脂肪酸脫氫酶AhFAD2-1B-m基因的啟動子及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及植物基因工程和生物技術領域，具體設及一種花生Δ U脂肪酸脫氨酶 AhFAD2-lB-m基因啟動子，同時還設及AhFAD2-lB-m基因啟動子的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 花生是世界上最重要的經濟作物之一，在世界食用油消費及消遣食品中占有舉足 輕重的地位。巧仁含油量一般為46%-57%，其中油酸、亞油酸是最重要的組份，二者含量之和 一般占80%W上，兩者均為不飽和脂肪酸，分別含有1個和2個不飽和鍵。油酸含量或油酸/亞 油酸比值(〇化)是衡量花生耐膽藏性及品質的一個重要生化指標，該值愈大，花生耐膽藏性 愈好，其品質愈高。從對人體健康方面考慮，亞油酸的氧化產物具有導致動脈粥樣化的潛在 危險，同時還產生難聞的氣味和腐敗惡臭的不適口感，油酸在降低收縮壓、保護低密度脂蛋 白、降低有害膽固醇、維持有益膽固醇(高密度脂蛋白）和減緩動脈粥樣硬化等方面發揮重 要作用。而我國花生品種的油酸/亞油酸的比值普遍偏低，大果品種一般在1.3左右，小果品 種一般在1.0左右。
[0003] Δ "脂肪酸脫氨酶(del1:a 12-fatty acid desa1:urase, FAD2)是負責向油酸中引 入第二個雙鍵生成亞油酸的關鍵酶，決定了油巧中油酸和亞油酸的比例。花生中存在2個同 源非等位FAD2基因（AhFAD2-lA和AhFAD2-lB)，運2個基因在編碼區DNA序列高度同源 (99%)，分別來源于花生區組A基因組和B基因組。另外，在花生基因組中還存在一些FAD2的 假基因。FAD2基因結構和表達水平的變化是導致花生高油酸性狀產生的原因。高油酸天然 突變體F435的AhFAD2B基因起始密碼子后第442位核巧酸有一個堿基A插入，導致移碼突變， 使翻譯提前終止。高油酸突變體M2-225和C458分別是在AhFAD2B基因起始密碼子后997bp和 665bp處存在MITE插入，導致基因功能喪失。AhFAD2A基因在448個堿基出現G^A突變，導致 高油酸性狀產生。Jung等研究證實，控制高油酸性狀的oil位點和〇12位點分別編碼AhFAD2A 和AhFAD2B基因，花生高油酸性狀的產生是由于AhFAD2A和AhFAD2B基因同時突變，導致其 編碼的酶蛋白活性降低或功能喪失所致。目前對FAD2基因的研究主要集中在基因編碼區的 功能研究上，對該基因啟動子的研究鮮有報道。闡明該基因及其假基因啟動子的功能，對于 研究FAD2的功能、進化模式及改良花生脂肪酸組份及品質具有重要意義。
[0004] 啟動子包含多種重要順式作用元件參與基因的轉錄，參與調控下游基因的表達， 使得植物能夠適應外界環境的變化及自身生長發育的需要。因此對植物啟動子的研究有助 于了解基因表達模式及其調控機理。隨著分子生物學的發展和基因工程研究的需要，人們 分離了大量的啟動子，并對它們進行了鑒定，獲得了一大批有應用前景的啟動子，按照啟動 子的表達模式可分為Ξ類:第一類是組成型啟動子，運類啟動子在各個器官、組織、不同的 發育階段和各種環境下都有轉錄活性;第二類是組織特異性啟動子，運類啟動子僅在特定 的細胞、組織和發育階段具有轉錄活性;第Ξ類是誘導型啟動子，運類啟動子在特定的生物 或非生物信號誘導下具有轉錄活性。目前植物基因工程中廣泛應用的是組成型啟動子，它 們驅動目的基因在植物各個組織和整個發育階段都表達，運造成了物質和能量的浪費，增 加了植物的代謝負擔，有時候影響植物的發育，甚至引起植物形態的改變。因此采用特異性 啟動子取代組成型啟動子，使外源基因能夠特異性的表達，是植物基因工程的重要研究內 容。
【發明內容】
[000引本發明的目的在于:提供一種花生A U脂肪酸脫氨酶基因 AhFAD2-lB-m的啟動子。
[0006] 本發明的另一個目的在于:提供一種操作簡單、結果穩定可靠的花生Δ?2脂肪酸脫 氨酶基因 AhFAD2-lB-m啟動子的制備方法。
[0007] 本發明的再一個目的在于：提供一種含有植物高效表達啟動子的重組載體，其含 有所述的啟動子核巧酸序列。該載體大小適合，在植物中易與轉化，所帶有的標記基因 GUS 表達強度高，容易檢測。
[0008] 本發明還有一個目的：提供一種花生Δ U脂肪酸脫氨酶基因 AhFAD2-lB-m啟動子在 種子、子葉和下胚軸中的應用。
[0009] 為了完成上述目的，本發明采用如下技術方案： 一種分離的花生A"脂肪酸脫氨酶AhFAD2-lB-m基因啟動子，其序列是下列核巧酸序 列之一： (a) 序列表中SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列； (b) 在嚴謹條件下能與(a)的核巧酸序列雜交并且具有相同功能的核巧酸序列； (C)與(a)或(b)的核巧酸序列具有90%W上的同源性，并且具有所述啟動子功能的核巧 酸序列。
[001 0] -種花生PAhFAD2-lB-m啟動子的制備方法，包括W下步驟： (1) 利用SDS裂解法提取基因組DNA，所用引物為： PAhFAD2-lB-mS : 5>- ACGCGTCGACACCAAGTAGCTTCTCAATGGCTCAGATTCG-3>; PAhFAD2-lB-mA: 5'- GACATCTAGATGTTGTGTTGTTAAAGCTCCTGTTACCAATG-3'; (2) W基因組DNA為模板，進行PCR擴增，反應體系為25化，包括：1XPCR buffer、MgCl2 1.5 mmol/L、dNTP 0.2 mmol/L、Pfu Taq酶1.5單位、模板約30~100 ng，體系中引物濃度為 0.5 mol/L； 擴增過程為:95°(3預變性1111111;94°(3變性1〇3,55°(3退火3〇3,72°(3延伸2 111111，35個 循環;72°C延伸10 min; (3) PCR產物經質量體積比為1.0%的瓊脂糖凝膠檢測，用凝膠回收試劑盒回收目的片 段;按回收片段、pMD 18-T載體3:1的摩爾比混合，加入5個單位的T4 DNA連接酶，10 X反應緩 沖液2.5化，用無菌水補充體積至25化，16°C連接過夜，獲得連接液； (4) 用凍融法轉化D冊α菌株的感受態細胞，將連接液涂布于含有氨節青霉素50 mg / L的LB固體培養基平板上，37°C培養過夜，挑選白斑，進行菌落PCR檢測，將陽性重組子接種 于含氨節青霉素50 yg/mL的LB液體培養基，37°C 200 r/min振蕩培養過夜，用小量堿法提 取質粒，Sail / Xbal雙酶切1 yg質粒，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測;檢測正確的陽性重 組克隆，將目的片段連入pMDlS-T載體，獲得載體pMD18-PAhFAD2-lB-m，即得到所述的PAhFAD2-lB-m 啟動子。
[001。 所述的花生PAhFAD2-lB-m啟動子的制備方法，其中LB固體培養基的制備方法如下:分 別稱取10 g膜蛋白腺、5 g酵母提取物、10 g氯化鋼和8 g瓊脂依次溶解于蒸饋水中，定容于 1000毫升;然后分裝于500毫升Ξ角瓶中，121°C、6.859X 104 化下高壓消毒15分鐘，4°C冷 藏備用； LB液體培養基的制備方法如下:分別稱取10 g膜蛋白腺、5 g酵母提取物和10 g氯化鋼 溶解于蒸饋水中，定容于1000血，然后分裝于500 mLS角瓶中，12rC、6.859Xl04化下高 壓消毒15分鐘，4°C冷藏備用。
[0012] 含有所述的花生Δ U脂肪酸脫氨酶AhFAD2-lB-m基因啟動子的重組載體。
[0013] 含有權利要求4所述的花生Δ U脂肪酸脫氨酶AhFAD2-lB-m基因啟動子的重組載體 的構建方法，包括W下步驟： 首先用Sail / Xbal雙酶切克隆載體pMD18-PAhFAD2-iB-m，同時用Sail / Xbal雙酶切 pBI-PAhSAD-GUS質粒;酶切反應在37°C培養箱中進行，反應4~6小時后用質量體積比為1%的 瓊脂糖膠電泳檢測； 將克隆載體pMD18-PAhFAD2-lB-m酶切下的3肺的小片段和pB