子，其中所述的不同表型細胞是在合適的體外條件下，由從未分化人ES細胞形成。具體如下所述平板A:多重處理的神經元；平板C:心肌細胞；平板E:胰島；和平板G:橢圓形的肝胚。另外，免疫染色這些分化的細胞是采用一些細胞特異性標記平板B:MAP-2;平板D:心肌肌鈣蛋白-1;平板I:PDX-1;和平板H:CK18。附圖13顯示將肝癌細胞系、HepG2間隔不同時間暴露于四氯化碳(0.6%)的圖解表示。另外，生化方法測定下述酶的含量平板A:血清谷草轉氨酶(SGOT);平板B:血清谷丙酸轉氨酶(SGPT);平板C:堿性磷酸梅(ALP);和平板D:乳酸脫氫酶(LDH)。附圖14顯示作為體外肝臟毒性模型的鼠ES細胞衍生的肝細胞的建立。干細胞由鼠ES細胞分化而得，并將其在存在和不存在N-乙酰半胱氨酸(NAC)的情況下暴露于四氯化碳(0.6%)180分鐘，所述N-乙酰半胱氨酸(NAC)為一種抗氧化劑，將其。生化方法測定下述酶的濃度平板A:SGOT;平板B:SGPT;平板C:ALP;和平板D:LDH。發明詳述本申請涉及根據其獨特的特性、自我更新能力和分化潛能建立詳細表征的人ES細胞系。具體地，產生人ES細胞系，該細胞系具有特別適合于特定受體人群的治療用途的特性。所述的人群是基于國籍、種族、或遺傳特性的個體的特定群體。這樣的人ES細胞系可為特定人群提供特性和優勢，以用于多種用途，如細胞替換治療、藥物篩選、和功能基因組學。人ES細胞被鑒定為具有某些用于治療特定人群的優勢，所述特定人群是通過某些遺傳特性而鑒定的，例如-一些主要組織相容性復合物(MHC)等位基因、人白細胞抗原(HLA)、或短串聯重復(STR)標識廣泛存在于目的人群。分離與普通人群具有相同的一種或多種遺傳特性的人ES細胞，將增加這些ES細胞用于開發治療應用或開發通常會有利于所述人群的其他信息的可能性。例如，人ES細胞與通常的目的人群的的組織相容性越高，ES細胞用于產生治療效果的可能性就越大。在具體地，優選實施方案中，目的人群是印度人。^MHC是包含HLA或MHC基因的染色體部分，其可分為三種類別I、類別II和類別m。人體中，MHC類別I基因包括HLA-A、HLA-B禾nHLA-C，而MHC類別II基因包括HLA-DP、HLA-DQ禾卩HLA-DR(GolubandGreen,1991,Immunology:ASynthesis,SecondEdition,Chapter15)。MHC類別I和類別II分子結合自體或外源抗原的蛋白片段，并在細胞表面被T淋巴細胞檢閱。因而，這些分子刺激細胞或體液免疫攻擊(Germain,1994，Cell76:287-299)。完整的產品系列可商業獲得，以用于對所有典型HLA位點進行分類，包括A、B、C、DRA、DRB1、DRB3、DRB4、DRB5、DQA1、DQB1、DPA1和DPB1。通過鑒定ES細胞系的遺傳因子(如，舉列來說，HLA等位基因，其普遍存在于普通人口)，所述細胞系可用于衍生治療性處理，所述治療性處理對于目標人群更有效。例如，本發明公開的一個優選實施方案涉及產生人ES細胞系，與隨機分離的人ES細胞系相比，其具有更高比率的與印度人一樣的標記，如免疫遺傳標記。這將會降低人群中由ES細胞而產生的免疫注射的風險，所述免疫注射屬于治療性處理。例如，研究北印度人群中HLA同種型的遺傳多樣性揭示某些HLA等位基因在所述人群中的出現率高。例如，Mehra等，(2001)TissueAntigens57(6):502-7，觀察到HLA-A*0201(3.8%)在亞洲印度人中出現出乎意料的低頻率，而其在西部高加索樣人群的分布中，構成HLA-A2所有組成成分的95%。這個例子表明鑒定人ES細胞系的重要性，其通常與目的人群的病人組織相容。本發明公開的人ES細胞具有特別好的優點，這應歸于這些細胞的如下幾個特性(1)能夠分化為多種組織類型，且這些組織類型屬于三層胚胎層(內胚層、外胚層和中胚層)；(2)能自我更新并且能夠繁殖傳代培養至少約40到約IOO代或更多代，同時保留多能性、高的端粒末端轉移酶活性和正常核型；(3)能夠形成胚狀體(EBs);(4)擁有獨特的HLA等位基因，在移植到所選定的患者群，例如印度人的過程中，其能提供與受體更好的匹配性；(5)擁有獨特的短串聯重復序列(STR)類型，在移植到所選定的患者群，例如印度人過程中，其能提供與受體更好的匹配性；(6)根據其作用于細胞群、細胞毒性、或基因調節或蛋白表達，可用于篩選化合物，例如小分子和藥物；和(7)采用，例如，肝細胞，心肌細胞、神經元、胰島細胞、或衍生自本發明公開的人ES細胞的其他細胞類型，這些細胞可用作傳統體外毒性模型的選擇，所述模型用于藥物代謝和毒性研究，。本文所述的一個特別優選的人ES細胞系是RelicellhESl細胞系(Mandal等，(2006)Differentiation74:81-90，其在此以引入的方式納入本文)。這種細胞系保存于細胞科學國家中心(NCCS)，在印度的Pime，將申請國際保藏。這種細胞系表達高水平的細胞表面標記如SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，轉錄因子Oct-4，堿性磷酸酶和端粒末端轉移酶。如通過STR分析的DNA指紋所示，這種細胞系在長期培養過程中保持正常核型和具有顯著的特征，。檢測所述細胞體外分化潛能，證實其能夠引起多巴胺能神經元、心肌細胞、胰島、和肝細胞樣細胞發生，其分別屬于外胚層、中胚層和內胚層譜系。本文公開的人ES細胞產生于哺乳動物胚胎胚泡階段的內細胞團(ICM)。在優選的實施方案中，多能人ES細胞能夠自我再生，并且可以引起所有的三層譜系細胞(外胚層、中胚層和內胚層)的產生。本文所用的術語"多能人ES細胞"指的是得自哺乳動物胚胎胚泡階段的ICM的細胞。多能細胞能自我再生并且能夠分化為所有的三種譜系的細胞。本文所用的術語"分化"指的是一個過程，未分化的ES細胞藉此獲得一種狀態，其中細胞更專一，具有特定組織的特征。這些特定組織顯示在細胞和分子水平上的組織特異性標記的表達。ES細胞系分化潛能是所述細胞系能夠產生屬于所有三層胚層(外胚層、中胚層和內胚層，包括畸胎瘤)的細胞類型。將所述細胞在合適分化的條件下培養驗證體外ES細胞分化潛能。另外，將ES細胞注射到SCID鼠中顯示其分化潛能。本文公開的多能ES細胞是未定型的(也就是說，其不屬于具體的胚層如外胚層、中胚層和內胚層)。人多能ES細胞也具有高度自我更新能力和擁有分化潛能，無論是體內還是體外，或在細胞、組織或器官內能保持休眠或靜止。分離的胚泡(從中分離人ES細胞)的獲得可通過本領域技術人員己知的一系列方法，例如體外受精、精子卵漿內注射技術、和卵質轉移。在一些實施方案中，分離的人ES細胞生長在胚胎成纖維細胞上，所述成纖維細胞包括，但不限于鼠胚胎成纖維細胞、人胚胎成纖維細胞或得自成人組織的成纖維細胞樣細胞。在另外一些實施方案中，人ES細胞生長在無飼養的條件下。如在優選實施方案中所述的得自胚泡的人ES細胞群，表達ES細胞的特異性標記，該標記包括但不限于，Oct-4、Nanog、Rexl、Sox-2、FGF4、Utfl、Thyl、Criptol、ABCG2、Dppa5、hTERT、Connexin-43、Connexin-45。人ES細胞并不表達分化細胞的特征性標記，如角蛋白5、角蛋白15、角蛋白18、Sox-l、NFH(外胚層)；brachyury、Msxl、MyoD、HAND、心肌肌動蛋白(中胚層)；GATA4、AFP、HNF-4alpha、HNF-3beta、白蛋白、和PDX1(內胚層)。人ES細胞也表達細胞表面標記，如階段特異性胚胎抗原3(SSEA-4)、SSEA-4、腫瘤識別抗原1-60("TRA-l-60")、TRA-1-81、Oct-4、E-鈣粘蛋白、Connexin-43、和堿性磷酸酶。免疫細胞化學技術檢測表達水平。本文公開的人ES細胞系詳盡的分子特征給早期胚胎發育提供了有價值的見識。在本發明公開的某些實施方案中，分離的人ES細胞培養在營養培養基中，并通過手工傳代培養維持，所述培養基優選包含生長因子。本文所用的術語"生長因子"指的是結合細胞表面受體的蛋白，通過激活信號途徑，主要導致激活細胞增殖和分化。絕大多數生長因子/添加物具有相當的多種用途，能夠刺激細胞分化成許多種不同細胞類型，而一些生長因子的特異性卻被限制于某些細胞類型。可采用對多能ES細胞特異性的生長因子，其誘導分化成多種譜系如神經元、肝細胞、心肌細胞、P-胰島、軟骨細胞、成骨細胞、肌細胞、等等。ES細胞培養基的一個例子包含80%DMEM/F-12、15%ES-測試FBS(ES-testedFBS)、5%血清替代品、1%非必需氨基酸溶液、lmM谷氨酰胺(GIBCO)、0.1%e-巰基乙醇、4ng/ml人bFGF和10ng/ml人白血病抑制因子(LIF)。手工傳代細胞的方法比一般酶處理傳代的方法要好，因為其有助于維持細胞系的遺傳穩定性。維持細胞系的正常核型對于其治療用途是很重要的。優選地，本發明公開的ES細胞顯示高水平的端粒末端轉移酶活性，這一點由基于非放射性PCR的Syber-Green檢測方法評估。這顯示了本發明公開細胞的高度自我更新能力，該能力為在培養物中至少約40代，更優選地至少約60代，和最優選地至少約IOO代。甚至在培養-'年后，人ES細胞優選擁有正常整倍體核型，并且沒有表現出染色體的總體改變。本發明進一步描述人ES細胞的獨特的特征，這一點由HLA和STR分類所示。HLA分類分析在干細胞移植治療中發揮重要作用。利用STR基因分型開發基因組的串聯重復元件也在幾個領域變得重要，所述領域包括遺傳作圖、連鎖分析、和人同一性試驗。目前公開的人ES細胞系擁有獨特的HLA和STR類型，其在為印度人移植過程中提供更好的匹配性。本發明公開的人ES細胞本質上是多能的，其能在體內分化成所有三層胚層的代表細胞。在注射入SCID鼠時，人ES細胞分化為衍生自所有三層胚層的細胞，其包括但不限于，骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌、造血細胞(中胚層)、肝臟、原始消化管和呼吸上皮細胞(內胚層)、神經元、神經膠質細胞、毛囊、和牙蕾(外胚層)。對在鼠的本文所述的人ES細胞注射位點形成的腫瘤的組織切片檢查可證實這些特征性狀。得到的人ES細胞也可在懸浮培養中形成胚狀體(EBs)。本文所用的術語"胚狀體"指的是分化或未分化的多能ES細胞的凝集，懸浮培養中產生的原始內胚層包圍所述的ES多能細胞。胚狀體包含三種譜系的細胞，所述譜系包括外胚層、中胚層和外胚層。在成熟的人類配體中，可觀察到細胞具有多種細胞類型的標記，如神經元細胞、造血細胞、肝細胞、心肌細胞和胰島細胞。胚狀體和其具體特征為決定ES細胞的分化結果提供有價值的信息。進一步，可以進行如下研究，即通過施用合適的生長因子和他們的添加物使ES細胞分化為所需要的表型。在一種產生EBs的方法中，懸浮凝集物允許在無LIF的ES培養基中分化10—14天。產生的EBs表達一組譜系特異性標記如角蛋白5、角蛋白15、角蛋白18、Sox-l、NFH(外胚層)、Branchyury、Msxl、MyoD、HAND1、心肌肌動蛋白(中胚層)GATA4、AFP、HNV-4a、HNF-3P、白蛋白、禾卩PDX1(內胚層)。一組分化標記的明確表達清楚地驗證了人ES細胞系的分化潛能，例如，根據培養條件，其中至少80%的分化細胞可能是神經元，30—50%的可能是心肌細胞，80—90%的可能是肝細胞，和40—60%是胰腺細胞。在某些實施方案中，本文描述的人ES細胞用于篩選化合物，例如，小分子和藥物，用亍作用于細胞群。也篩選用于細胞毒性或調節表達的化合物。在另外的實施方案中，本文描述的人ES細胞可用于研究發育方面的細胞生物學和分子生物學、功能基因組學和分化細胞的產生，以用于治療性或預防性移植、治療、藥物篩選、或體外藥物開發。例如，人ES細胞用于基因組分析，產生mRNA、cDNA、或基因組文庫，產生特異性多克隆或單克隆抗體，包括但不限于，人源化單克隆抗體(WO01/51616,特將其以引用的方式納入本文)，或檢測不同待測化合物或生物活性分子在人ES細胞或其衍生的細胞或組織上的作用，例如藥物研究中的制藥化合物。篩選的待測化合物或生物活性分子源自，例如，植物、植物提取物、或合成原料。人ES細胞也用于篩選影響培養的人ES細胞特征性狀的和影響人ES細胞分化為多種特異性細胞和組織類型的因素(例如小分子藥物、肽、多核苷酸、等等)或條件(例如細胞培養條件或處理)。最近，已經報道了在毒理學研究中使用干細胞(Davila等，(2004)Toxicol.Sci.，79(2):214-23)。干細胞在應用于毒理學的極大好處源于其與原始人細胞(primaryhumancell)相比的獨特特性(也就是無限制的增殖能力、產生其他細胞類型的可塑性、和人細胞來源的易獲取性)。當在已經報道了鼠ES細胞體外分化為干細胞(Hamazaki等，2001;Jones等，2002)時，還沒有廣泛的研究使用這些分化的肝細胞作為體外篩選潛在的候選藥物的模型。基于鼠ES細胞的試驗，產生自鼠ES細胞的肝細胞可證明是傳統體外毒性模型的合適選擇，用于藥物代謝和毒性研究。本發明描述使用得自ES細胞的肝細胞研究異生素誘導的肝毒性的應用，該應用借助于測定酶的釋放，所述酶包括但不限于，血清谷丙轉氨酶(SGPT)、血清谷草轉氨酶(SGOT)、堿性磷酸酶(ALP)、和乳酸脫氫酶(LDH)。盡管所述應用并不限于采用ES細胞衍生的肝細胞研究毒性，這種細胞類型特別適合于毒性測試，這是因為在細胞、分子和功能水平上的性狀測試都是詳細限定好的，從ES細胞可有效的獲得高百分比的肝細胞，且肝細胞在形態學上可清楚的辨別，從而可降低于由混合群相關的混淆(參見Kulkami禾tlKhanna,Functionalhepatocyte-likecellsderivedfrommouseembryonicstemcells:Anovelinvitrohepatotoxicitymodelfordrugscreening,2006,ToxicologyInVitro(inpress),在此以引用的方式納入本文)。通過使用本申請的人ES細胞衍生的肝細胞，本概念可作為用于藥物代謝和毒性研究的傳統體外毒性模型的選擇。人ES細胞與多能人胚胎癌(EC)細胞共有某些特征。因此推定的人ES細胞的鑒定可通過形態學和人EC細胞特征性細胞表面標記的表達。另外，推定的人ES細胞的鑒定可通過發育潛能、核型和不死性。鑒定人ES細胞特征的例子如下。a)形態學人ES細胞克隆的形態學類似于，但有區別與鼠ES細胞。鼠和人ES細胞都具有未分化干細胞的特征，和高的核/胞質比率、明顯的核仁、和致密的克隆形成。但是人ES細胞的克隆要比鼠ES細胞克隆更扁平，和單個ES細胞可清楚辨別。b)細胞表面標記基于下述某些細胞表面標記的存在或缺失，本發明公開的人ES細胞區別于鼠ES細胞系。一組已知的糖脂細胞表面標記是階段特異性胚胎抗原(SSEA)l到4。這些抗原在人和鼠ES細胞上差異表達，并可采用所述抗原的抗體鑒定。NTERA-2CL.D1細胞系選作陽性對照，因為其已被廣泛研究過并在文獻中報道過，但也可以使用其他的人EC細胞系作為陽性對照。鼠ES細胞(ESJ10用作SSEA-1的陽性對照，也作為SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81的陰性對照。其他常規的陰性對照包括缺失原始或二級抗體和用無特異性的初級抗體代替。細胞用4%的多聚甲醛固定后，可對堿性磷酸酶進行檢測。球狀系列糖脂SSEA-3和SSEA-4構成性出現在人EC細胞上。體外NTERA-2CL.D1細胞系分化導致SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的表達缺失和乳糖系列糖酯SSEA-1的表達增加。這與未分化的鼠ES細胞有差異，該鼠ES細胞表達SSEA-1，不表達SSEA-3也不表達SSEA-4。盡管這些抗原的功能是未知的，ReliCellTMhESl細胞都和人EC細胞表達這些抗原，表明胚胎學的密切相似性。堿性磷酸酶也存在于所有的人ES細胞。本發明公開的成功人ES細胞培養物與這些細胞表面標記相關，所述標記也發現在其他已經建立的人ES細胞系中。c)畸胎瘤形成的發育潛能本發明公開的人ES細胞是多能的。在注射入SCID鼠時，成功的人ES細胞系將分化成三層胚層的細胞，包括骨、軟骨、平滑肌、橫紋肌、造血細胞(中胚層)、肝臟、原始消化管和呼吸上皮細胞(內胚層)、神經元、神經膠質細胞、毛囊、和牙蕾(外胚層)。d)核型成功的人ES細胞具有正常核型。可衍生XX和XY細胞系。人ES細胞系的正常核型與人EC細胞中發現的不正常核型形成反差，所述EC細胞得自自發產生的人胚細胞腫瘤(畸胎瘤)。盡管腫瘤衍生的人EC細胞系具有與ES細胞系某些相同特性，至今獲得的所有人EC細胞系都是非整倍體。因而，人ES細胞系和人EC細胞系可通過人ES細胞系中發現的正常核型和人EC細胞系不正常核型區分。"正常核型"意思是所有染色體保持所述物種的正常特性，無明顯的改變。人ES細胞系正常核型表明所述細胞系反映正常的分化。e)不死性永生細胞能夠在體外持續的無限制復制。持續培養增殖超過1年就足以證明其不死性，這是因為無此特性的原代細胞培養物無法持續分化這么長時間。優選地,在合適培養條件下,人ES細胞體外持續增殖超過一年，并且保持具有發育成所有三層胚層的潛能。所述的發育潛能的證實，是通過將培養很長時間(超過一年)的ES細胞注射到SCID鼠后組織學檢查產生的腫瘤而完成的。盡管在延長培養時可隨機發生核型改變，決大多數ES細胞在持續培養超過一年仍保持正常核型。為了證實這一點，可通過檢測繁殖后期階段的人ES細胞的端粒末端轉移酶活性。在胚胎發育過程中高水平的端粒末端轉移酶活性與細胞繁殖相關，以及與細胞轉化和癌癥相關。f)培養條件預防分化所需要的生長因子對于本發明公開的人ES細胞系和鼠ES細胞系而言是不同的。對于鼠ES細胞，未分化細胞在不存在飼養時LIF可支持其自我更新和繁殖，這是個重大的發現。不幸的是LIF對于人ES細胞培養物似乎不具有這種能力(Jones，等，(1998);Bongso等，(2000)見前)。或者，人飼養來源包括，但不限于人胚胎成纖維細胞、人包皮、骨髓間(充)質細胞、各種成人的基質細胞，或其任意組合，都可用于本發明公開的鼠胚胎飼養(MEF)的替代，從而使人ES細胞生長(目的是為人ES細胞培養物創造無異源環境)。然而無飼養的人ES細胞培養是理想的。不僅消除帶有潛在病原體的外源污染的可能來源，也極大地簡化ES細胞培養的后勤，特別是在較大規模時。鼠胚胎成纖維細胞制成的條件培養基將支持培養在細胞外基質制劑Matrigel(INVITROGEN)的人ES細胞在不存在飼養時繁殖(Carpenter等，2001)。盡管其提供一些實際的好處，但還未鑒定出條件培養基中的活性因子，這種方法無法消除鼠內源性逆轉錄病毒污染的可能性。g)胚胎外組織的分化當生長在胚胎成纖維細胞上并使其在獲得融合后生長2周(也就是持續覆蓋培養物表面)，本發明公開的人ES細胞自發分化為神經元、心肌細胞、肝細胞和胰島細胞。可通過使用目的基因特異性引物和抗體的半定量RT-PCR和免疫組織化學來檢測上述細胞類型的特征標記。h)再生藥物中分化的干細胞本發明公開的人ES細胞體外可誘導分化為特定表型。采用這樣的技術可產生所需要細胞類型的純化群休，其可注射到，例如損壞的器官中以修復損傷。這樣的損傷可由多種疾病或狀態所導致，例如但不限于神經性退化疾病、心肌梗塞、充血性心力衰竭、肝衰竭和糖尿病。神經性退化疾病，包括但不限于中風、脊髓損傷、帕金森(氏)病、阿耳茨海默(氏)病、多發性硬化癥等等。因此，分化的人ES細胞在細胞替換治療或組織再生的細胞移植中擁有巨大的潛能。另外，本發明公開獲得的細胞系可用作多種治療性活性分子的運輸載體。例如，特異基因可傳遞到人體的多個部位，優選為了在細胞內進行遺傳操作和傳遞給靶位點，以用于基因治療。i)用于藥物篩選和治療的分化的干細胞本發明公開提供使用人ES細胞和其獨特能力分化為所有三種譜系細胞(外胚層、中胚層和內胚層)的可能性，以用于制藥學上的介入(pharmaceuticalintervention)和基于細胞的分析和體外毒性測試，所述制藥學上的介入和基于細胞的分析的目的是為了發現藥物。本發明公開的另一個方面提供了使用這些分化細胞的機會，包括但不限于神經元細胞、心肌細胞、肝細胞和(3胰島細胞，以用于篩選多種生物活性分子，例如，那些得自植物提取物或合成源的生物活性分子。篩選方法可用于開發用于不同疾病的新藥物分子，所述疾病例如為帕金森(氏)病、阿耳茨海默(氏)病、亨廷頓病、心臟疾患、糖尿病和肝臟疾病。根據相似的路線，鼠ES細胞衍生的肝細胞可用于研究異生素誘導的肝毒性，所述研究是通過測定酶的釋放而完成的，所述酶包括但限于，血清谷丙轉氨酶(SGPT)、血清谷草轉氨酶(SGOT)、堿性磷酸酶(ALP)、和乳酸脫氫酶(LDH)。本發明公開的細胞也可用于研究藥物誘導的細胞色素P450亞型的誘導作用和采用分析技術鑒定藥物代謝，所述亞型包括但不限于CYP1A1、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C9、CYP2E1和CYP3A4，所述分析技術包括但不限于，高效液相色譜(HPLC)、液相層析色譜-質譜(LC-MS)和氣相層析色譜-質譜(GC-MS)。本發明公開所衍生的細胞也可用于產生多克隆和單克隆抗體，用于研究或治療潛能，優選用于產生治療多種疾病的單克隆抗體。下述實施例用于闡明本發明的優選實施方案。本領域技術人員可理解實施例中公開的技術，其代表發明人開發的技術，且在實施本發明中表現的效果良好，因而認為構成實施的優選模式。然而，本領域的技術人員，應根據本發明公開的內容，根據公開的具體實施方案作出修改而獲得類似的或相似的結果，應當理解并為不偏離本發明的主旨和范圍。實施例1當前的實施例公開了體外受精制備胚泡。1)分離胚泡可從多種來源分離胚泡階段的胚胎(胚泡)。這些胚泡分離自回收的體內受精的植入前胚胎、或體外受精(IVF)(例如，胚胎受精通過傳統授精、精子卵漿內注射技術或卵質轉移)。人胚泡獲自其自愿捐獻其多余胚胎的夫婦或供體。在獲得這些夫婦或供體書面的和自愿同意后，這些胚胎用于研究目的。或者，將體細胞或細胞核轉入去核的人或非人來源的卵母細胞后剌激發育為胚泡階段，從而獲得胚泡。所用的胚泡已經冷藏保存，或獲自早期階段冷藏保存的胚胎并繼續發育成胚泡階段的胚胎。優選地，用于當前公開的是擁有良好形態級別的胚泡，例如，其內細胞團發育良好的胚泡。胚泡和內細胞團的發育根據種類的不同而變化，這是本領域技術人員已知的。胚胎培養在條件培養基中，該條件培養基使其保持存活并且增強其發育為胚泡階段的胚胎(Fong和Bongso(1999)，每篇文獻以引用的方式納入本文)。在獲得機構倫理委員會的批準后，啟動采用人胚泡的本文公開的任何研究。優選取得供體的書面同意，即同意在完成不孕治療后，捐獻其多余胚胎用于所述研究。從不孕患者獲得有用的胚胎采用通常的步驟，描述如下2)體外受精對于IVF，婦女必須首先經歷使用GnRH拮抗劑的腦下垂體抑制治療所述抑制劑如為醋酸亮丙瑞林(Lupron)。隨后注射促性腺激素(hMG)7-12天以控制卵巢過度剌激，其中用超聲(波)檢査法和血漿雌二醇水平監控卵泡的生長。當至少一個或多個卵泡長成直徑18mm時，肌內注射hCG10,000IU(Profasi)以促發排卵。3)提取卵母細胞和胚胎復蘇在超聲波檢查指導下34-36小時時卵泡抽吸提取卵母細胞。評估受精是根據2個原核(2PN)的存在和受精的卵母細胞轉移到胚胎培養皿中。每個平板2個受精的原核(2PN)轉移到0.75-lml的卵裂培養基(Quinn'scleavageMedium(SageBiopharmaCat.#ART-1026))。這些培養皿在含5%C02的環境、37。C下溫箱中培養2天。第二天更換卵裂培養基。在第三天，用胚泡培養基(SageBiopharmaCat.#ART-1029))替換卵裂培養基，胚胎培養至5到7天，直到獲得擴展的胚泡。每隔一天更換培養基。培養過夜后，立體顯微鏡下可觀察到胚胎。如果胚胎發育成桑葚胚或良好擴展的胚泡則認為整合是成功的(附圖1.1和1.2)。本文公開的人ES細胞自桑葚胚階段到胚泡階段分離。實施例2當前的實施例公開了鼠胚胎成纖維細胞(飼養)的衍生和儲存。1)妊娠鼠的獲得和解剖鼠胚胎成纖維細胞(MEFs)獲自近親品系C57黑鼠或其他合適的種系。在一個例證性的方法中，頸脫位法處死交配(dpc)后或妊娠13.5天的鼠。70%異丙醇涂抹鼠腹部后切開一小口。相反方向拉開腹部皮膚以暴露內臟。在后腹腔可見裝滿胚胎的子宮。無菌鑷子和剪刀分離子宮，放入50ml帶有螺旋帽的圓錐形離心管中，所述離心管中包含20ml無菌的杜伯科(氏)磷酸緩沖鹽溶液，且其不含Ca-和Mg(GIBCO-BRL,CatNo.l4190-144)。從所有處死的妊娠鼠中分離包含胚胎的子宮。在層流通風櫥中，用無菌的無Ca-和Mg的杜伯科(氏)磷酸緩沖鹽溶液沖洗子宮5到6次。使用無菌尖頭鉗和剪刀收集胚胎，去除胎盤、膜和軟組織。2)鼠胚胎分級立體顯微鏡下分級鼠胚胎。根據多種標準對鼠胚胎進行分級，最常規的如Theiler在"TheHouseMouse:AtlasforMouseDevelopment"(1989)(在此以引入的方式納入本文)中描述的。Theiler的標準太寬泛以至于無法區分早期發育的許多重要階段，因此需要補充其他的，例如，細胞數、體節數、或其他Downs和Davis(1993)，Dev.,118(4):1255-66(在此以引入的方式納入本文)所用的特征。同樣妊齡的胚胎在早期發育的階段可能是不同的。Downs和Davis識別的階段適用于C57黑XCBA鼠、近親品系C57黑鼠、和其他相近種系的Fl雜種。獲得用于生長ES細胞的詞養源的最能接受階段是Theiler級21禾卩22。Theiler級21是13dpc，在12.5-14dpc的范圍內，禾卩52-55體節。這一級的特征是前面鋸齒狀的腳板、可辨認的肘和腕、5排腮須和明顯清楚的臍疝。另外，這一階段的區別特征為毛囊不存在和手指末梢分離。Theiler級22公認為14dpc，在13.5到14dpc范圍內，和56-60體節。這一級的顯著特征是末梢分離的手指、后端腳板指頭之間的缺口、和存在長肢體骨以及胸部、骨盤和軀干部位存在毛囊。其他特征包括開放眼瞼缺失和頭側區存在毛囊。3)處理鼠胚胎進一歩處理胚胎包括在立體顯微鏡下用無菌的尖頭鑷子首先去除頭部，然后是所有的內臟。動物尸體轉移到有蓋的96mm無菌培養皿中，然后采用無菌彎形(手術:i剪適當的絞碎。絞碎后轉移到50ml圓錐形離心管中，離心管中含大約15-20ml0.25X的胰蛋白酶-EDTA(GIBCO-BRL,CatalogNo.25200-056)，并37°C下預熱。絞碎的塊用10ml吸管在胰蛋白酶-EDTA溶液中研磨3-4次，然后經過配有18計量注射針的20ml注射器2-3次。細胞懸浮液在37°C下溫浴10-15分鐘。細胞懸浮液再次用10ml的吸管研磨。細胞懸浮液中的胰蛋白酶通過加入20ml完整培養基(90%達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養基-高糖、10%胎牛血清、lmML-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸和0.1mMP-巰基乙醇)失活，最后將細胞懸浮液平鋪在組織培養基的燒瓶中。此后，細胞生長至匯合，其中每隔一天更換培養基，同時定期監測。4)冷凍鼠胚胎成纖維細胞在融合時將細胞冷凍在冷凍培養基中，所述培養基包含60%胎牛血清、20%DMSO和20X的完全培養基。為了冷凍，細胞重懸在完全培養基中，然后與冷凍培養基以1:1比例混合。冷凍懸浮液分裝成lml的冷凍小瓶，其中lml含5百萬細胞。這些小瓶儲存在液氮下供長期使用。5)鑒定MEFs每批詞養源是否符合條件是通過測試人ES細胞在MEF上生長5代。鑒定的過程包括評估重要參數如人ES細胞克隆的形態學分析(附圖2.1和2.2)，免疫化學分析ES細胞標記的表達(附圖2.3和2.4)，RT-PCT(附圖2.5)和通過內毒素和支原體測試檢測無菌。只有合格的飼養能夠用于分離、傳代和維持ReliCellhESl細胞系。實施例3當前的實施例描述了人ES細胞的衍生和維持。1)滅活和平鋪鼠胚胎成纖維細胞(飼養源)儲存在液氮中的飼養細胞解凍后根據需要培養。將冷凍小瓶放置在37。C水浴中直到內含物半融。將內含物收集在試管中，并與溫熱培養基混合以稀釋冷凍保護劑。細胞用吸管吹吸懸浮后平鋪在包含新鮮的MED培養基(90%達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養基-高糖(GIBCO)、10%胎牛血清(Hyclone)、lmML-谷氨酰胺(GIBCO)、1%非必需氨基酸(GIBCO)禾no.lmM(3-巰基乙醇(Sigma))的組織培養燒瓶中。一旦細胞到達匯合階段，就準備滅活。細胞滅活用絲裂霉素c處理或y照射。這里細胞滅活是指使用絲裂霉素c處理兩個半小時。10ng/ml絲裂霉素C的使用條件是在37°C和5%C02下。沖洗細胞幾次以完全除去絲裂霉素C，然后采用酶(如胰蛋白酶-EDTA)進行胰蛋白酶化。然后計數這些細胞，并且以6.25x104細胞/cm"農度平鋪在0.2%的凝膠平板上。這些細胞平鋪后培養在37°C和5%C02下。這些平板用于平鋪培養分離的人ES細胞。2)ICM分離為了無細胞損失風險的分離ICM，將完整的胚胎培養方法施用于6天的胚胎培養物(附圖1和3)。透明帶用0.5%鏈霉蛋白酶消化約2分鐘。ICM接著平鋪在有絲分裂分裂失活的MEF細胞上。用在這種技術中的人ES細胞培養基的組成如下80%DMEM/F-12(GIBCO，帶有4500mg/L葡萄糖)、15XES測試FBS(Hyclone,USA)、5%血清替代品(GIBCO,#10828-028)、1%非必需氨基酸溶液(GIBCO)、lmM谷氨酰胺(GIBCO)、0.1%卩巰基乙醇(Sigma)、4ng/ml人bFGF(R&D系統)和10ng/ml人白血病抑制因子(Sigma)。7天后，分離用微量吸管機械分離ICM團塊與其他細胞。隨后ICM團塊重新平鋪在新鮮的飼養細胞層上并加入新鮮的培養基。3)培養和手工傳代人ES細胞未分化克隆的隨后傳代的進行是用尖銳邊緣的微量吸管系統地切下團塊中的克隆，其中團塊中約含100個細胞(附圖4)。通過去除任何不需要的分化區域的克隆進行篩選。一旦分離團塊，用同樣的帶有口吹吸設備的微量吸管(內徑梢大于團塊大小)吸取并轉移到新鮮的成纖維細胞飼養層上。培養系統維持在恒定的溫度37°C，并放置在5%C02的溫箱中。細胞系ReliCelFMhESl體外生長40代，所述細胞系仍舊主要由形態學上是人ES細胞的細胞組成。4)冷凍保存人ES細胞三天齡的"好"的未分化人ES克隆用于冷凍。采用細胞刮層器具將ES克隆與飼養層一起分成小份。然后，細胞收集在無菌的5ml離心管(Nunc)中，200G離心3分鐘。吸去上清液。測定細胞小球的體積后重懸在ES培養基中，并使其體積至0.5ml。下一步，等體積的冷凍培養基，其中包括60XES測試FBS(Hyclone，USA)、20%ES培養基，和20%DMSOHYBRIMAX(Sigma)，輕輕的加入到hES細胞懸浮液中，伴隨著不時的攪拌。ES細胞團塊轉移到包含冷凍培養基的1.2ml冷凍小瓶(Nalge-Nunc,USA)中。小瓶在冷凍柜(Sigma)巾緩慢地冷凍(l。c/min)至-80。C，第二天保存在液氮中。關于復蘇率，發現冷凍人ES細胞解凍后的存活率大約為50%或更高。實施例4目前的實施例鑒定分離的人ES細胞。O產生胚狀體為了產生胚狀體(EBs)人ES細胞克隆需要手工分割成小份或者用膠原酶或胰蛋白酶EDTA酶促處理溶解成小份。在此，人ES細胞克隆手工被分割成小份用于胚狀體形成。EB培養基(80%DMEM/F-12(GIBCO，帶有葡萄糖4500mg/L)、15%ES測試FBS(Hydone,USA)、5%血清替代品(GIBCO，#10828-028)、1%非必需氨基酸溶液(GIBCO)、lmM谷氨酰胺(GIBCO)、和0.1%p巰基乙醇(Sigma))中的小份轉移到細菌平板上集合。使細胞集合在此培養基上生長10-14天，每3天換一次培養基。鑒定這種方法產生的EBs采用懸浮培養不同天數的細胞和分子標記，例如，0天、6天、10天和14天(附圖9.1-9.4),以評價人ES細胞系的體外分化潛能。2)免疫細胞化學生長在2—孔腔式載波片(BectonDickinson,USA)的細胞被固定在新鮮制備的4%多聚甲醛，并使用0.2%TritonX-100的PBS進行透化處理。非特異性結合位點用含1X小牛血清白蛋白的PBS封閉。細胞隨后同初級抗體在4。C溫浴過夜。采用這種方法，分析一組未分化干細胞標記如Oct-3/4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81、堿性磷酸酶、Connexin43、E-鈣粘蛋白(圖5.1到5.8)，同時分析一組分化標記如巢蛋白(外胚層)、平滑肌肌動蛋白和Bmchyury(中胚層)、AFP禾nGATA-4(內胚層)(附圖10.1-10.5)。(表1列出所用抗體的相關信息)。隨后沖洗細胞并與合適的FITC標記的二級抗體在室溫黑暗中放置1小時。下一步，細胞用DAPI(lug/ml;Sigma)對比染色。計數后，在熒光顯微鏡(NikonEclipseE600)下觀察細胞，以評價免疫陽性區域。人ES細胞表達SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81和Oct-4(是典型的人ES細胞)，以及表達E-鈣粘蛋白和間隙連接蛋白43(Connexin-43)(附圖5)。由熒光顯微鏡可知人ES細胞也顯示堿性磷酸酶活性(附圖5.8)。進一步，14天的EBs對分化標記如巢蛋白(外胚層)，平滑肌肌動蛋白和短尾(Bmchyury)(中胚層)、GATA-4和AFP(內胚層)顯示出陽性染色(附圖10)。表l:詳述所用的抗體<table>complextableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>巢蛋flChemicon,USA1:200f-滑肌肌動蛋白Santacruz，USA1:100GATA4Santacmz,USA1:1003)RT-PCR分析基因表達根據制造商說明通過TRIzol方法(Invitrogen)分離本文公開的ES細胞的總RNA。l叱用RNase-OUT核糖核酸酶抑制劑(Invitrogen)處理后的RNA被用于cDNA分析。采用Superscript逆轉錄酶-II(Invitrogen)和寡dT(Invitrogen)啟動反應進行逆轉錄。選擇的PCR弓l物可區分cDNA和基因組DNA這是采用針對不同外顯子特異性的單獨引物來實現的。通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增1^ofcDNA，其中采用Abgene2XPCRmastermix(Abgene,Surrey,UK)和合適的引物。評價一系列標記的表達，所述標記包括未分化干細胞標記和譜系特異性標記，其中未分化千細胞標記例如為Oct-4、Nanog、Rexl、Sox-2、FGF4、Utfl、Thyl、Criptol、ABCG2、Dppa5、TERT、Connexin-43和Connexin-45，所述譜系特異性標記例如為角蛋白5、角蛋白15、角蛋白18、Sox-INFH(外胚層)，Brachyury、Msxl、MyoD、HAND1、心肌肌動蛋白(中胚層)，GATA4、AFP、HNF-4ouHNF-3p、白蛋白禾口PDX1(內胚層)。表2列出了具體的引物。對于所有的基因，PCR進行35個循環，具體為94。C起始變性l分鐘后，進行35個循環的"94°C下30秒，相應基因引物的退火溫度下45秒和72°C下1分鐘。在最后一個循環后，在72°C下保持5分鐘。早期傳代和晚期傳代的人ES細胞均清楚的表達一組與多能相關的基因，所述基因包括Oct-4、Nanog、Rex-l、Sox-2、Criptol、FGF4、Thyl、Utfl、ABCG2、Dppa5禾PhTERT，和間隙連接蛋白如Connexin-43禾口Connexin-45(圖6和表3)。用作陰性對照的HEF細胞缺乏任何這些標記的表達。進一歩，分別在0天、6天、10天和14天EBs評價有關譜系特異性分化的所有列表基因的表達格局(附圖11和表3)。EBs被觀察到從分化的第6天到14天期間的早期階段外胚層標記的一致表達，所述標記例如為角蛋白5、角蛋白15和角蛋白18。有趣的是，這些基因在第0天分化時并不表達，后期階段神經外胚層標記Sox-l和NFH只存在于第10天到第14天分化時(附圖11)。在中胚層譜系標記中，Msxl(前心肌轉錄因子)，在分化過程中均一的表達。其他中胚層標記被證明在ES細胞中表達很少或沒有表達，所述標記包括brachyury、HAND1、MyoD和心肌肌動蛋白(附圖11)。類似地，早期內胚層細胞標記在細胞聚集體形成的第6天和第10天表達，盡管GATA4水平被證實在懸浮培養第10天到第14天有暫時的升高，其中所述標記包括AFP、HNF-4a和HNF-3卩(附圖ll)。分別檢測到成熟肝細胞、胰島細胞的標記(分別為白蛋白和PDX1)表達很弱，因此證明了成熟內胚層衍生物的缺乏(附圖ll)。表2:所用引物的詳細信息<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>4)HLA分類由于人ES細胞表達的HLA抗原譜系具有臨床相關特征，從而要建立ReliCellTMhESl細胞系的HLA格局。簡要地，HLADNA分類的進行是采用PCR擴增的DNA的適宜性雜交(adoptedhybridization)，其中使用序列特異性寡核苷酸探針(SSOP)作為HLA分型的主要技術(TepnelLifecodesCorporation,Wythenshawe,Manchester,UK)。對HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB和HLA-DQB基因座進行測試分析。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>如表4顯示，結果證明ReliCellhESl細胞系代表如下范圍的HLA表型等位基因HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB和HLA-DQB。5)STR分類建立ReliCellhESl細胞系的DNA指紋圖譜。為STR分析所分析的基因座包括D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、vWA、THOl、牙釉蛋白、TPOX禾卩CSFIPO(多重-PCR-為基礎的PowerPlex1.2試劑盒(Promega，Madison,WI,USA))。分析的基因座包括D5S818、D13S317、D7S820、D16S539、vWA、THOl、牙釉蛋白、TPOX和CSFIPO，結果列在表5。這一組包含的所有基因座都是真正的的四-核l「重復。電泳分離擴增子，采用應用生物系統的Genotyper⑧2.0軟件分析。根據這些9個基因座的研究，很明顯該細胞系來源自印度人的胚胎，這與至今報道的細胞系不同。這些指紋圖譜的結果也在細胞系分散后提供了有用的細胞系信息。表5<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>6)核型分離的人ES細胞核型分析采用秋水仙酰胺阻止和G帶顯帶技術的標準方法。簡要地，60mm培養皿中培養的人ES細胞達到60X匯合。細胞與溴化乙錠(12ug/ml)在37。C，5%(302下溫育40分鐘，隨后用秋水仙酰胺(120ng/mL)處理40分鐘。下一步，細胞用預先溫熱的0.25。^胰蛋白酶-EDTA溶解。離心收集細胞，在低滲KC1溶液(0.075M)中懸浮15分鐘，然后在卡諾依(氏)固定液(冰醋酸甲醇；3:1)固定。中期展開在濕的載波片上，空氣干燥，90。C烘烤1小時，進行Giemsa染色。使用OlympusBX40顯微鏡對20個分裂中期進行完全的核型分析，并且使用數字成像系統拍攝圖像。7)端粒末端轉移酶分析端粒末端轉移酶的分析采用非放射性同位素的凝膠基標準TRAP(端粒末端轉移酶重復擴增)方案(Zhang等，(2000)CellRes.,10(l):71-7禾卩Rubiano等，(2003),Mem.Inst.OswaldoCruz.,98(5):693-5)，其中采用Chemicon，USA(CatalogNo,S7700)的TRAPeze端粒末端轉移酶檢測試劑盒。大約50—70個人ES細胞克隆沉淀，并用200piIXCHAPS溶解緩沖液溶解。IXCHAPS溶解緩沖液中的細胞懸浮液在冰上孵育30分鐘后在4°C以12,000g離心20分鐘。上清液快速冷凍并儲存在一80。C。使用Bradford化驗測定總蛋白量。采用l-6嗎總提取物分析端粒末端轉移酶。熱失活樣品作為每個分析的陰性對照。對于端粒末端轉移酶PCR，根據試劑盒指示，加入dNTP、TRAP引物混合物、TS引物和TAQ聚合酶制備主要混合物。下一步，加入細胞提取物，總反應體積維持在50pl。進行兩步PCR反應(94。C下30秒和59。C下30秒)，上述反應需要33到35個循環。PCR產物在12.5%非變性聚丙烯酰胺垂直凝膠上以400伏電泳，直到二甲苯藍染料前沿到達整個電泳通道長度的三分之二。凝膠用l:5000稀釋度的SYBRGREENI染色(分子探針，編號S-7567)，在UV透照燈下可視，和采用凝膠文檔系統(geldocumentationsystem)進行照相。產生的端粒末端轉移酶產物(TPG)的相對定量是根據Zhang等，(2003)的方法進行的。TPB解釋為公式TPG={[(TP-B)/TI]/[(R8-B)/RI]}。其中，TP是測試提取物中產生的端粒末端轉移酶產物；B是Blank溶解緩沖液中產生的端粒末端轉移酶產物;R8是定量標準中產生的端粒末端轉移酶產物，TSR8對照模板；Tl是測試提取物的內部參照；和RI是定量標準的內部參照，TSR8對照模板。附圖8顯示37代RdiCellTMhESl的高端粒末端轉移酶活性，其中采用NTERA-2hEC細胞作為陽性對照，MEF作為陰性對照。8)無菌和病原體試驗對ReliCellhESl細胞培養物進行進一步的細菌和真菌試驗。培養物分別在溫育的48小時、14天和21天時進行常規監測和報道。另外，進行內毒素和支原體試驗，其中采用Hoechst分析每個培養物。最后，篩選存在人病原體的培養物，所述病原體包括HIV-I、HIV-2、人T-Cell淋巴營養性病毒I/n、HSV1、HSV2、EBV、CMV、乙肝病毒和丙肝病毒。9)畸胎瘤形成成體裸鼠用于畸胎瘤形成研究。未分化的人ES細胞懸浮液(每只動物5—10百萬細胞)肌內注射動物。注射后，動物仍關在單獨過濾器頂部的籠子里。這些籠子具有特殊動物隔離裝置以預防任何可能的感染。8—10周后，用過量克他命(IOOmg/kgi.p.)處死動物，和經頸動脈的灌注肝素鹽水(0.9%鹽溶液中含0.1肝素)，接著灌注磷酸鹽緩沖液制備的4%多聚甲醛。從動物分離腫瘤，將腫瘤在4%多聚甲醛和20%蔗糖中固定過夜。腫瘤用冷凍切片機切片(20um)，切片收集在明膠涂鋪的載波片上。腫瘤切片用蘇木精/伊紅染色，顯微鏡下觀察屬于三個胚層(外培層、中胚層和內胚層)的細胞。附圖7顯示這個試驗的結果。所有動物試驗的進行都是依據機構動物倫理委員會的指導。10)采用鼠ES細胞的分化肝細胞確立體外肝毒性模型鼠ES細胞分化成肝細胞，上述分化借助于在不含L1F的培養基中Ebs的形成。4天懸浮培養后，15—20EBs平鋪在35mm的培養皿上，并使其分化20—25天，巧述培養皿涂抹1X基質膠(BDBiosciences:USA)。優化生長因子、細胞因子(例如，骨形成蛋白(BMP2和BMP4)、肝細胞生長因子(HGF)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)、和堿性-FGF(bFGF))和皮質激素(例如，地塞米松)的濃度，從而利于肝分化。通過RT-PCR和免疫細胞化學檢測肝標記的陽性表達以證實獲得的分化細胞是肝細胞。處于亞匯合階段(通常在平鋪培養48小時)的HepG2(人肝癌細胞系)可用作陽性對照，以優化基于分化的ES細胞的肝毒性模型。HepG2以劑量依賴性模式暴露于CC14(Sigma)—段時間(30,90,120,150,180和240分鐘)(0.1%,0.3%，0.6%和1.0%)。根據這些觀察，對從鼠ES細胞分化的肝細胞(第20天)試驗條件進行選擇，結果為0.6%的CC14和暴露時間180分鐘(附圖13)。在包含5XFBS的DPBS(Gibco-BRL,USA)中制備CCU。在溫育階段的末期，收集懸浮液，并在1000rpm離心2分鐘。懸浮液用于測定SGOT、SGPT、LDH和ALP水平。用細胞刮棒取出細胞，細胞懸浮液收集在eppendorf管中。細胞懸浮液在2000rpm離心4分鐘，細胞沉淀溶解在200julM-PER溶解緩沖液(Pierce,USA)中用于蛋白測定o按照制造商的說明，細胞懸浮液用于測定SGPT、SGOT、(ALP)、和LDH水平。對于SGPT禾PSGOT，釆用試劑盒(manul);對于LDH和ALP，采用HUMAN試劑盒(manul)。樣品分析采用Konelab20i自動分析儀(ThermoClinicalLabSystems,Finland)。水平表示為單位/升。0.6X的CCU導致SGPT、SGOT、ALP和LDH水平的時間依賴性增加，這表明隨時間的增加，肝細胞損害也增加。這些酶的最大釋放在180分鐘時。事先用N—乙酰半胱氨酸處理(24hr,25^M)可有效阻斷這些酶釋放的增加。這表明事先用N—乙酰半胱氨酸處理可預防CCU導致的肝細胞損害。實施例4目前實施例驗證了ReliCellTMhESl和體外分化潛能。為啟動分化，誘導人ES細胞在懸浮培養中經歷6—14天的EB形成，上述形成是通過將所述克隆機械分割成由100—150個細胞組成的小或中等大小的塊，并在無LIF的和無飼養層的基礎培養基中培養而完成的，且所述所述EB形成是在細菌學上的培養皿上。根據EBs上譜系特異性標記的表達格局判定適于分化誘導為不同表型的EBs的分化齡，所述譜系特異性標記由RT-PCR所證實。神經外胚層分化為了測定人ES細胞系分化為神經元的潛能，進行了多重步驟操作。在無血清的ITSFn培養基中溫育6天齡的EBs7到10天，以篩選神經前體細胞。隨后細胞在N2培養基上擴增，所述培養基補包含DMEM/F12，并添加有bFGF(10ng/ml)和EGF(10ng/ml)。分化步驟包括去除bFGF，并在添加GDNF(5ng/ml)的N2培養基中培養細胞2-3周。MAP-2(1:200,chemicon)(—種神經元細胞標記)的表達是通過免疫熒光分析而進行評估，從而證實神經元分化。中胚層分化產生EBs后，8天齡的EBs接種在35mm的組織培養皿(Nunc,Roskilde,丹麥)上，所述培養皿事先涂鋪包含0.1%明月交(Sigme，USA)的80^DMEM培養基，該培養基添加有15%FBS、1%非必需氨基酸、lmM谷氨酰胺、0.1%3—巰基乙醇和12.5ng/ml人堿性成纖維細胞生長因子。EBs有規律的跳動出現在分化培養的第17—18天，這表明了心肌的分化，并且在相差顯微鏡下每天仔細觀測監控所述跳動超過45天。EBs完整的收縮區域用無菌的玻璃拉伸的吸管在立體顯微鏡下機械分離，平鋪到明膠包被的2孔腔式載波片(Nimc,Roskilde,丹麥)上用于進一步的鑒定。內胚層分化為了誘導胰腺的分化，進行Segev等，(2004)的經典操作規程。io天齡的EBs平鋪在35mm的塑料組織培養皿(Nunc,Roskilde，丹麥)上，并使其生長于培養基I中，所述培養基包含DMEMF/12、胰島素(10ng/l)、運鐵蛋白(6.7ng/1)、硒(5.5mg/1)和lmML-谷氨酰胺(所有來自Gibco)，并添加有5嗎/ml纖連蛋白(Sigma)。一周后，細胞用0.05。^胰蛋白酶-EDTA(Gibco-Invitrogen)溶解并重新平鋪于預先涂鋪0.1%明膠的35mm塑料組織培養皿(Nimc,Roskilde，丹麥)上，細胞濃度達2xl05細胞/ml，所述培養皿內含培養基II，且所述培養基II包含DMEMF/12、500|ig/ml胰島素、10,000嗎/ml運鐵蛋白、0.63)ig/ml孕酮、1.611嗎/mlputrascine、和0.52嗎/ml亞硒酸鹽(添加有N2和B27，兩者都來自Gibco)，和1mML-谷氨酉先胺和10ng/mlbFGF(R&Dsystems)。在這個階段，監測胰島樣凝塊的出現，并對其采用組織特異性標記(如PDX—1)進行免疫化學分析。為了誘導肝細胞分化，10天齡的EBs平鋪在35mm的塑料組織培養皿(Nunc)上，并使其在培養基中分化25—30天，所述培養皿預先涂鋪1X基質膠(BDBiosciences,Bedford,MA,USA)，所述培養基包含DMEM(高糖)、10%FBS、L-谷氨酰胺(ImM)、非必需氨基酸(1%)、P-巰基乙醇(O.lmM)、肝細胞生長引子(HGF)20Tig/ml、FGF4(10rig/ml)、人制瘤素(10rig/ml)、胰島素-運鐵蛋白-亞硒酸(ITS)(IX)、地塞米松(10—5mM)和EGF(20"g/ml)(所有的生fe因子都來自R&DBiosystems)。在分化過程中，監控培養物中橢圓形細胞出現。為了進一步鑒定，分析包含分化20天的細胞的2—孔腔式載波片。檢查細胞系分化為多種表型細胞的分化潛能。在吸附到培養皿后，從人ES細胞克隆形成的EBs注定被誘導分化為神經外胚層、中胚層和內胚層。添加ITSFn培養基后，一周內EBs開始增生擴散并發育成多種神經突起樣衍生物。這些神經前體細胞在培養在組織培養平板中的N2培養基時發育成圓形細胞體，所述平板事先涂鋪聚一l一鳥氨酸和層粘連蛋白，所述細胞體將逐漸呈現神經元形態，發展為雙極或多極延伸，并最后形成網絡狀。在撤掉bFGF和添加分化培養基后，這些細胞顯示典型的神經元外觀，其進一步顯示初級的分支和二級分支(附圖12.1)。間接免疫染色顯示這些細胞對神經元特異性蛋白標記MAP-2具有免疫活性(附圖12.2)。因為細胞的尺寸和定向對于心肌細胞網絡至關重要，所以研究了人ES細胞衍生的心肌克隆的結構特性。在分化15—18天時鑒定出自發收縮區域存在于Ess的生長暈處，(附圖12.3)。進一步，免疫化學顯示心肌肌鈣蛋白I(cTnl)(1:200，Chemicon，Temecula,CA,USA)的存在，其為一種心肌特異性蛋白，并涉及分化Ebs的心肌收縮調節(附圖12.4)。在胰腺祖細胞擴展后，觀察到胰島樣凝塊，這一點由PDX-1標記免疫染色來證實(附圖12.5和12.6)。在分化15—18天后，可見橢圓形細胞凝塊，這說明了肝細胞的分化。AFP是一種內胚層特異性標記，其在分化15天后被檢測到。進一步，采用CK18的免疫染色證實了角蛋白的存在，這對肝胚細胞而言是正確的(附圖12.7和12.8)。本文公開的所有組合物和方法都可以制備和實施，根據目前的公開內容并不需要過多的試驗。盡管本發明的組合物和方法已經根據優選的實施方案描述，很顯然，對于本領域技術人員來說，對本發明的組合物和/或方法和方法中的步驟或步驟順序所做的變更，并不偏離本發明的內容、精神和范圍。更具體地，很顯然某些化學或生理相關的試劑，可替代本文描述的試劑而獲得相同或相似的結果。所有這樣的取代或修飾對于本領域技術人員來說是顯而易見的，屬于本發明的精神、范圍和內容之內。權利要求1、人多能胚胎干細胞的純化制劑，其中所述細胞包括(i)能夠分化為如下衍生物內胚層、中胚層和外胚層組織，(ii)正常核型，(iii)能夠體外培養增殖至少約25代，和(iv)一種或多種如表4所列的人白細胞抗原(HLA)等位基因。2、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞包含兩種或兩種以上的如表4所列的HLA等位基因。3、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞包含三種或三種以上的如表4所列的HLA等位基因。4、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞包含四種或四種以上的如表4所列的HLA等位基因5、如權利要求l所述的制劑，其中所述細胞包含所有如表4所列的HLA等位基因。6、如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑在體外繁殖培養超過1年。7、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞在成纖維細胞飼養層上培養時，其分化受到抑制。8、如權利要求7所述的制劑，其中所述成纖維細胞詞養層是人成纖維細胞飼養層。9、如權利要求7所述的制劑，其中所述成纖維細胞飼養層是鼠成纖維細胞飼養層。10、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞進行無飼養層體外培養時，其分化受到抑制。11、如權利要求l所述的制劑，其中所述制劑在培養40代后基本上保持未分化。12、如權利要求1所述的制劑，其中所述制劑在培養100代后基本上保持未分化。13、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞進一步包含如表5所列的一種或多種短串聯重復序列基因座。14、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞進一步包含如表5所列的兩種或多種短串聯重復序列基因座。15、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞進一步包含如表5所列的三種或多種短串聯重復序列序列基因座。16、如權利要求l所述的制劑，其中所述細胞進一步包含如表5所列的所有短串聯重復序列序列基因座。17、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞對SSEA-3和SSEA-4標記呈陽性。18、如權利要求1所述的帝iJ劑，其中所述細胞對TRA-l-60和TRA-l-81標記呈陽性。19、如權利要求1所述的制劑，其中所述細胞表達堿性磷酸酶。20、如權利要求l所述的制劑，其中所述細胞表達高水平的端粒末端轉移酶。21、如權利要求l所述的制劑，其中所述細胞在懸浮培養時能形成胚狀體。全文摘要本發明公開了純化的并具有某些譜系特異性狀的人胚胎干細胞制劑。鑒定所述制劑是通過陽性表達下述多能細胞表面標記SSEA-1(-)、SSEA-4(+)、TRA-1-60(+)、TRA-1-81(+)、堿性磷酸酶(+)、和一組ES細胞標記包括Oct-4、Nang、Rex1、Sox2、Thy1、FGF4、ABCG2、Dppa5、UTF1、Criptol、hTERT、間隙連接蛋白43和間隙連接蛋白45。所述制劑細胞對下述譜系特異標記是陰性的角蛋白8、Sox-1、NFH(外胚層)，MyoD、brachyury、心-肌動蛋白(中胚層)，HNF-3β、白蛋白和PDX1(內胚層)。所述制劑的細胞是人胚胎干細胞，具有正常核型，顯示高端粒酶活性且在連續傳代培養超過40代后能夠以未分化狀態繼續繁殖。胚胎干細胞系Relicell^TMhES1在整個培養過程也保持這種能力，直到分化為細胞和組織類型，其衍生自所有三層胚胎生殖層(內胚層、中胚層和外胚層)。本發明也公開了分離人胚胎干細胞的方法。文檔編號C12N5/0735GK101180389SQ200680017387公開日2008年5月14日申請日期2006年5月17日優先權日2005年5月17日發明者克恩·菲爾多斯·阿拉姆,勒萬德倫·蓋特,博斯·比帕舍,帕爾·勒杰爾希,帕特基·阿爾內特,庫爾卡米·賈揚特,康納·阿帕爾納,曼達爾·阿倫德赫蒂,舍伯里·蒂普尼斯申請人:利萊恩斯生命科學有限公司