專利名稱：昆蟲幾丁質合成酶1基因片段及其dsRNA和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域。具體涉及昆蟲幾丁質合成酶1基因片段及其dsRNA和 dsRNA致死害蟲中的應用。
背景技術：
農業害蟲為害是我國農業產量的重要制約因素，長期施用化學殺蟲劑導致一系列 問題1)昆蟲出現抗藥性，用藥劑量加大，防治成本提高；2)農藥殘留導致環境污染嚴重； 3)對非靶標生物有較大影響。現有生物殺蟲劑在害蟲防治中應用較廣，但殺蟲時間較長且 效果緩慢。RNA干擾(RNAi)是一種由雙鏈RNA分子引起的特異性轉錄后基因沉默現象，2006 年獲諾貝爾獎。RNAi的發現不僅為基因的功能研究提供了方法上的突破，同時也為人類疾 病治療和作物害蟲防治開辟了新的途徑。2007年，“Nature Biotechnology”雜志先后兩篇 論文報道了施用表達靶向害蟲重要致死基因V-ATPase A，CYP6AE14 and GSTl的dsRNA轉 基因植物作為一種控制病蟲害的新方法(Baum et al,2007 ；Mao et al，2007)。2008年， Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害蟲防治策略。基于RNA干擾技術的害蟲防治具有 如下優勢1)選擇對害蟲專一的基因進行干擾，對高等動物和人類是安全的；2)抗蟲具有 專一性，對非靶標生物無殺傷作用；3)對環境無毒無害。研究表明，RNA干擾技術能夠有效控制特殊的植物害蟲，在害蟲防治領域具有重要 的發展前景。而實現基于RNAi進行害蟲有效控制的關鍵是篩選對昆蟲高效致死的dsRNA。幾丁質合成和代謝是昆蟲等節肢動物特有的生物學現象，由于人類和其它高等動 物沒有幾丁質，因此昆蟲幾丁質合成系統已被公認為新型殺蟲劑作用的靶標。幾丁質合 成酶在昆蟲幾丁質合成的最后一步起著關鍵作用，采用RNA干擾技術，開展幾丁質合成酶 dsRNA在害蟲防治中的應用具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段，由基因片段合成的 dsRNA和dsRNA在致死害蟲中的應用。本發明提供的一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段1，其核苷酸序列是SEQ ID NO 1。是通過設計昆蟲幾丁質合成酶的簡并引物后，PCR擴增獲得，命名為OcCHSl，其長度為 312bp，編碼104個氨基酸。本發明提供的一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段2，其核苷酸序列是SEQ ID N0 2，是根據SEQ ID NO 1設計上游引物SEQ ID NO 3和下游引物SEQ ID NO :4，通過PCR擴 增獲得。進一步利用相關試劑盒合成dsRNA。dsRNA在致死害蟲中的應用注射dsRNA到昆蟲體腔，結果表明dsRNA可以特異 性地沉默幾丁質合成酶1基因的mRNA表達，昆蟲因蛻皮困難死亡。
圖1 :3齡中華稻蝗若蟲注射dsRNA后對昆蟲生長發育的影響。注射dsRNA的實驗 組出現蛻皮困難死亡的表型(1為注射dsGFP的對照組，2注射dsRNA的實驗組)。
具體實施例方式實施例1 中華稻蝗幾丁質合成酶1基因片段1的獲得1)PCR引物的設計根據已知昆蟲幾丁質合成酶的氨基酸保守序列，設計了如下簡并性引物上游引 物CHSlF 5' -GAYGGNGAYATHGAYTT-3，下游引物CHSlR 5' -TCYTCNCCYTGRTCRTA-3 ‘；所 有引物均由上海英濰捷基生物有限 公司合成。2)中華稻蝗總RNA的獲得選取大小一致雌雄各半中華稻蝗5齡若蟲的體表，四頭一組，冷凍于液氮中，待提 取RNA，提取RNA的具體操作步驟參照TaKaRa Trizol試劑盒。3)中華稻蝗第一鏈cDNA合成第一鏈cDNA 合成步驟參照 SMART RACE cDNA Amplification 試劑盒。4) PCR 擴增以上述第一鏈cDNA為模板，根據Taq多聚酶(TIANGEN)說明書進行PCR擴增，將 所擴增的片段進一步克隆、測序。5)序列分析利用Expasy網站中相關在線軟件和GENED0C、基因探索者等軟件分析所得序列， 在NCBI網站中使用BLAST功能進行序列同源性比對，確定所獲得的基因片段為中華稻蝗幾 丁質合成酶1基因片段1。實施例2 中華稻蝗幾丁質合成酶1基因片段2的獲得根據實施例1獲得的中華稻蝗幾丁質合成酶1基因片段1的核苷酸序列，采用 primerpremier5.0軟件設計特異性的引物，上游引物序列為SEQ ID NO :3，下游引物序列為 SEQ IDNO :4，所有引物均由上海英濰捷基生物有限公司合成。選取大小一致雌雄各半中華 稻蝗5齡若蟲，四頭一組，冷凍于液氮中，待提取RNA，具體操作步驟參照TaKaRa Trizol試 劑盒。M-MLV反轉錄酶將所提RNA反轉錄成第一鏈cDNA，以此為模板，PCR擴增獲得幾丁質 合成酶基因片段，Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System(Promega)試劑盒進行純化。實施例3 中華稻蝗幾丁質合成酶1基因片段2的dsRNA的獲得用實施例2獲得的幾丁質合成酶1基因片段2，按照T7RiboMAX Express RNAi System(Promega)試劑盒說明，體外轉錄合成dsRNA。得到的dsRNA用1. 5%的瓊脂糖凝膠 電泳檢測其單一性，用酶標儀(Molecular Devices SpectraMax 190，Menlo Park,CA,USA) 將其定量至終濃度為1 μ g/μ L。保存至_70°C備用。實施例4 幾丁質合成酶1基因片段2的dsRNA致死中華稻蝗實驗1)中華稻蝗幾丁質合成酶1基因片段2的dsRNA注射選取3齡第四天大小均一、健康狀況一致的若蟲用于注射上述合成的dsRNA。 25μ 1規格微量注射器用于注射，注射時不可用力過大，順著血液流動的方向，側腹部第2 至3腹節的連接處作為注射點，要避開氣門。注射dsRNA的量為3 μ g，并設置dsGFP (3 μ g)的對照組，實驗組和對照組各25頭。注射完畢后，將蟲子用IL的燒杯至于人工氣候箱中進行飼養(光照黑暗時間=14h 10h，溫度30士2°C，濕度60%)，給以新鮮小麥幼苗和適 當的光照，噴水保持濕度。2)注入dsRNA后中華稻蝗表型的觀察若蟲注射完畢后繼續飼養，并及時地觀察。注射dsRNA中華稻蝗實驗組有部分若蟲因蛻皮困難而死亡。3)注入dsRNA后中華稻蝗死亡情況的觀察注射dsRNA的中華稻蝗實驗組死亡率為80%。這與注射dsGFP的對照組(死亡率為0%)相比，致死效果明顯。
權利要求
一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段1，其核苷酸序列是SEQ ID NO1。
2.一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段2，其核苷酸序列是SEQ ID N0:2。
3.如權利要求2所述的一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段2合成的dsRNA。
4.如權利要求3所述的一種昆蟲幾丁質合成酶1基因片段2合成的dsRNA在致死害蟲 中的應用。
全文摘要
本發明提供一種昆蟲幾丁質合成酶1的基因片段及其dsRNA的應用，通過對中華稻蝗幾丁質合成酶1的克隆和測序，得到核苷酸序列為SEQ ID NO1的幾丁質合成酶基因1，從中選出序列為SEQ ID NO2的幾丁質合成酶基因片段，用于dsRNA的合成。將上述dsRNA注入昆蟲的體腔后，昆蟲因蛻皮困難死亡。為安全無公害的害蟲防治方法的研制提供新的途徑。
文檔編號C12N15/113GK101831444SQ20101016360
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月30日 優先權日2010年4月30日
發明者劉曉健, 張建珍, 楊美玲, 郭亞平, 馬恩波 申請人:山西大學