具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的應用及制備方法
【專利摘要】本發明涉及具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的應用及制備方法。所述白僵菌提取物在制備防治色素沉著和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制劑的應用；所述白僵菌提取物中的主要有效成分為6’-甲基-2’,4’-二羥基苯基-4-氧甲基-β-D-葡萄糖甙（6’-methyl-2’,4’-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β-D-glucopyranoside），含量5~99%；其活性特征在于：對酪氨酸酶的半數抑制濃度（IC50）為：37.6~638.5.μg/mL。具有酪氨酸酶抑制劑的白僵菌提取物用途廣泛，可作為日用化學品添加劑，起增白、抗黑化、抗老化、防治色素沉著和黑色素瘤等作用。
【專利說明】具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的應用及制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制品的提取制備和應用【技術領域】，涉及具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的應用及制備方法。
【背景技術】
[0002]白僵菌(Beauveria sp.)的分類:絲孢目(Hyphomycetales)叢梗孢科白僵菌屬(Beauveria Vuillemin)的真菌；該屬在我國常見的有三種，如:球孢白僵菌(Beauveriabassiana)、布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)和多形白僵菌(Beauveriaamorpha)等，是重要的昆蟲病原真菌，目前主要用來對害蟲進行生物防治。其中蠶在感染白僵菌后被稱為白僵蠶。白僵蠶在我國傳統中藥中的作用主要為“祛風解痙，化痰散結”。白僵蠶的主要活性成分被認為是草酸銨，但白僵菌本身尚無藥用報道。
[0003]抑制酪氨酸酶活性:酪氨酸酶兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，在黑色素合成過程中起關鍵作用。它能夠把單酚催化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促條件下形成最終的反應產物黑色素。酪氨酸酶抑制劑就是通過抑制酪氨酸酶活性從而抑制黑色素生成，因而可用來預防和治療色素沉著和黑色素瘤等，從而在醫藥、化妝品等領域有著廣闊的應用前景，被廣泛用于藥品及日用化學品等中。
【發明內容】
[0004]為尋找新型天然高效天然酪氨酸酶抑制劑和抗氧化劑，發明人通過對中國的100余株昆蟲病原真菌代謝物進行活性研究，發現了白僵菌的提取物具有很強的酪氨酸酶抑制活性。本發明旨在，提供具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的用途。
[0005]所述白僵菌提取 物在制備增白、防治色素沉著和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制劑的應用；
所述白僵菌提取物中的主要有效成分為6’ -甲基-2’，4’ - 二羥基苯基-4-氧甲基-β -D-葡萄糖式(6，-methyl-2，, 4，-dihydroxyphenyl-4-O-methyl- β -D-glucopyranoside)，含量5~99% ;其化學結構見下式:
【權利要求】
1.具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的應用，其特征在于:所述白僵菌提取物在制備增白、防治色素沉著和黑色素瘤的酪氨酸酶抑制劑的應用； 所述白僵菌提取物中的主要有效成分為6’ -甲基-2’，4’ - 二羥基苯基-4-氧甲基-β -D-葡萄糖式(6，-methyl_2，，-dihydroxyphenyl-4-O-methyl- β -D-glucopyranoside)，含量5~99% ;其化學結構見下式:
2.制備權利要求1所述的具有抑制酪氨酸酶活性的白僵菌提取物的方法，其特征在于:具體操作步驟如下: (1)白僵菌(Beauveriasp.)菌種選擇和培養所用的白僵菌(Beauveria sp.)為球孢白僵菌(Beauveria bassiana)或布氏白僵菌(Beauveria brongniartii)或多形白僵菌(Beauveriaamorpha)； 具體培養方法如下: (1.1)斜面菌種培養 將白僵菌菌株接種于薩氏(SDAY)斜面培養基，于20~30°C恒溫、培養4~7d，得到一級菌種； (1.2) 二級菌種培養 將一級菌種接種至液體搖瓶培養基培養， 液體搖瓶培養基:葡萄糖40g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，蒸餾水定容；在大于100ml三角瓶中加入30~50%三角瓶體積的液體培養基，每個三角瓶接種I~3支斜面菌種，接種后置于全溫振蕩培養箱，溫度20~30°C、轉速100~200rpm，培養3~7d，即得到二級菌種； (1.3)三級菌種培養 將二級菌種接種到大于等于10L的發酵罐，裝液量為罐體積的50~70%，接種量5~10%，通氣量按體積比1:1 (v/v)，壓力0.1MPa, 20~30°C恒溫通氣培養2~5天，得到三級菌種；發酵罐中的培養基同液體搖瓶培養基； (1.4)發酵罐發酵 將三級菌種壓入100L以上發酵罐，發酵罐的初始裝液量為按罐容積的50~70%裝液，接種量為裝液量的5~10%，通氣量按體積比1: l(v/v)，壓力0.1MPa, 20~30°C恒溫通氣培養5~15天，得到發酵物；發酵罐中的培養基同二級菌種培養基； (2)發酵物中有效成分的提取和精制 (2.1)預處理 將發酵物在轉速大于1000轉/分鐘條件下離心過濾；將上清液在低于100°C溫度條件下，濃縮到原體積的1/2~1/10，得到濃縮液； (2.2)去雜在濃縮液中按體積比加入I~4倍乙醇，于O~40°C條件下靜置沉淀5~24小時，然后在轉速大于1000轉/分鐘離心過濾；去沉淀；將上清在溫度小于100°C濃縮到原體積的1/2~1/10，得到濃縮脫醇液，同時回收乙醇； 將濃縮脫醇液按1:0.5~5的體積比，加入預處理劑，所述預處理劑為石油醚或己烷或輕汽油，混勻，萃取，去掉上層，下層的水相在溫度小于100°C濃縮原體積1/2~1/10倍，得到去雜濃縮液； (2.3)初步純化 在去雜濃縮液中，按1:0.5~5的體積比加入萃取劑，萃取劑為丁醇或丁醇和乙酸乙酯混合物，丁醇和乙酸乙酯混合物的體積比為:2-0.5:0.5-2 ;萃取后去掉水層；有機相部分在低于100°C溫度下濃縮到到原體積的1/2~1/10，將濃縮物在不高于170°C條件下干燥，得粗制產品；粗制產品的性狀:淺黃至棕色無定形粉末； 不同批次的粗制品對酪氨酸酶的半數抑制濃度IC5tl為278.4~638.5 μ g/ml ； 主要有效成分為6’ -甲基-2’，4’ - 二羥基苯基-4-氧甲基-β -D-葡萄糖甙(6’ -methyl_2，，4,-dihydroxyphenyl-4-O-methyl-β -D-glucopyranoside),含量 5 ~15% ;其化學結構見下式:
【文檔編號】A61K8/60GK103751030SQ201310672709
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年12月12日 優先權日:2013年12月12日
【發明者】陸瑞利, 胡豐林, 黃勃, 李增智 申請人:安徽農業大學