一種全細胞生物催化制備手性(s)-乙偶姻的方法
【專利摘要】本發明公開了一種全細胞生物催化制備手性(S)?乙偶姻的方法，包括以下步驟：首先將丁二酮還原酶基因以及甲酸脫氫酶基因在大腸桿菌中進行共表達，得到重組大腸桿菌；然后以所述重組大腸桿菌休止細胞為全細胞生物催化劑，丁二酮為底物，甲酸或甲酸鹽為輔酶NADH再生的氫供體，在水相中不對稱還原反應生成(S)?乙偶姻。本發明利用細胞本身完整的輔酶再生系統，只需要添加適量的甲酸或甲酸鹽作為氫供體，提高菌體的轉化能力，不需要添加昂貴的輔酶NADH，(S)?乙偶姻產量可高達46.1 g/L，工藝簡單高效，生產成本低，解決了傳統生物轉化效率低以及成本高的問題，具有極高的經濟價值，適于規模化商業應用。
【專利說明】
一種全細胞生物催化制備手性(S)-乙偶姻的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物化工領域，具體涉及一種全細胞生物催化劑制備手性(s)-乙偶姻 的方法。
【背景技術】
[0002] 乙偶姻(acetoin)具有明顯的奶酪香、脂香特征，天然地存在于玉米、葡萄、蘋果、 草莓、黃油、干酪、酒類、可可等各類食品中，國家標準GB2760-86規定其為允許添加食用的 食品香料。乙偶姻主要用于奶油、乳品、咖啡、酸奶等香料的生產。此外，乙偶姻是一種重要 的化學合成中間體，美國能源部將乙偶姻列為30種優先開發利用的平臺化合物之一，可廣 泛應用于食品、制藥、化工等領域。乙偶姻存在（S)-乙偶姻和(R)-乙偶姻兩種旋光異構體， 天然微生物發酵產生的都是（S)-乙偶姻和(R)-乙偶姻的旋光異構體混合物。手性乙偶姻 (即單一構型的旋光異構體）除了具有旋光異構體混合物上述應用之外，還具有特殊的用 途，例如用于合成手性藥物和液晶復合材料【Lett. Appl.Microbiol.，2013,57:274-281; Bioresource Techno1.,2013,137:111-115；Bioresource Technol·，2011，10741-10744; PLoS ONE,2010,5:e8860；Crit.Rev.Microbiol.,2007,33,127-140；Biotechno1.Adv., 2011，29,351-364】。
[0003] 手性乙偶姻的生產方法主要分為兩類:化學法與生物法。化學法合成過程繁瑣，最 后還需要進行工藝復雜的手性拆分，存在成本高、收率低、光學純度低、高能耗、高污染的問 題，且原料來源于不可再生的化石資源一一石油，原料來源受到限制。生物法是一種十分具 有發展前景的環境友好合成方法，近年來受到了越來越多的關注。然而，常規生物發酵法獲 得的都是旋光異構體混合物，手性拆分成本較高，而純酶催化法需要破碎細胞和分離純化 酶，而且需要加入昂貴的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(輔酶NADPH)或者還原型煙酰 胺腺嘌呤二核苷酸(輔酶NADH)，成本較高。
[0004] 全細胞生物催化的本質是利用細胞內的酶進行催化，綜合了發酵法和酶法催化這 兩種技術的優點，并克服了發酵法和酶法存在的諸多缺點，具有高立體選擇性，不需要添加 外源性輔酶、破碎細胞和分離純化酶，因此近年來更多的被應用于高值化合物合成。2013 年，Gao等在大腸桿菌中表達Gluconobacter oxydans的幾基還原酶和Bacillus Subtills 的葡萄糖脫氫酶，利用純化后的羧基還原酶和葡萄糖脫氫酶進行催化反應，當添加輔酶 NADPH時，（S)-乙偶姻產量為 12 · 2g/L【Bioresource Technology; 2013，（ 137): 111-115】；該 研究使用的是純酶作為催化劑，沒有使用全細胞催化系統。2014年，謝能中等公開了利用輔 酶再生系統，構建丁二酮還原酶和葡萄糖脫氫酶基因共表達系統生產（S)-乙偶姻的方法， 具體是將 Paenibacillus polymyxa的丁二酮還原酶基因（dar)和 Bacillus subtil is的葡 萄糖脫氫酶基因（gdh)在大腸桿菌中共表達，并以此重組大腸桿菌休止細胞為生物催化劑， 以丁二酮和葡萄糖為底物，生產手性(S)-乙偶姻【中國專利申請CN104087601A】。該發明工 藝簡單高效，（S)-乙偶姻的光學純度高，但產量還是偏低，僅28g/L。
[0005] 經過廣泛的文獻和專利檢索，我們發現迄今為止尚未有同時將丁二酮還原酶基因 和甲酸脫氫酶基因導入大腸桿菌中進行共表達，并以此重組菌株制備全細胞催化劑實現
[5] -乙偶姻合成與輔酶NADH再生相偶聯的報道。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是，在現有技術的基礎上，優化還原酶和脫氫酶的共 表達系統的組成，提高輔酶再生能力，在較高的光學純度下，顯著提高（S)_乙偶姻的產量， 并保持工藝簡單高效的特點，從而使成本大幅降低。
[0007] 本發明提出了一種引入甲酸脫氫酶協同丁二酮還原酶共表達生產（S)-乙偶姻的 新方法，技術方案具體是:一種全細胞生物催化劑制備手性(S)-乙偶姻的方法，首先將丁二 酮還原酶基因和甲酸脫氫酶基因導入大腸桿菌中進行共表達，得到重組大腸桿菌;然后以 所述重組大腸桿菌休止細胞為全細胞生物催化劑，丁二酮為底物，甲酸或甲酸鹽為輔酶 NADH再生的氫供體，在水相中不對稱還原反應生成（S)-乙偶姻，實現手性(S)-乙偶姻的高 效低成本合成。
[0008] 本發明是利用丁二酮還原酶可以催化丁二酮不對稱還原生成手性(S)-乙偶姻，以 及甲酸脫氫酶能夠實現胞內輔酶NADH再生的性質，將丁二酮還原酶基因和甲酸脫氫酶基因 導入大腸桿菌中進行共表達，使重組大腸桿菌的休止細胞具有同步還原丁二酮和再生輔酶 NADH的能力，并將其作為全細胞催化劑實現手性(S)-乙偶姻的高效低成本生產。
[0009] 其中，所述丁二酮還原酶基因可來源于腸桿菌屬（Enterobacter)、紅球菌屬 (Rhodococcus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、類芽抱桿菌(Paenibacillus)、芽抱桿菌屬 (Bacillus)和沙雷菌屬（Serratia);所述甲酸脫氫酶基因可來源于酵母屬 (Saccharomyces )、假單胞菌屬（Pseudomonas )、畢赤酵母屬（Pichia)和假絲酵母屬 (Candida)〇
[0010] 進一步的，所述丁二酮還原酶基因來源菌株優選Enterobacter cloacae、 Rhodococcus erythropolis或Klebsiella pneumoniae ;甲酸脫氫酶基因來源菌株優選 Saccharomyces cerevisiae。
[0011] 進一步，所述甲酸脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述丁二酮還原 酶基因的核苷酸序列如SEQIDN0.3、SEQIDN0.4或SEQIDN0.5所示。
[0012] 上述的重組大腸桿菌是采用常規（參考科學出版社出版的《精編分子生物學指 南》）的方法將丁二酮還原酶基因和甲酸脫氫酶基因同時插入表達質粒并轉化到大腸桿菌 (優選大腸桿菌E.coli BL21 (DE3))中，然后經篩選獲得。
[0013]所述用于構建含丁二酮還原酶基因的大腸桿菌表達載體的出發載體可以是pET-22b、pET-28a、pET-32、pETDuet-l或pTrc99a。重組大腸桿菌含有異源的丁二酮還原酶和甲 酸脫氫酶基因，為革蘭氏陰性菌，需氧或兼性厭氧生長，較佳培養溫度為37 °C，其休止細胞 可用于催化丁二酮生產手性(S)-乙偶姻。
[0014] 更具體的，本發明所述全細胞生物催化制備手性(s)-乙偶姻的方法，包含以下步 驟：
[0015] (1)重組大腸桿菌:將丁二酮還原酶基因和甲酸脫氫酶基因在大腸桿菌中進行共 表達，得到重組大腸桿菌；
[0016] (2)平板培養:將步驟(1)所得的重組大腸桿菌劃線到含有瓊脂和篩選抗生素的LB 平板培養基上，37 °C過夜培養；
[0017] (3)種子培養:在超凈臺用牙簽挑取步驟(2)平板上的一個單菌落，然后接種到含 有篩選抗生素的LB液體培養基中，37 °C培養6~12h;
[0018] (4)誘導培養:在無菌條件下，取步驟(3)所得的種子培養液接種到含有篩選抗生 素的LB液體培養基中，25~40°C培養1~5h，然后再加入終濃度為0.1~2mM的IPTG，16~30 °C誘導10~20h，得到誘導培養物；
[0019] (5)收集菌體:將步驟(4)所得的誘導培養物于轉速為5,000~8,000印111的條件下 離心5~15min，分離得到菌體沉淀;將所述菌體沉淀用生理鹽水洗滌2~3遍，然后懸浮于pH =6~8的緩沖液中，得到重組大腸桿菌全細胞生物催化劑；
[0020] (6)轉化反應制備手性(S)-乙偶姻:取步驟(5)得到的細胞干重濃度為1~20g/L的 重組大腸桿菌全細胞生物催化劑，在16~42°C、pH=6~9,50~200rpm條件下對底物進行轉 化;所述底物為丁二酮，其轉化初始濃度為5~25g/L，同時加入與底物丁二酮同等摩爾濃度 的甲酸或甲酸鹽以補充反應所需輔酶NADH的消耗;整個轉化反應過程中，通過間隔補料使 反應體系中的丁二酮濃度維持在5~25g/L之間，甲酸或甲酸鹽濃度維持與丁二酮相同的摩 爾濃度，當（S)-乙偶姻的濃度不再增加時，停止轉化。
[0021] 其中，上述步驟(2)~（4)中所述的LB培養基配方為：10g/L蛋白胨，5g/L酵母粉， 10g/L NaCl，LB固體培養基包含15g/L瓊脂，121°C條件下滅菌15min。
[0022 ]步驟(5)所述緩沖液為磷酸鉀緩沖液。
[0023] 步驟(6)所述重組大腸桿菌全細胞生物催化劑的細胞干重濃度為3~15g/L，轉化 反應溫度為20~37°C;所述底物轉化初始濃度為10~20g/L，補料反應中維持底物濃度在10 ~20g/L之間。
[0024] 作為上述方法的進一步說明，所述甲酸鹽選自甲酸鈉、甲酸鉀。
[0025] 通過本發明方法，實現了在大腸桿菌中共表達丁二酮還原酶和甲酸脫氫酶，并以 此重組大腸桿菌休止細胞為全細胞生物催化劑，丁二酮為底物，甲酸或甲酸鹽為輔酶NADH 再生的氫供體，高效低成本的生產手性(S)-乙偶姻。
[0026]本發明具有以下優點：
[0027] (1)本發明調整了還原酶和脫氫酶的共表達系統的組成，提高了輔酶再生能力，提 供了一種優化的引入甲酸脫氫酶協同丁二酮還原酶共表達生產(S)-乙偶姻的新方法。 [0028] (2)本發明（S)-乙偶姻產量可達46. lg/L，相比葡萄糖酸脫氫酶和丁二酮還原酶共 表達方法28g/L的產量提高了64.2%，取得了顯著效果。
[0029] (3)本發明菌株要求的培養基簡單、成本低，利用全細胞作為生物催化劑進行轉 化，不需要破碎細胞和分離純化酶，操作過程簡單，不需要添加昂貴的輔酶NADH，產物分離 方便，也不需要復雜的手性拆分步驟，技術水平領先，工藝簡單高效，生產成本低，具有極高 的技術經濟價值。
【附圖說明】
[0030] 圖1是標準品的氣相色譜圖譜。其中A為(R)-乙偶姻，B為(S)-乙偶姻，C為(S，S)-2， 3-丁一醇，D為(R，R) -2，3-丁 一醇，E為meso-2，3-丁 一醇。
[0031] 圖2是重組大腸桿菌全細胞催化合成(S)-乙偶姻的氣相色譜圖譜。
【具體實施方式】
[0032]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細說明，本實施例僅是對本發明作更 清楚的說明，而不是對本發明的限制。
[0033]以下實施例中所述的LB培養基配方為：10g/L蛋白胨，5gAJ孝母粉，10g/L NaCl， 121°C條件下滅菌15min。
[0034] 實施例1
[0035] 本實施通過對比試驗來證實本發明甲酸脫氫酶協同丁二酮還原酶共表達生產 (S)-乙偶姻的新方法在生產效率、產量、光學純度方面均優于葡萄糖脫氫酶共表達系統。 [0036] 1、重組大腸桿菌的制備
[0037] 將來源于5&(^11&1'01115^68 06代￥丨8丨&6的甲酸脫氫酶基因 €(111和來源13.811131：；[118 168的葡萄糖脫氫酶基因 gdh，經過密碼子優化后進行人工合成，并將其克隆到表達載體 pETDuet-1 上，獲得了重組質粒pETDuet-f dh和pETDuet-gdh。將來源于Enterobacter cloacae的丁二酮還原酶基因 bdh，經過密碼子優化后人工合成，并將其分別克隆到質粒 pETDuet-1、pETDuet-gdh 和pETDuet-f dh 上，獲得了重組質粒 pETDuet-bdh、pETDuet_bdh-gdh和pETDuet-bdh-fdh，將其轉化大腸桿菌E. coli BL21 (DE3)感受態細胞，可得到重組大 腸桿菌E · coli BL21 (DE3)/pETDuet_bdh、E · coli BL21 (DE3)/pETDuet_bdh-gdh和E · coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh。經人工合成密碼子優化的甲酸脫氫酶基因 fdh、葡萄糖脫氫 酶基因 gdh和丁二酮還原酶基因 bdh的核苷酸序列如SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID NO. 3所示。
[0038] 2、重組大腸桿菌休止細胞的制備，包括如下步驟：
[0039] (1)平板培養：將重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh、E.coli BL21 (DE3)/pETDuet-bdh-gdh和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh分別劃線到含有質量體積 比為1.8 %瓊脂和含有100yg/mL氨芐青霉素的LB平板培養基上，37 °C過夜培養8~12h;
[0040] (2)種子培養:在無菌的超凈臺條件下，用牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌落， 然后接種到20mL的含有100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C培養6~12h;
[0041] (3)誘導培養:在無菌條件下，取步驟(2)所得的液體種子以2%的接種量接種到含 有100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 °C培養2h，然后再加入終濃度為0.5mM的 IPTG，16°C誘導10h，停止培養，得到誘導培養物；
[0042] (4)收集菌體:將步驟(3)培養得到的誘導培養物于轉速為8，000rpm的條件下離心 5min，分離得到菌體沉淀;將所得菌體沉淀用生理鹽水洗滌2遍，然后懸浮于pH=7.0的磷酸 鉀緩沖液中，得到重組大腸桿菌休止細胞，置于4°C的冰箱中保藏或者直接使用。
[0043] 3、生物催化合成手性(S)-乙偶姻
[0044] (1)取上述細胞干重濃度為4g/L的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh 和E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-gdh休止細胞分別作為全細胞生物催化劑，在溫度為30 °C、pH = 7.0的條件下，180rpm搖床震蕩，對底物進行轉化;所述底物為丁二酮，其轉化初始 濃度為15g/L，同時加入與底物丁二酮等摩爾濃度的葡萄糖以提供反應所需輔酶NADH的消 耗；
[0045] (2)取上述細胞干重濃度為4g/L的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet- bdh-fdh休止細胞作為全細胞生物催化劑，在溫度為30°C、pH = 7.0的條件下，180rpm搖床震 蕩，對底物進行轉化;所述底物為丁二酮，其轉化初始濃度為15g/L，同時加入與底物丁二酮 等摩爾濃度的甲酸鈉以提供反應所需輔酶NADH的消耗。
[0046] 待反應完全后，對轉化液上清進行氣相色譜分析測定(S)-乙偶姻的濃度及光學純 度。（S)-乙偶姻光學純度= [S]/([S] + [R])X100%。
[0047] 結果如表1所示，E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh單基因表達，由于沒有輔酶再生 系統持續提供NADH，（S)_乙偶姻的產量極低，僅 1.59g/L;E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-gdh與E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh相比較，后者不但在反應時間上縮短一半，（S)-乙偶姻產量提高近一倍，（S)_乙偶姻光學純度也大幅提高。由此證實了本發明引入的甲酸 脫氫酶協同丁二酮還原酶共表達生產（S)-乙偶姻的新方法在生產效率、產量、光學純度方 面均優于葡萄糖脫氫酶共表達系統。
[0048] 表l:E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh、E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-gdh和 E. co 1 i BL21 (DE3) /pETDuet-bdh-fdh作為全細胞催化劑催化合成手性(S)-乙偶姻
[0049]
[0050] 實施例2
[0051 ] 1、重組大腸桿菌的制備
[0052] 將來源于Rhodococcus erythropolis的丁二酮還原酶基因 adr，經過密碼子優化 后人工合成，并將其克隆到實施例1所得重組質粒pETDuet-fdh上，獲得了重組質粒 pETDuet-adr-fdh，將其轉化大腸桿菌E. col i BL21 (DE3)感受態細胞，得到重組大腸桿菌 E.coli BL21 (DE3)/pETDuet-adr-fdh。人工合成密碼子優化的Rhodococcus erythropolis 丁二酮還原酶基因 adr的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0053] 2、重組大腸桿菌休止細胞的制備，包括如下步驟：
[0054] (1)平板培養：將重組大腸桿菌E.coli BL21 (DE3)/pETDuet-adr-fdh劃線到含有 質量體積比為1.8%瓊脂和含有100yg/mL氨芐青霉素的LB平板培養基上，37°C過夜培養；
[0055] (2)種子培養:在無菌的超凈臺條件下，用牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌落， 然后接種到20mL的含有100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C培養10h;
[0056] (3)誘導培養:在無菌條件下，取步驟(2)所得的液體種子以2%的接種量接種到含 有100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C培養2.5h，然后再加入終濃度為0.5mM的 IPTG，16°C誘導10h，停止培養，得到誘導培養物；
[0057] (4)收集菌體:將步驟(3)培養得到的誘導培養物于轉速為8，000rpm的條件下離心 5min，分離得到菌體沉淀;將所得菌體沉淀用生理鹽水洗滌2遍，然后懸浮于pH=7.0的磷酸 鉀緩沖液中，得到重組大腸桿菌休止細胞，置于4°C的冰箱中保藏或者直接使用。
[0058] 3、生物催化合成手性(S)-乙偶姻
[0059] 取上述獲得的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-adr-fdh休止細胞作為 全細胞生物催化劑，在6g/L細胞干重、30°C、pH=7.0~9.0條件下，180rpm搖床震蕩，對底物 進行轉化;所述底物為丁二酮，其轉化初始濃度為15g/L，同時加入等摩爾濃度的甲酸鈉以 提供反應所需輔酶NADH的消耗;整個轉化反應過程中，每隔2h取樣，氣相色譜法監測轉化液 上清中丁二酮的濃度，間隔補加丁二酮和甲酸鈉，使反應體系中丁二酮濃度維持在10~ 20g/L之間，甲酸鈉濃度維持與丁二酮相同的摩爾濃度;同時氣相色譜分析測定轉化液上清 中（S)-乙偶姻的濃度及光學純度，直到(S)-乙偶姻濃度不再增加，停止轉化。
[0060] 以下實施例3~7的制備過程與實施例2基本一致，區別在于原料配比用量和工藝 參數的不同，因此，僅用列表說明，制備過程不再累述。
[0061]
[0062]停止轉化后，通過氣相色譜分析測定實施例2~7轉化液上清(S)-乙偶姻的最終濃 度及光學純度。結果列表如下：
[0064] 實施例8
[0065] 1、重組大腸桿菌的制備
[0066] 將來源于Saccharomyces cerevisiae的甲酸脫氫酶基因 fdh經過密碼子優化后進 行人工合成，并將其克隆到表達載體pETDuet-Ι上，獲得了重組質粒pETDuet-fdh。將來源于 Enterobacter cloacae的丁二酮還原酶基因 bdh，經過密碼子優化后人工合成，并將其克隆 到質粒pETDuet-fdh上，獲得了重組質粒pETDuet-bdh-fdh，然后將其轉化大腸桿菌E·coli BL21(DE3)感受態細胞，可得到重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh-fdh。經人工 合成密碼子優化的甲酸脫氫酶基因 fdh、丁二酮還原酶基因 bdh的核苷酸序列如SEQ ID N0.1、SEQIDN0.3K*。
[0067] 2、重組大腸桿菌休止細胞的制備，包括如下步驟：
[0068] (1)平板培養:將上述制備而得的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh- fdh劃線到含有質量體積比為1.8 %瓊脂和含有100yg/mL氨芐青霉素的LB平板培養基上，37 °C過夜培養；
[0069] (2)種子培養:在無菌的超凈臺條件下，用牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌落， 然后接種到20mL的含有100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C培養10h;
[0070] (3)誘導培養:在無菌條件下，取步驟(2)所得的液體種子以2%的接種量接種到含 有100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 °C培養2h，然后再加入終濃度為0.5mM的 IPTG，20 °C誘導15h，停止培養，得到誘導培養物；
[0071] (4)收集菌體:將步驟(3)培養得到的誘導培養物于轉速為8,000rpm的條件下離心 5min，分離得到菌體沉淀;將所得菌體沉淀用生理鹽水洗滌2~3遍，然后懸浮于pH=7.0的 磷酸鉀緩沖液中，得到重組大腸桿菌休止細胞，置于4°C的冰箱中保藏或者直接使用。
[0072] 3、生物催化合成手性(S)-乙偶姻
[0073] 取上述獲得的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-bdh_fdh休止細胞作為 全細胞生物催化劑，在6g/L細胞干重、33°C、pH=6.5~8.5條件下，180rpm搖床震蕩，對底物 進行轉化;所述底物為丁二酮，其轉化初始濃度為15g/L，同時加入等摩爾濃度的甲酸鈉以 提供反應所需輔酶NADH的消耗;整個轉化反應過程中，每隔2h取樣，氣相色譜法監測轉化液 上清中丁二酮的濃度，間隔補加丁二酮和甲酸鈉，使反應體系中丁二酮濃度維持在10~ 20g/L之間，甲酸鈉濃度維持與丁二酮相同的摩爾濃度;同時氣相色譜分析測定轉化液上清 中（S)-乙偶姻的濃度及光學純度直到(S)-乙偶姻濃度不再增加，停止轉化。
[0074]以下實施例9~12的制備過程與實施例8基本一致，區別在于表達載體、原料配比 用量和工藝參數的不同，因此，僅用列表說明，制備過程不再累述。
[0076]停止轉化后，通過氣相色譜分析測定實施例8~12轉化液上清（S)_乙偶姻的最終 濃度及光學純度。結果列表如下：
[0078] 實施例14
[0079] 1、重組大腸桿菌的制備
[0080] 將來源于Saccharomyces cerevisiae的甲酸脫氫酶基因 fdh經過密碼子優化后進 行人工合成，并將其克隆到表達載體pETDuet-Ι上，獲得了重組質粒pETDuet-fdh。將來源于 Klebsiella pneumonia的丁二酮還原酶基因 budc，經過密碼子優化后人工合成，并將其克 隆到質粒pETDuet-fdh上，獲得了重組質粒pETDuet-budc-fdh，然后將其轉化大腸桿菌 E.coli BL21(DE3)感受態細胞，可得到重組大腸桿菌E.coli BI^UDESVpETDuet-budc-fdh。經人工合成密碼子優化的甲酸脫氫酶基因 fdh、丁二酮還原酶基因 budc 的核苷酸序列 如SEQIDN0·1、SEQIDN0·5所示。
[0081 ] 2、重組大腸桿菌休止細胞的制備，包括如下步驟：
[0082] (l)平板培養：將上述制備而得的重組大腸桿菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-budc-fdh劃線到含有質量體積比為1.8%瓊脂和含有10(^ 8/1^氨芐青霉素的1^平板培養基 上，37 °C過夜培養；
[0083] (2)種子培養:在無菌的超凈臺條件下，用牙簽挑取步驟(1)平板上的一個單菌落， 然后接種到20mL的含有100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C培養10h;
[0084] (3)誘導培養:在無菌條件下，取步驟(2)所得的液體種子以2%的接種量接種到含 有100yg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 °C培養3h，然后再加入終濃度為0.8mM的 IPTG，25 °C誘導12h，停止培養，得到誘導培養物；
[0085] (4)收集菌體:將步驟(3)培養得到的誘導培養物于轉速為8,000rpm的條件下離心 5min，分離得到菌體沉淀;將所得菌體沉淀用生理鹽水洗滌2~3遍，然后懸浮于pH=7.0的 磷酸鉀緩沖液中，得到重組大腸桿菌休止細胞，置于4°C的冰箱中保藏或者直接使用。
[0086] 3、生物催化合成手性(S)-乙偶姻
[0087] 取上述獲得的重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pETDuet-budc_fdh休止細胞作為 全細胞生物催化劑，在l〇g/L細胞干重、33 °C、pH = 7.0~8.0條件下，150rpm搖床震蕩，對底 物進行轉化;所述底物為丁二酮，其轉化初始濃度為15g/L，同時加入等摩爾濃度的甲酸鈉 以提供反應所需輔酶NADH的消耗;整個轉化反應過程中，每隔2h取樣，氣相色譜法監測轉化 液上清中丁二酮的濃度，間隔補加丁二酮和甲酸鈉，使反應體系中丁二酮濃度維持在10~ 20g/L之間，甲酸鈉濃度維持與丁二酮相同的摩爾濃度;同時氣相色譜分析測定轉化液上清 中（S)-乙偶姻的濃度及光學純度直到(S)-乙偶姻濃度不再增加，停止轉化。
[0088] 以下實施例15~19的制備過程與實施例14基本一致，區別在于表達載體、原料配 比用量和工藝參數的不同，因此，僅用列表說明，制備過程不再累述。
[0090]停止轉化后，通過氣相色譜分析測定實施例14~19轉化液上清(S)_乙偶姻的最終 濃度及光學純度。結果列表如下：
【主權項】
1. 一種全細胞生物催化制備手性（幻-乙偶姻的方法，其特征在于，將丁二酮還原酶基 因和甲酸脫氫酶基因在大腸桿菌中進行共表達，得到重組大腸桿菌；以所述重組大腸桿菌 休止細胞為全細胞生物催化劑，丁二酮為底物，甲酸或甲酸鹽為輔酶NADH再生的氫供體，在 水相中不對稱還原反應生成（幻_乙偶姻。2. 如權利要求1所述的全細胞生物催化制備手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，所述 丁二酮還原酶基因來源菌株選自7?ieroAacier c_/oacae、7?Aoc/ococct/s erjiArOjOoiis或 /wet/fficMiae;所述甲酸脫氫酶基因來源菌株是?SaccAaroffijces cererisiae。3. 如權利要求1或2所述的全細胞生物催化制備手性（幻-乙偶姻的方法，其特征在于， 所述甲酸脫氫酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示;所述丁二酮還原酶基因的核苷酸 序列如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4或SEQ ID N0.5所示。4. 如權利要求3所述的全細胞生物催化制備手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，所述 用于構建含丁二酮還原酶基因的大腸桿菌表達載體的出發載體選自pET-22b、pET-28a、 pET_32、pETDuet_l或pTrc99a。5. 如權利要求1、2、4任一所述的全細胞生物催化制備手性（幻-乙偶姻的方法，其特征 在于，所述方法包含如下步驟： (1) 重組大腸桿菌:將丁二酮還原酶基因和甲酸脫氫酶基因在大腸桿菌中進行共表達， 得到重組大腸桿菌； (2) 平板培養:將步驟（1)所得的重組大腸桿菌劃線到含有瓊脂和篩選抗生素的LB平板 培養基上，37° C過夜培養； (3) 種子培養:在超凈臺用牙簽挑取步驟(2)平板上的一個單菌落，然后接種到含篩選 抗生素的LB液體培養基中，37°C培養6~12 h; (4) 誘導培養:在無菌條件下，取步驟(3)所得的種子培養液接種到含篩選抗生素的LB 液體培養基中，25~40°C培養1~5 h，然后再加入終濃度為0.1~2 mM的IPTG，16~30°C誘 導10~20 h，得到誘導培養物； (5) 收集菌體:將步驟(4)所得的誘導培養物于轉速為5,000~8,000印111的條件下離心 5~15 min，分離得到菌體沉淀;將所述菌體沉淀用生理鹽水洗滌2~3遍，然后懸浮于pH=6 ~8的緩沖液中，得到重組大腸桿菌全細胞生物催化劑； (6) 轉化反應制備手性（幻_乙偶姻：取步驟(5)得到的細胞干重濃度為1~20 g/L的重 組大腸桿菌全細胞生物催化劑，在16~42° C、pH=6~9，50~200 rpm條件下對底物進行轉 化;所述底物為丁二酮，其轉化初始濃度為5~25 g/L，同時加入與底物同等摩爾濃度的甲 酸或甲酸鹽以補充反應所需輔酶NADH的消耗;整個轉化反應過程中，通過間隔補料使反應 體系中的丁二酮濃度維持在5~25 g/L之間，甲酸或甲酸鹽濃度維持與丁二酮相同的摩爾 濃度，當（幻-乙偶姻的濃度不再增加時，停止轉化。6. 如權利要求5所述的全細胞生物催化制備手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，步驟 (5) 所述緩沖液為磷酸鉀緩沖液。7. 如權利要求5所述的全細胞生物催化制備手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，步驟 (6) 所述重組大腸桿菌全細胞生物催化劑的細胞干重濃度為3~15g/L，轉化反應溫度為20 ~37°C;所述底物轉化初始濃度為10~20 g/L，補料反應中維持底物濃度在10~20 g/L之 間。8.如權利要求5所述的全細胞生物催化制備手性（幻_乙偶姻的方法，其特征在于，所述 甲酸鹽選自甲酸鈉、甲酸鉀。
【文檔編號】C12P7/26GK105969812SQ201610541952
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年7月12日
【發明人】謝能中, 李檢秀, 黃日波, 黃艷燕, 杜奇石, 嚴少敏, 陳先銳, 劉祺霞
【申請人】廣西科學院