草魚耐糖性能相關的snp標記及其應用
【專利說明】草魚耐糖性能相關的SNP標記及其應用 【技術領域】
[0001] 本發明設及一種SNP標記及其應用，尤其設及一種草魚耐糖性能相關的SNP標記及 其應用，屬于分子標記領域。 【【背景技術】】
[0002] 草魚（Ctenopharyngodon idella)屬雅羅魚亞科化 euciscinae)、草魚屬 (Ctenopha巧ngodon)，是我國淡水養殖魚類中年產量最大的養殖對象，因草魚生長速度快， 肉質鮮美，深受人們喜愛。目前養殖草魚還有一定的效益空間，但從生產支出看，2008年W 來飼料成本不斷上漲，飼料成本占了草魚養殖的70% W上成本。因糖類屬于Ξ大營養物質 中最廉價的供能物質，生產中經常增加糖的含量來降低飼料成本，雖然草魚屬于草食性魚 類，相對比雜食性魚類和肉食性魚類對糖利用能力高，但還是遠遠低于陸生畜禽類。飼料中 糖類水平超過一定限度，會引發魚類免疫力下降、生長緩慢、死亡率增高等癥狀。選育出可 高效利用高糖飼料的新品種可大幅度降低草魚養殖成本，因此，開發快速可靠的育種技術， 進行草魚耐高糖品種(系）的培育也是十分必要。
[0003] 在開展常規選育研究的同時，開發和應用分子標記輔助育種技術可加快草魚良種 選育進程。SNP是指基因組DNA序列中由于單個核巧酸變異而產生的多態性，位于基因編碼 區的非同義SNP可導致氨基酸的變化，從而影響蛋白質的功能，特別是發生在結構功能區域 的SNP尤其重要，最終引起生物表型的變化。此外，在SNP標記研究和應用中發現，基因組上 相鄰SNPs的等位位點傾向W整體形式遺傳給后代，運種一組相關聯的SNPs等位位點被稱作 單倍型化aplotype)。為了更有效的鑒定與性狀密切相關的分子標記，必須對整個基因序列 上的SNPs所構成的單倍型進行關聯分析。
[0004] 糖酵解是糖代謝的主要途徑之一，丙酬酸激酶（pyruvate kinase，PK，EC 2.7.1.40)是催化糖酵解的最后一步的關鍵酶，其催化憐酸締醇式丙酬酸(PEP)轉變為丙酬 酸，憐酸締醇式丙酬酸的高能憐酸鍵在催化下轉移給ADP生成ATP。飼料中糖的含量與魚類 PK的活性密切相關。因此，綜合考慮PK在糖代謝過程中重要功能，開展草魚PK基因多態性的 研究很有必要。 【
【發明內容】
】
[000引為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種草魚耐糖性能相 關、能夠有效用于鑒定或選育耐糖性能強的草魚的SNP標記。本發明通過Bioedit2.0對樣品 的PKa序列進行比對，找到2個完全連鎖的SNP標記的位點，并進一步分析運兩個SNP標記組 成的基因型與草魚耐糖性能的關聯性，W達到快速鑒別或選育耐糖性強的草魚的目的。 [0006] 所述的兩個SNP標記的位點分別命名為H3(T+1817C)和H4(G+1818T)，其中，H3(T+ 1817C)位于SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列（草魚PK基因片段）中自5/端起第1817位，且該 位置處堿基為T或C;H4(G+1817T)位于SEQ ID N0:1所示的核巧酸序列中自5/端起第1818 位，且該位置處堿基為G或T。上述兩個SNP位點完全連鎖組成Ξ種基因型：TTGG、TCGT和 CCTT，分別命名為ΑΑ,ΑΒ和BB，發明人發現，基因型為AA(TTGG)的草魚耐糖能力顯著高于AB (TCGT)和BB(CCTT)草魚。因此，通過檢測草魚的上述SNP標記的基因型，能夠有效確定其耐 糖性能，進一步地，本發明的SNP標記能夠有效用于草魚的分子標記輔助育種。進而能夠根 據實際育種需求對耐糖草魚進行早期選擇，并可W大大節約時間、成本低廉，準確性高。 [0007] 上述SEQ ID N0:1的核巧酸序列如下(XY表示兩個SNP位點）：
[000引
[0009]本發明的另一目的是提供用于獲得上述SEQ ID N0:1所示核巧酸序列的引物對1， 所示引物對1具有SEQ ID N0:2-3所示的核巧酸序列，具體地，引物對1的序列如下：
[0010] 上游引物:GGCATCTTCCCCGTATTCT(SEQ ID N0:2)
[0011] 下游引物：CATCATCGTTCTCCTACTCAG(SEQ ID N0:3)
[0012] 本發明的另一目的是提供一種用于檢測上述SNP標記的引物對2,利用引物對2能 夠有效地對上述SNP標記位點所在的片段進行PCR擴增，達到快速檢測SNP標記的基因型、降 低檢測成本的目的。所述引物對2具有SEQ ID N0:4-5所示的核巧酸序列，具體地，引物對2 的序列如下：
[0013] 上游引物:GCCACAGGACCGTAACGCACTC(沈Q ID N0:4)
[0014] 下游引物:GACAAGCGCACAGACAGCTCTGCTTTAATGAGTAACAACCATGGATGTA(SEQ ID NO: 5)
[0015] 本發明的另一目的是提供所述SNP標記在鑒別或選育耐高糖草魚品種中的應用。
[0016] 本發明的另一目的是提供所述引物對1和引物對2在鑒別或選育耐高糖草魚品種 中的應用。
[0017] 本發明的另一目的是提供一種鑒定草魚耐糖性能的方法，具體包括W下步驟：
[001引（1)提取待測草魚的DNA;
[0019] (2)利用上述引物對1，將待測草魚的DNA進行PCR擴增，W獲得SEQ ID N0:1所示的 核巧酸序列產物；
[0020] (3)利用上述引物對2,將SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列進行PCR擴增，并在引物 對2的下游引物的5'端引入一個錯配堿基，W使其擴增產物可W被BsrGI限制性內切酶進行 識別；
[0021] (4)利用BsrGI限制性內切酶對步驟(3)獲得的擴增產物進行酶切，酶切產物利用 瓊脂糖凝膠電泳并在紫外燈下顯色，如果具有216bp單條譜帶，則其SNP標記為AA(TTGG)基 因型，其對應的草魚個體為耐高糖品種，有266bp和21化P兩條譜帶的為AB(TGCT)基因型，具 有266單條譜帶的為BB (CCTT)基因型，其對應的草魚為非耐高糖品種。
[0022] 進一步的，提取待測草魚DNA的方法不受特別限制，可W采用任何已知的DNA提取 方法或試劑盒進行。本發明實施例中采用常規酪氯仿方法抽提待測草魚的DNA。
[0023] 進行酶切的條件不受特別限制，本發明實施例中優選的酶切體系為:d地2〇 4化L， 限制性內切酶lul，PCR產物lul，10 XBuffer加1;酶切反應條件優選為37°C15min。
[0024] 進一步的，瓊脂糖凝膠電泳的優選條件為:2%瓊脂糖凝膠，100V，60min。
[0025] 本發明的優點及有益效果：
[0026] 本發明利用分子遺傳學及分子生物學的方法獲得草魚耐糖性能相關的SNP標記， 依據丙酬酸激酶基因內部產生的堿基突變，因此不存在遺傳的交換，也不需要表型的進一 步驗證。利用本發明的標記可W簡單快速的鑒定耐高糖草魚，同時也可W利用該標記指導 選育耐糖草魚新品系。 【【具體實施方式】】
[0027] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。 在未作說明的情況下，本發明采用的試劑、設備和方法均為本技術領域常規市購的試劑、設 備和常規使用的方法。
[002引 實施例1
[0029] 1飼料準備
[0030] 購買進口魚粉、豆巧、酒糟、面粉、豆油、憐酸二氨巧、氯化膽堿、食鹽、預混料（多 維、多礦），在珠江水產研究所飼料廠將運些飼料原料混合均勻后，加適量的水攬拌均勻，用 制粒機制成兩種顆粒大小為5mm左右的顆粒，將制好的顆粒飼料放入烘箱中，56°C恒溫干燥 2地，烘干后放入-20°C保存備用。將烘干后的飼料送廣州分析測試中屯、檢測其主要成分，分 析結果見表1，運兩種飼料的糖含量分別為39.4g/100g和45.4g/100g，分別記為普通飼料和 高糖飼料。
[0031 ]表1實驗飼料的組成成分
[0032]
[0033] 2實驗魚養殖
[0034] 從現有的珠江水產研究所良種基地、廣東海大集團百容水產種苗有限公司草魚繁 育群體中，選取400尾體長、體質量較為均勻的魚，體重為43±0.5g，隨機分成2組(普通組和 高糖組），每組200尾草魚，饑餓24小時后進行初始體重的測量，并給每尾魚打入電子忍片標 記后分別飼養在2個260cmX 300cmX 150cm的水