紅平紅球菌幾丁質脫乙酰基酶及其構建方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體的說是一種紅平紅球菌幾丁質脫乙酰基酶及 其構建方法和應用。
【背景技術】
[0002] 幾丁質（chitin)是由N-乙酰氨基葡萄糖以0-1，4糖苷鍵連接而成的多聚體，是 天然多糖中十分重要的一類，其數量僅次于世界上資源最豐富的纖維素，但其利用價值比 纖維素更高，是自然界中數量第二多的的含氮類有機化合物，被歐美學術界稱為世界第六 生命要素。很多類似于蝦蟹等節肢動物的外殼里都存在幾丁質；像昆蟲、動物體表及消化道 里也含有豐富的幾丁質。
[0003] 據估計，自然界中的幾丁質生物合成量超過1000億噸，而人類每年所需幾丁質的 量也高達3. 7X 104噸，主要是海洋動物產品加工的廢棄物。另外，海洋中產生的大量廢棄 物中，幾丁質將近一億噸，而且海洋生物圈中產生的幾丁質占全球幾丁質總量的絕大部分， 可以說是一種取之不盡的生物寶庫。
[0004] 而殼聚糖(脫乙酰甲殼素，chitosan)是幾丁質的一類最重要的衍生物，也是自然 存在的唯一一種堿性多糖，可以應用于食品、化妝品、紡織、醫療、印染、保健、廢水處理等許 多領域，其利用價值很高，是市場推廣和產品研發的有力組成部分。
[0005] 目前工業上生產殼聚糖普便采用強堿熱化學法，該方法生產殼聚糖存在較多的缺 陷和不足，主要包括以下幾方面：生產過程耗能大、消耗大量強堿，嚴重污染環境，不能獲得 質量均一、具有特定脫乙酰度的殼聚糖等。幾丁質脫乙酰酶能夠催化幾丁質生成殼聚糖，具 有工藝條件溫和、環境友好、產品質量高等優點。采用幾丁質脫乙酰酶生產殼聚糖則可以解 決強堿熱化學法制備殼寡糖的諸多缺陷和不足，生產出質量均一、性能穩定的殼聚糖，滿足 生物醫學等領域對殼聚糖的高質量要求。
【發明內容】
[0006] 本發明目的在于提供一種紅平紅球菌幾丁質脫乙酰基酶及其構建方法和應用。
[0007] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：
[0008] 一種紅平紅球菌幾丁質脫乙酰基酶，紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis HG05)幾丁質脫乙酰基酶（chitin deacetylase，CDA)氨基酸序列為SEQ ID NO. 2所示，或 者
[0009] 在SEQ ID NO. 2中限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或者幾個氨基 酸且仍具有幾丁質脫乙酰基酶活性的由SEQ ID N0. 2衍生出來的蛋白質。
[0010] 所述紅平紅球菌幾丁質脫乙酰基酶編碼的基因核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。
[0011] 紅平紅球菌幾丁質脫乙酰基酶的構建方法：
[0012] 1)構建 RhErCDA 重組表達載體質粒 pCT7-CHISP6H-RhErCDA ;
[0013] 2)將步驟1)所得重組表達載體質粒導入大腸桿菌宿主細胞（BL21 (DE3))，進行誘 導表達，獲得表達產物；
[0014] 3)以金屬螯合層析柱分離純化步驟2)所得到的重組蛋白，即SEQ ID N0. 2中氨基 酸所示的重組幾丁質脫乙酰基酶；或者
[0015] 在SEQ ID N0. 2中限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或者幾個氨基 酸且仍具有幾丁質脫乙酰基酶活性的由SEQ ID N0. 2衍生出來的蛋白質。
[0016] 所述步驟3)中以金屬螯合層析柱一步法純化獲得電泳純的SEQ ID N0. 2中氨基 酸所示的重組RhErCDA。
[0017] 紅平紅球菌幾丁質脫乙酰基酶（RhErCDA)的應用，所述重組RhErCDA可用于制備 殼聚糖。
[0018] 本發明所具有的優點：本發明獲得了紅平紅球菌幾丁質脫乙酰基酶RhErCDA基 因序列，并在大腸桿菌中實現其高效分泌表達以及一步法純化重組RhErCDA。所得重組 RhErCDA的脫乙酰基活性，為酶法制備殼聚糖工藝的開發與應用提供了基礎。具體的說本發 明重組RhErCDA的獲得對幾丁質資源的深度開發與高值化利用具有重要的理論意義和實 踐意義。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明實施例提供的RhErCDA基因推導的氨基酸序列特征。
[0020] 圖2為本發明實施例提供的誘導表達的重組RhErCDA酶解實驗結果，其中，A為未 涂布重組RhErCDA室溫放置7天后的4-硝基乙酰苯胺固體平板；B為涂布重組RhErCDA室 溫放置7天后的4-硝基乙酰苯胺固體平板。
[0021] 圖3為本發明實施例提供的分離純化的重組RhErCDA的SDS-PAGE分析結果圖，其 中，M為蛋白標準分子量；P為咪唑洗脫樣品。
【具體實施方式】
[0022] 下面實施例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限于此。
[0023] 實施例1 :紅平紅球菌幾丁質脫乙酰基酶基因的克隆
[0024] 以NCBI中提供的4個R. erythropolis全基因組序列中注釋為幾丁質脫乙酰基酶 (chitin deacetylase，CDA)的序列信息設計引物用于擴增R.erythropolis HG05的幾丁 質脫乙醜基酶基因。引物具體為：
[0025] RhErCDA-dF ：ATGGACCGCCGACGCTTCCTC
[0026] RhErCDA-dR : TCACGGCTTCAGATARACAT (R 代表 A/G)
[0027] 以菌體 R. erythropolis HG05 作為模板（R. erythropolis HG05 為紅平紅球菌 (Rhodococcus erythropolis),并利用響應面分析的方法對其產酶條件進行了優化（Sun YY，Zhang JQ, Wu SJ, Wang SJ. Statistical optimization for production of chitin deacetylase from Rhodococcus erythropolis HG05. Carbohydrate Polymers, http:// dx. doi. org/10. 1016/j. carbpol. 2013. 11. 010)〇 )〇
[0028] PCR 的反應體系為：模板 1 u L ;5u L10XPCR buffer，2u L dNTP(10mmol/L)，2u L 引物 RhErCDA-dF (10 u mol/L)，2 u L 引物 RhErCDA-dR (10 u mol/L)，1 U L Taq DNA 聚合酶 (5U/u L)，加 ddH20 補至體積 50 u L。PCR 反應條件：95t：預變性 5min ;95t：變性 30s，55DC 退火30s，72°C延伸2min，30個循環；72°C延伸lOmin。利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴 增產物進行電泳分析，將PCR產物切膠，利用瓊脂糖凝膠純化試劑盒回收，回收PCR產物連 接PMD19-T載體(按照使用說明書進行)，16°C連接30min。將連接產物（pMD19-RhErCDA)轉 化大腸桿菌DH5a感受態細胞，涂布含有l〇〇ii g/mL氨芐青霉素的LB固體平板，37°C培養 過夜，以M13-F/M13-R為引物對，利用PCR方法對LB平板上的單克隆進行檢測，將PCR檢測 陽性克隆搖囷后進彳丁 DNA測序。測序結果如SEQ ID NO. 1中喊基序列所不：
[0029] ATGGACCGCCGACGCTTCCTCAGTGCCCTCGCAGCAGCAACTCTGACCGGAACCGCCGCGGTGACCATG GGAACCGCTTGTTCGTCACGTTCGGTCGGCACGGCAATCGCCGCAGCCGACGAACCAACCGACCCCGTCCCGGTCCC GGATCTCCCGCCTGCCTTGTTGCCGCCTCCACCGCCGTCTGCCCGGGTGCCGCTGCCCGCCGGCGGATCGTTGACCG CGTTACCCGGCGGTGGGGATCTGTTTGCCCTGACGGTTGACGACGGAGCCAGCTCCGAAGTCGTGCGCCTCTACACA CAGTTCGCAAAAGACACCGGCATCCGTTTGACGTACTTCGTAAACGGGCAATACAACTCGTGGACCGAAAACGCCGG ACTTCTCAGACCGCTGGTCGAGAGCGGACAAATTCAGCTCGGCAATCACACCTAC