幾丁質結合蛋白cbp58及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種幾丁質結合蛋白CBP58及其編碼基 因和應用。
【背景技術】
[0002] 幾丁質（chitin)，俗稱甲殼素、甲殼質，由N-乙酰葡萄糖胺單體以β-1，4_糖苷鍵 連接起來的直鏈多聚物，是自然界中含量最豐富，海洋環境中僅次于纖維素的第二大可再 生資源。幾丁質廣泛存在于甲殼綱動物蝦蟹、昆蟲的甲殼，以及真菌（酵母，霉菌）、藻類、植 物的細胞壁中。據估測，海洋環境每年超過IO n噸幾丁質形成，其降解主要是通過產幾丁質 酶的微生物完成。
[0003] 微生物幾丁質降解系統主要由內切幾丁質酶（chitinase，EC 3. 2. 1. 14)、外切幾 丁質酶（chitinase，EC 3·2· 1. 14)、β_Ν_ 乙酰己糖胺酶（β-Ν-acetylhexosaminidase， EC 3.2.1.52)與幾丁質結合蛋白（chitin-binding protein, CBP)等組成。內切幾丁質酶 在高聚幾丁質鏈內隨機切割生成幾丁質寡糖（chitooligosaccharides, (GlcNAc)n, n>2); 外切幾丁質酶有兩種，分別從高聚幾丁質鏈的還原端和非還原端依次切割下（GlcNAc) 2; β-N-乙酰己糖胺酶將從非還原端將幾丁質寡糖切割成為GlcNAc。其中幾丁質結合蛋白 (chitin-binding protein, CBP)，起到分散幾丁質糖鏈束的作用，對于不溶多糖降解起著 決定性的作用。幾丁質結合蛋白是一類能與幾丁質特異結合的蛋白質，廣泛存在于各種微 生物、動物和植物中。但是目前人們對于假交替單胞菌及其幾丁質酶蛋白的認識還有限，現 有的一些幾丁質蛋白的生物活性及其表達仍不理想，還有一些幾丁質蛋白對活性存在條件 苛刻，制備、保存成本高，這些因素對于幾丁質蛋白的應用造成限制。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是提供一種具有高效抗病原真菌活性且制備方法簡單、 易保存的幾丁質結合蛋白CBP58及其編碼基因和應用。
[0005] 為解決上述問題，本發明采用的構思是：本發明以假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas sp.DL-6)菌株為研宄對象，克隆和表達分析了幾丁質蛋白的基因， 為農業領域抗真菌藥物研發的提供新的研宄方向，具有廣闊的應用價值。假交替單胞菌 (Pseudoalteromonas sp.DL-6)菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 保藏，保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期：2013年 12月13日，其保藏編號為CGMCC No. 8580。
[0006] 本發明的技術方案如下：一種幾丁質結合蛋白CBP58,具有如SEQ ID No. 1所示的 核苷酸序列。
[0007] -種如權利要求1所述的幾丁質結合蛋白CBP58的制備方法，以假交替單胞菌株 (Pseudoalteromonas sp. DL-6)基因組 DNA 為模板，以 CBP58-F 和 CBP58-R 引物對進行 PCR 擴增；所述引物為：上游引物 CBP58-F:5' -GGAATTCCATATGCATGGTTATATGGATAGCCCTAAAG-3' 下游引物 CBP58-R: 5 ' -CCGCTCGAGCAGTGTGGTCCATACATCGGCTTG-3 '。
[0008] 進一步的，上述幾丁質蛋白CBP58的編碼基因其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示， 由531個氨基酸組成。
[0009] 本發明的另一個目的是提供上述幾丁質結合蛋白CBP58的表達與純化方法，包括 以下步驟：
[0010] (1)堿基序列擴增：以PCR方法擴增如SEQ ID No. 1所示的DNA序列；
[0011] (2)構建大腸桿菌克隆載體pMD19-T-CBP58 :將PCR擴增的DNA序列和pMD19-T simple載體用同樣的限制性內切酶NdeI和XhoI進行雙酶切，酶切產物經回收純化，用 T4DNA連接酶連接純化的酶切產物，得到克隆載體pMD19-T-CBP58 ;
[0012] (3)構建大腸桿菌重組表達載體：將克隆載體pMD19-T-CBP58質粒轉化至E. coli DH5 α，得到陽性轉化子，用限制性內切酶NdeI和XhoI將CBP58基因片段從pMD19-T-CBP58 質粒上切下，連接到pET-23b表達載體上，轉化至Ε. coli BL21 (DE3)，通過菌落PCR、酶切篩 選鑒定陽性轉化子克隆，得到重組表達載體pET23b-CBP58 ;
[0013] (4)構建大腸桿菌重組表達菌株BL21 (DE3) -pET23b-CBP58 :將重組表達載體 pET23b-CBP58質粒轉化至E. coli BL21 (DE3)，挑選陽性轉化子克隆，得到重組表達菌株 BL21(DE3)-pET23b-CBP58 ；
[0014] (5)體外誘導表達：將重組表達菌株BL21 (DE3)-pET23b-CBP58接入含氨芐的LB 培養基中，于37°C過夜培養14h后，按1 %的接種量接種到含氨芐的LB培養基中，當OD6tltol 達到0. 6~0. 8,加入終濃度為0. 2mM的IPTG，于30°C，IOOrpm低溫誘導6h ;
[0015] (6)幾丁質結合蛋白CBP58的純化：體外誘導表達結束后，于4°C，5, OOOXg離心 5min收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體三次，再用PBS緩沖液重懸菌體；之后置于冰上超聲 破碎三次，每次30s，每次間隔lmin，最后于4°C，8, 000 X g離心20min，收集上清液，即為粗 蛋白，粗蛋白用Ni2+-NTA柱進行親和層析純化，得到幾丁質結合蛋白CBP58。
[0016] 本發明還請求保護上述幾丁質結合蛋白CBP58的新用途。
[0017] 所述的幾丁質結合蛋白CBP58在幾丁質結合中的應用。
[0018] 所述的幾丁質結合蛋白CBP58在抑制黑曲霉（Aspergillus niger)和蘋果樹腐爛 病（Cytospora mandshurica Miura)真菌中的應用。
[0019] 本發明的有益效果是：
[0020] 1、本發明首次從菌株假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp. DL-6)中克隆出幾丁 質蛋白CBP58的編碼基因，通過構建原核表達載體獲得了具有高活性的表達產物，制備過 程簡單，為幾丁質蛋白CBP58的后續研宄提供了簡便方法，而且生產成本低、易保存；
[0021] 2、本發明提供的幾丁質蛋白CBP58具有與幾丁質結合的功能，用于純化和輔助鑒 定幾丁質；
[0022] 3、本發明中幾丁質蛋白CBP58對于黑曲霉（Aspergillus niger)和蘋果樹腐爛病 (Cytospora mandshurica Miura)具有良好的抑制效果，具有潛在的生物防治功能，為農業 領域抗真菌藥物研發的提供新的研宄方向，具有廣闊的應用價值，將產生巨大的工業效益 和經濟價值。
【附圖說明】
[0023] 圖I. CBP58基因的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳檢測結果；
[0024] 圖2. CBP58蛋白的SDS-PGAE檢測結果；
[0025] 圖3. CBP58蛋白的純化；
[0026] 圖4.酶活標準曲線和標準曲線方程；
[0027] 圖5.掃描電子顯微鏡觀察CBP58蛋白結合α