表達aa9家族多糖單加氧酶基因tlaa9?2的畢赤酵母工程菌株的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種表達AA9家族多糖單加氧酶基因TLAA9?2的畢赤酵母工程菌株，是通過RT?PCR方法從疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosus獲得糖苷水解酶基因TLAA9?2，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達載體pPICZαA中，然后將得到的糖苷水解酶基因TLAA9?2表達載體pPICZαA/TLAA9?2導入到畢赤酵母GS115中，再從中篩選出一種表達糖苷水解酶基因TLAA9?2的酵母工程菌GS?CT?9?1。該工程菌表達的糖苷水解酶TLAA9?2對內切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始內切酶N24的降解纖維素的活性提高1.2倍。CGMCC No.1238420160421
【專利說明】表達AA9家族多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的畢赤酵母工程菌株 (-)技術領域
[0001]本發明設及生物工程，具體地說是一種表達是疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosusAA9家族多糖單加氧酶基因化449-2的畢赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-CT-9-2。 (二)【背景技術】
[0002] 多糖單加氧酶（英語：Polysaccha;ride monooxygenases)，又稱多糖單氧酶）是一 種專口氧化裂解糖巧鍵，并產生多個纖維寡糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。 運類蛋白質在人類的產業上也有所應用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質能降解成 可用的小分子。多糖單加氧酶具有多個家族。疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosus 是一種廣泛分布于堆肥中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養基中50°C條件 下可W產生熱穩定的纖維素酶和AA9家族多糖單加氧酶。
[0003] 疏綿狀嗜熱絲抱菌產生的AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2具有氧化裂解纖維素的 作用，并且對該菌株產生的內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，可使其活性提 高1.2倍。多糖單加氧酶發揮其活性需要供電子體（抗壞血酸或CDH)的存在，經薄層層析 (化C)檢測產生多種纖維寡糖。該酶在缺乏底物的情況下可W產生過氧化氨，并且經飛行質 譜鑒定該酶氧化裂解打斷纖維素長鏈主要產物為纖維寡糖。 (H)
【發明內容】
[0004] 本發明從疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosus獲得多糖單加氧酶cDNA序 列全長，命名為TLAA9-2，TLAA9-2基因 DNA全長82化P，包括信號膚序列，起始密碼子和終止 密碼子，無內含子，編碼252個氨基酸。具有信號膚序列（l-22aaMKGSTTA化化化LASVTRTSA) 及30個0糖基化位點，有一個潛在的N糖基化位點。將TLAA9-2編碼的氨基酸序列在國際基因 庫中進行檢索，發現屬于多糖單加氧酶第AA9家族。
[000引構建重組表達質粒載體pPICZaA/TLAA9-2，利用電轉儀進行電擊轉化 Pichiapastoris GS115,在Zeocin培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽性轉化子，高濃度博來 霉素篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-CT-9-2。該工 程菌株接種于含BMGY培養基中，在28°C20化pm/min搖床培養6d后，多糖單加氧酶的表達量 為3.21mg/ml，分子量為45kDa，TLAA9-2最適溫度為50-55°C，在60 °C下是穩定的，處理60min 后仍有90%W上的酶活性；70°C處理30min后仍保持68%的活性；80°C處理30min后保持 23 %的活性;90°C處理30min活性幾乎完全喪失。
[0006] AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2在供電子體(抗壞血酸和CDH)和銅離子存在下能將 纖維素長鏈氧化裂解為不同的纖維寡糖，并且在缺乏底物的情況下可W產生過氧化氨，對 內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力 提高1.2倍。多糖單加氧酶第一個組氨酸具有重要作用，前端連有其他氨基酸會影響其活 性。不同的多糖單加氧酶氧化裂解纖維素長鏈發生在不同的連鍵位置，經飛行質譜鑒定 TLAA9-2氧化裂解纖維素長鏈主要產物為纖維寡糖。 (四）
【附圖說明】：
[0007] 圖1 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2的SDS-PAGE分析 [000引泳道1:低分子量蛋白標準
[0009] 泳道2:純化的AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2
[0010] 圖2 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2的最適溫度
[0011] 圖3 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2對內切纖維素酶N24活性的促進作用
[0012] 圖4 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-1氧化裂解纖維素薄層層析檢測及供電子體(抗 壞血酸)對AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-1活性的影響
[0013] 泳道1:標準纖維寡糖分子(M)
[0014] 泳道2:未加抗壞血酸的多糖單加氧酶TLAA9-UE)
[0015] 泳道3:添加抗壞血酸的多糖單加氧酶TLAA9-1化+Vc)
[0016] 圖5 AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-1酶解產物飛行質譜分析 (五)
【具體實施方式】
[0017] 實施例1:疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosusermophil皿的分離鑒定
[0018] (1)標本采集:從堆肥中采集。
[0019] (2)分離培養:將采集標本取0.5克放置在PDA平板上5(TC培養3天后，進行分離純 化。操作步驟參考Cooney and血erson( 1964)文獻。
[0020] (3)鑒定：參考Coon巧 and 血erson(1964)和LaTouche(1950)文獻。
[0021 ] 實施例2:多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的克隆
[0022] (1)疏綿狀嗜熱絲抱菌I'hermomyces lanuginosusermo地ilum總RNA的提取：參照 Trizol試劑盒說明。
[0023] (2)cDNA第一條鏈的合成：按照hkara公司的IMaRa RNA PCR kit(AMV)Ver3.0試 劑盒說明書進行：取1~化g總RNA，加腳ase Free d加 2〇至9 .扣L，將RNA樣品在75 °C變性 5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離屯、一下，在冰浴中依次加入W下各種成分： lOmmol/L dNTP MixUire 2化，10XRT Buffer(Mg2+)化L，25mmol/L MgCb化L，01igo d(T)- Adaptor Primer luL^RNase Inhibiter 0.5jiL，AMV Reverse Transcriptase ljiL(Final Volume 20化），將反應液混合后，室溫下放lOmin，然后42°C溫育60min，再煮沸5minW滅活 反轉錄酶。加入18化L DEPC處理的dd出0,稀釋至20化L，混勻，稍微離屯、，保存于-20°C，備 用。
[0024] (3)PCR反應（2 化L):cDNA化L，10XBuffer 2.扣L，10mmol/L dNTP 化L，25mmol/ LMgCl2化L，上、下游引物各化L，hq DNA聚合酶0.扣L(抓/化），d地20 1化L。反應條件為94 1：5111111預變性;941：4〇3,561：4〇3,72°(：1111111，共32個循環，72°(：延伸1〇111111，4°(：保存。
[00 巧]上游引物：5 ' -AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACACGGGTTTGTCTCCAACCT-3 '
[00%]下游引物：5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGACCCGCCGCCGCCGGCGTCG-3 '
[0027] (4)基因克隆：取0.扣1 PCR產物與PMD18-T載體進行連接，操作步驟按照TAKARA公 司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌D冊a菌株，在表面涂有氨卞青霉素（lOOiig/ mU的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
[002引 （5)質粒DNA的提取:堿法提取質粒DNA。
[0029] (6)序列測定:DNA雙脫氧法測定核巧酸序列，在上海生物工程有限公司進行。序列 引物為M13啟動子引物。疏綿狀嗜熱絲抱菌TLAA9-2基因 cDNA全長82化P，包含起始密碼子和 終止密碼子，無內含子，編碼252個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現 屬于多糖單加氧酶第AA9家族。該序列如下：
[0030] (A)沈Q ID NO 1 的信息
[0031] (a)序列特征:*長度:825堿基對;*類型：核酸;*鏈型:雙鏈;*拓撲結構:線性
[0032] (b)分子類型：DNA
[003；3] (C)假設：否
[0034] (d)反義：否
[0(X3日](e)最初來源:疏綿狀嗜熱絲抱菌化ermomyces lanuginosus [0036] (f)序列描述：
[003引 （B)沈Q ID NO 2的信息
[0039] (a)序列特征:*長度:252氨基酸;*類型:氨基酸;*鏈型:單鏈;*拓撲結構:線性
[0040] (b)分子類型：蛋白質
[OOW (C)序列描述：
[00421
[0043] 實施方式3:表達載體的構建
[0044] (1)將目的基因 CDS序列進行信號膚分析預測，去除信號膚，根據載體信息設計引 物，引入化oil和Xbal酶切位點，并補全序列至化iczaA載體的Kex2蛋白信號切割位點，反向 引物3'端去除終止密碼子并添加兩個堿基W保證序列正常翻譯至6X化S標簽。
[0045] 上游引物：5 ' -AGGGGTATCTCTCGAGAAAAGACACGGGTTTGTCTCCAACCT-3 '
[0046] 下游引物：5 ' -GAGTTTTTGTTCTAGACCCGCCGCCGCCGGCGTCG-3 '
[0047] (2)疏綿狀嗜熱絲抱菌總RNA的提取:利用Trizol試劑提取。
[004引 （3)反轉錄合成cDNA第一條鏈:取化g總RNA，加入5X反應緩沖液化L，10mM dNTP 2 化，核糖核酸酶抑制劑(40-200uAiL)0.扣L引物oligodT(化g/化）化L，反轉錄酶（1011/化)2 化，42 °C反應60min，然后85 °C lOmin終止反應，稀釋至200化。
[0049] (4)PCR 反應（2 化L):cDNA 化L，10XBuffer 2.化L，10mmol/L dNTP 化L，25mmol/ LMgCl2化L，上、下游引物各化L，化q DM聚合酶0.扣L(抓/化），dd出0 1化L。反應條件為94°C 5min 預變性;941：4〇3,561：4〇3,72°(：1111111，共32個循環，72°(：延伸1〇111111，4°(：保存。
[0050] (5)基因克隆：取化L PCR產物與PMD18-T載體進行連接，獲得重組質粒PMD18T/ TLAA9-2操作步驟按TAKARA公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌D冊a，在涂有 AMP的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
[0051 ] (6)質粒DNA提取:堿法提取質粒DNA。
[0化2] (7)用化oil和Xbal對重組質粒PMD18-T/TLAA9-2產物進行雙酶切，同時用化oil和 Xbal雙酶切酵母表達質粒pPICZaA，DNA膠回收試劑盒回收純化TLAA9-2基因及載體pPICZa A片斷。然后進行體外連接，獲得重組質粒pPICZaA/TLAA9-2，重組質粒轉化大腸桿菌JM109， 在含Amp的LB轉化平板上挑選單菌落，提取質粒DNA，進行PCR和酶切鑒定，測序確認重組質 粒的讀碼框正確。
[0053]實施例4.表達多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的酵母工程菌株的構建及篩選 [0化4] (1)重組表達質粒的線性化：將重組表達質粒pPICZaA/化AA9-2用限制性內切酶 Sac I線性化。
[0化5] (2)轉化：電擊轉化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受態細胞，轉化方法 參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。
[0056] (3)篩選：用滅菌牙簽挑取轉化子對應點種在Zeocin平板上，28°C培養2-4d，挑取 在Zeocin平板上均生長良好的轉化子為陽性轉化子。挑取陽性轉化子分別點種于高濃度博 來霉素平板上篩選多拷貝轉化子。
[0化7] 實施方式5:畢赤酵母Pichia pastoris GS115的誘導表達和活性檢測 [0化引 （1)將陽性轉化子接種于含25mL BMGY培養基中，30°C20化pm/min搖床培養24h (0060(値達到1.8)，離屯、收集菌體，將細胞重懸于適當體積的BMMY培養基中，至OD600值為1.0， 28°C200rpm/min繼續培養，每24h補充甲醇至終濃度為0.5 %，每24h取樣，室溫10，OOOg離屯、 5min，取上清進行SDS-PAGE分析。
[0059] (2)酶活性檢測：酶活性測定采用酶解產物薄層層析法，反應體系及反應條件為 100化的酶液，加入20化L的0.5%憐酸膨脹纖維素，100化的醋酸緩沖液(0.2mol/L、抑5.0) 50°C反應48h，離屯、后取上清3ul到層析板上，展層后噴灑顯色液，85度20min觀察結果。蛋白 含量測定采用化a壯ord法。
[0060] (3)重組多糖單加氧酶TLAA9-2的最適反應溫度:誘導表達的重組多糖單加氧酶經 過GE公司的化sTrap FF crude金屬配體親和層析柱純化帶有組氨酸標記的重組蛋白質，獲 得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組多糖單加氧酶測定其性質。在相同PH(K1 = 5)不同 的溫度條件下（30°C，40°C，50°C，60°C，70°C，80°C，90°C)多糖單加氧酶反應36h，然后分別 加入纖維素酶，50 °C下反應半小時，DNS法測量產生的還原糖的量。數值測量S次求平均值， 將最高的酶活力定義為100%。
[0061] 實施方式6:AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2對內切纖維素酶N24活性的促進作用
[0062] (1 )AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2對內切纖維素酶N24活性的促進作用
[0063] 采用DNS法，多糖單加氧酶在PH = 5,溫度50°C，200RPM的條件下，設置兩組多糖單 加氧酶與纖維素反應36h，一組加入纖維素酶，一組不加纖維素酶，50°C下反應30min，反應 體系為：TLAA9-250化，N2450化，200化的0.5%憐酸膨脹纖維素，100化的醋酸緩沖液 (0.2mol/L、pH 5.0)，加入400化DNS試劑，煮沸lOmin，在540nm波長下測定光吸收值。W不 加多糖單加氧酶化AA9-2的反應體系中的酶活性定義為100%，分別計算多糖單加氧酶 TLAA9-2、內切纖維素酶N24W及混合酶的相對酶活性。重復S次，取平均值。
[0064] (2)供電子體(抗壞血酸)對多糖單加氧酶TLAA9-2纖維素酶活性的影響
[00化]設置兩組反應體系，一組加入抗壞血酸，使其終濃度為lOmM，另一組不加抗壞血 酸，在多糖單加氧酶TLAA9-2最適反應條件下測定其氧化裂解纖維素酶活性，反應4她后，娃 膠薄層層析分析產物，測定活性。
[0066] 實施方式7: AA9家族多糖單加氧酶酶解產物飛行質譜分析
[0067] 將AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2與憐酸膨脹纖維素混合在PH = 5的醋酸安緩沖液 中，在最適溫度條件下反應4她，取上清做飛行質譜。AA9家族多糖單加氧酶TLAA9-2氧化裂 解產生的多糖有多種形式，主要有C1和C4氧化，還可能有C6氧化。C1氧化C6氧化C4水和產物 的分子量均增加16,而C4氧化分子量變化為2。飛行質譜測的的分子量減去對應寡糖的分子 量再減去氧化減少的碳原子的數量和結合鋼離子的數量為氧化后的產物分子量。
[0068] 實施方式8:表達TLAA9-2基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9-2的保藏
[0069] 表達TLAA9-2基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT-TLAA9-2的保藏單位：中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC);地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國 科學院微生物研究所;保藏日期：2016年4月21日；酵母工程菌株編號為:CGMCC No . 12384; 畢赤酵母工程菌株的分類命名為:己氏畢赤酵母Pichiapastoris。
【主權項】
1.一種表達疏綿狀嗜熱絲孢菌Thermomyces lanuginosusAA9家族多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR方法從疏綿狀嗜熱 絲孢菌Thermomyces lanuginosus獲得熱穩定AA9家族糖苷水解酶基因 TLAA9-2，將該基因 克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPICZaA，獲得表達重組質粒pPICZaA/TLAA9_2,轉化畢赤 酵母GS115,從中篩選出表達熱穩定多糖單加氧酶基因 TLAA9-2的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9-2，該糖苷水解酶TLAA9-2對內切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用，并且能夠將磷酸 膨脹纖維素氧化裂解為纖維寡糖，飛行質譜結果鑒定裂解纖維素長鏈主要產物為纖維寡 糖。
【文檔編號】C12N1/19GK106047737SQ201610366951
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月26日
【發明人】李多川, 耿志剛, 陳銘
【申請人】山東農業大學