一種幾丁質脫乙酰基酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種幾丁質脫乙酰基酶的突變體，屬于生物工程技術領域。本發明將專性海洋放線菌Salinispora arenicola幾丁質脫乙酰基酶第52位纈氨酸V突變為甘氨酸G，第66位的脯氨酸P點突變為絲氨酸S。相比突變前，突變體酶的比活力是野生型酶的3.92倍。本發明提供的幾丁質脫乙酰基酶更加適合工業化生產需求，滿足社會生產的要求。
【專利說明】
一種幾丁質脫乙酰基酶突變體
技術領域
[0001] 本發明公開了一種幾丁質脫乙酰基酶的突變體，屬于生物工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 幾丁質（chitin)又稱甲殼素、甲殼質等，是由N-乙酰-D葡萄糖胺(GlcNAc)單體通 過β_1，4糖苷鍵鏈接而成的直鏈高分子化合物，是自然界中次于纖維素的天然高分子。幾丁 質具有幾乎不溶于水和一般有機溶劑，限制了幾丁質的應用（。幾丁質脫乙酰后形成殼聚 糖，化學名稱為聚葡萄糖胺（1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖。殼聚糖溶于酸性及中性水溶液，具有 良好的生物相容性和生物可降解性，廣泛應用于醫藥、食品、化工、化妝品、水處理、金屬提 取及回收、生化和生物醫學工程等諸多領域(Pradip Kumar Dutta.Chitin and Chitosan for Regenerative Medicine[M].Springer India,2016)。
[0003] 目前，殼聚糖的工業生產是以幾丁質為原料采用濃堿熱化學法生產，此法不僅污 染嚴重，而且程度不易控制，導致出現各種分子量范圍的產品。采用酶法脫乙酰反應溫和、 環境友好，可以制備出高質量的殼聚糖。幾丁質脫乙酰基酶(E.C.3.2.1.41)能將幾丁質的 乙酰基直接脫除生成殼聚糖，但是對幾丁質分子的主鏈不發生降解，與特定酶結合使用還 可以制備具有特定乙酰基位置的產物（Yong Zhao，Ro_Dong Park and Riccardo A.A.Muzzarelli.Chitin deacetylases:properties and applications[J].Mar.Drugs 2010,8:24-46)。
[0004] 近十幾年來，隨著分子生物學與工業微生物研究的快速發展，研究者開始采用基 因工程手段構建重組菌，以期實現幾丁質脫乙酰基酶高效生產。目前，已相繼出現了利用 Escherichia coli、Bacillus subtilis和Pichia pastoris等作為宿主表達不同來源幾丁 質脫乙酰基酶基因的報道。盡管表達量較高，但是酶的催化效率等酶學特性還有待進一步 改進。我國對幾丁質脫乙酰基酶的研究主要集中在菌種選育、酶的純化、表達和酶學性質、 發酵工藝的改良方面，尚缺催化效率較高的幾丁質脫乙酰基酶。
【發明內容】
[0005] 發明要解決的技術問題：
[0006] 本發明要解決的第一個技術問題是提供一種催化活性提高的幾丁質脫乙酰基酶 突變體。
[0007] 所述突變體是以氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的幾丁質脫乙酰基酶(野生型）為 基礎，將第52位纈氨酸V突變為甘氨酸G，第66位的脯氨酸P點突變為絲氨酸S。
[0008] 本發明要解決的第二個技術問題是提供構確定突變氨基酸的方法，是通過模擬 Salinispora arenicola CAD三級結構，發現第52位繳氨酸和第66位的脯氨酸都位于鏈接 催化活性中心的無規卷曲結構中，突變后有望改變催化結構域，并改變底物結合能力。
[0009] 本發明要解決的第三個技術問題是提供構建所述幾丁質脫乙酰基酶突變體的方 法，是通過設計引物對編碼幾丁質脫乙酰基酶的基因進行定點突變后表達。
[0010]所述構建方法，以含有幾丁質脫乙酰基酶質粒pEtac-HiS6-cad為模板，設計引物 進行突變并將突變后的質粒轉化進入E.coli DH5a進行擴增，然后以E.coli BL21(DE3)表 達含突變基因的重組質粒，得到活性提高的突變體。
[0011]所述用于定點突變的引物是：
[0012] cadV52G primerlATGGTGGCCACACCTGGCGGGTGTGG
[0013] cadV52G primer2CCACACCCGCCAGGTGTGGCCACCAT
[0014] cadP66S primer1ATCGCGTTGACCTTCGACGACGGACCCAA
[0015] cadP66S primer2TTGGGTCCGTCGTCGAAGGTCAACGCGAT
[0016] 本發明要解決的第四個技術問題是提供應用基因工程菌發酵生產所述幾丁質脫 乙酰基酶突變體的方法，是將含有編碼突變幾丁質脫乙酰基酶的基因的重組菌E.coli BL21 (DE3) (pEtaC-HiS6-cad)活化培養后接種到含有100yg mL-1氨芐青霉素的發酵培養基 中，裝液量為30mL/250mL，于37 °C，200r min-1培養；菌體生長到0D600 = 0.6，加入終濃度 0.5mM IPTG，30°C，誘導發酵24h。所用培養基組成:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。
[0017] 本發明提供的一種催化活性提高的幾丁質脫乙酰基酶突變體，是將氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示的幾丁質脫乙酰基酶的第52位纈氨酸V突變為甘氨酸G，第66位的脯氨酸P 點突變為絲氨酸S。
[0018] 上述突變體的基因的編碼也屬于本發明的保護范圍之內。
[0019]攜帶上述突變體的基因的載體或細胞也屬于本發明的保護范圍之內。
[0020] 根據本發明的另一方面，提供了一種獲得上述幾丁質脫乙酰基酶突變體的方法， 是通過設計引物對編碼幾丁質脫乙酰基酶的基因進行定點突變后表達。是以質粒pEtac-His 6-cad為模板設計引物進行突變并將突變后的質粒轉化進入E.coli DH5a進行擴增，然 后以E.coli BL21(DE3)表達含突變基因的重組質粒，得到活性性增強的幾丁質脫乙酰基酶 突變體。
[0021] 根據本發明的另一方面，提供了應用基因工程菌發酵生產上述幾丁質脫乙酰基酶 突變體的方法，是將含有編碼突變幾丁質脫乙酰基酶的基因的重組菌E.coli BL21(DE3) (pEtac-His6-cadm)活化培養后接種到含有100yg mL-1氨節青霉素的發酵培養基中，所用 培養基組成為胰蛋白胨l〇g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7 · 0。裝液量為30mL/250mL， 于37°C，200r min-1培養;菌體生長到0D600 = 0 · 6，加入終濃度0 · 5mM IPTG，30°C，誘導發酵 24h。取發酵液，8000r/min離心10min收集菌體，再適量蒸餾水懸浮細胞，于冰水中超聲破碎 4min，12000r/min離心15min去除細胞碎片，上清液即為粗酶液。
[0022]本發明的有益效果為:本發明通過定點突變改造幾丁質脫乙酰基酶基因，使所編 碼的CAD催化活性增加;突變酶酶的比活力是野生型酶的5.33倍。酶的其它催化特性基本不 變，本發明提供的幾丁質脫乙酰基酶更加適合工業化生產需求，滿足社會生產的要求。
【具體實施方式】
[0023] 重組幾丁質脫乙酰基酶純化：按照Ni-NTA Pur i f i cat ion System(美國 Invitrogen公司nvitrogen?K95001)說明書操作。細胞膜可溶性物直接上Ni-NTA柱，依次用 含不同濃度咪唑（50mmo 1 /1、1 OOmmo 1 /1、150mmo 1 /1、200mmo 1 /1)的洗脫液洗脫，收集洗脫 峰，同步收集樣品并進行酶活力與蛋白含量的測定。
[0024] 重組蛋白質含量測定：改良型Lowry法蛋白濃度測定試劑盒(上海生工，C504041- 1000)〇
[0025] 幾丁質脫乙酰基酶活力檢測：比色管中加入35°C預保溫的濃度為0.05m〇VL的pH 8.0的Tris-HCl緩沖溶液3mL、濃度為200mg//L的4-硝基乙酰苯胺溶液lmL、幾丁質脫乙酰酶 液lmL，在35°C下水浴反應15min后沸水浴終止酶促反應，用蒸餾水定容至10mL，混勻， 3000r/min離心10min，測定上清液在400nm處的吸光值(A400)。無活性的酶液為空白對照。 [0026]幾丁質脫乙酰基酶酶活單位定義：每小時幾丁質脫乙酰酶催化底物產生lyg對硝 基苯胺所需要的酶液的體積定義為一個酶活力單位。
[0027]以下通過實例進一步說明本發明
[0028] 實施實例1、突變表達質粒的構建及重組大腸桿菌的獲得
[0029] 根據野生型酶基因設計引物，并引入酶切位點，所用引物如下41:5'-CGGAATTCATGGCGCGTGGTGTCCGCAT-S]弓| 入 EcoR I 酶切位點）42:5^ CCAAGCTTCTATGCCGTGGCTTCACCGGA-3'（引入HindllI酶切位點）。以Sa 1 inispora arenico 1 a 基因組DNA為模板進行PCR，PCR反應體系為：ddH20 (17 · 5yL)，buf f er (2 · 5yL)，Mg2+(2 · 5yL)， (1抑^(0.541^，？1(0.541^，？2(0.541^，模板（141^，了39酶（0.241^。？0?程序：94°(：預變性 5min，然后 941€3〇8,541€4〇8,721€7〇8，循環35次；72°(：延伸51^11。擴增產物經1.0%瓊脂糖 凝膠電泳進行檢測后測序。將上述PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳、純化，與pMD18-T 連接后轉化E.coli DH5a，從陽性菌落中提取重組質粒pMD18-T-cacLpMD18-T-cad和表達載 體pEtac雙酶切后，1%的瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片段，將酶切后的膠回收產物以一定比 例（基因片段的摩爾量是載體的三倍)混合后16°C連接過夜。轉化DH5a，將重組菌株涂布于 含有50ug/mL的卡那霉素固體LB培養基內，37 °C倒置培養過夜，隨機挑選若干個菌落于含有 50ug/mL卡那霉素的液體LB培養基內，37 °C搖瓶培養過夜，提取質粒pEtac-hi s6-amy，測序 驗證后轉化E.coli BL21(DE3)。
[0030] 通過模擬Salinispora arenicola CAD三級結構，發現第52位繳氨酸和第66位的 脯氨酸都位于鏈接催化活性中心的無規卷曲結構中，突變后有望改變催化結構域，并改變 底物結合能力。以含有幾丁質脫乙酰基酶質粒pEtac-His6_cad為模板，設計引物進行突變 并將突變后的質粒轉化進入E.coli DH5a進行擴增，然后以E.coli BL21(DE3)表達含突變 基因的重組質粒，得到活性提高的突變體。。并將突變后的質粒轉化進入E. co 1 i DH5a進行 擴增，然后以E. co 1 i BL21 (DE3)表達含突變基因的重組質粒，得到活性提高的突變體。 [0031]所述用于定點突變的引物是：
[0032] cadV52G primerlATGGTGGCCACACCTGGCGGGTGTGG
[0033] cadV52G primer2CCACACCCGCCAGGTGTGGCCACCAT
[0034] cadP66S primerlATCGCGTTGACCTTCGACGACGGACCCAA
[0035] cadP66S primer2TTGGGTCCGTCGTCGAAGGTCAACGCGAT
[0036] PCR管中加入lOmmol/L MgC12 2.5yL，10XPCR buffer 5yL，2.5ymol/L dNTP 4μ L，Taq(5U/yl)0.25yL，上游引物和下游引物（10ymol/L)各lyL，模板DNAlyL，最后加雙蒸水 至50yL，混合后瞬間離心，置于PCR儀上95 °C變性5min，然后94°C變性40s，55 °C退火40s，72 °C延伸lmin,共35個循環，最后72°C延伸10min反應結束。
[0037] 擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測后測序。將上述PCR擴增產物經1.0% 瓊脂糖凝膠電泳、純化，并和表達載體pEtac雙酶切后，1 %的瓊脂糖凝膠電泳回收酶切片 段，將酶切后的膠回收產物以一定比例(基因片段的摩爾量是載體的三倍)混合后16°C連接 過夜。轉化DH5a，將重組菌株涂布于含有50ug/mL的卡那霉素固體LB培養基內，37°C倒置培 養過夜，隨機挑選若干個菌落于含有50ug/mL卡那霉素的液體LB培養基內，37 °C搖瓶培養過 夜，提取質粒pEtac-his6_amy，測序驗證后轉化E. coli BL21 (DE3)。
[0038] 實施實例2、突變表達載體的轉化
[0039]所用培養基組成:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0。將含有編 碼突變幾丁質脫乙酰基酶的基因的重組菌E.coli BL21(DE3)(pEtac-HiS6-cad)活化培養 后接種到含有l〇〇yg mL-Ι氨芐青霉素的發酵培養基中，裝液量為30mL/250mL，于37°C，200r min-1培養;菌體生長到0D600 = 0.6，加入終濃度0.5mM IPTG，30°C，誘導發酵24h。180r/min 誘導表達511。4°(：、1000(^/1^11冷凍離心51^11收集菌體。蒸餾水重懸菌體，以超聲波細胞粉碎 儀破碎菌體(200W，超3s，停7s，共超聲5min)，4°C，10000r/min離心20min，收集上清液作為 粗酶液。按照Ni-NTA Purification System(美國Invitrogen公司nvitrogen?K95001)說明 書一步純化重組酶。和野生型重組酶相比，突變后的比活力劑催化活性提高3.92倍。
[0040]以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡在本發明的精 神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種幾丁質脫乙酰基酶的突變體，其特征在于，是將氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示 的幾丁質脫乙酰基酶的第52位纈氨酸V突變為甘氨酸G，第66位的脯氨酸P點突變為絲氨酸 S02. 編碼權利要求1所述突變體的基因。3. 攜帶權利要求2所述基因的載體或細胞。4. 一種獲得權利要求1所述幾丁質脫乙酰基酶突變體的方法，是通過設計引物對編碼 幾丁質脫乙酰基酶的基因進行定點突變后表達。5. 根據權利要求4所述的方法，其特征在于，是以質粒pEtac-His6_cad為模板設計引物 進行突變并將突變后的質粒轉化進入E.coli DH5a進行擴增，然后以E.coli BL21(DE3)表 達含突變基因的重組質粒，得到活性性增強的幾丁質脫乙酰基酶突變體。6. 應用基因工程菌發酵生產權利要求1所述幾丁質脫乙酰基酶突變體的方法，是將含 有編碼突變幾丁質脫乙酰基酶的基因的重組菌E.coli BL21(DE3)(pEtaC-His6-Cadm)活化 培養后接種到含有l〇〇yg mL-1氨芐青霉素的發酵培養基中，所用培養基組成為胰蛋白胨 10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH7 · 0。裝液量為30mL/250mL，于37°C，200r min-1 培 養;菌體生長到0D600 = 0.6，加入終濃度0.5mM IPTG，30°C，誘導發酵24h。取發酵液，8000r/ min離心10min收集菌體，再適量蒸餾水懸浮細胞，于冰水中超聲破碎4min，12000r/min離心 15min去除細胞碎片，上清液即為粗酶液。
【文檔編號】C12N9/44GK105886487SQ201610438888
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年6月19日
【發明人】王松葉, 詹金明, 陳延靜, 陳進利, 趙艷凱
【申請人】江蘇澳新生物工程有限公司