的熒光探針的制備方法和應用

的熒光探針的制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種熒光探針及其制備方法和應用，具體涉及一種檢測食源性水中S2-的熒光探針及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 含硫有機物分解或硫酸鹽類物質還原而生成的硫化物，即含有S2-的物質具有一定 的毒性，微摩爾濃度的含s 21 勿質的存在已可對水生生物和人類造成傷害(Wang F et.al. Env. Toxi. Chem. 1999，18(11): 2526-2532.XS2-超標的水或者食物可造成人體內細胞 色素、氧化酶等物質中二硫鍵的破壞，造成細胞組織嚴重缺氧，導致人體四肢麻痹甚至休 克。《地表水環境質量標準》要求食用水源中硫化物的含量不得高于0.05mg/L，因此，檢測食 用性水源中S 2_的含量越來越受到重視。
[0003] 目前，水中S2_的檢測方法發展迅速，已報道的有毛細管電泳法，光纖傳感器法，離 子色譜法，離子選擇性電極法，氣相色譜法，流動注射分析法、電感耦合等離子體原子發射 光譜法等，被用于國家標準的有氣相分子吸收光譜法(HJ/T200-2005)、對氨基二甲基苯胺 比色法(GB/T 30376-2013)和碘量法(MT/T 371-2005)。這些分析方法中，要么需要用復雜 的儀器設備，要么分析過程步驟繁雜，且有的方法的靈敏度并不高，比如對氨基二甲基苯胺 比色法對水中硫離子的濃度檢測范圍為0.08~1.00 mg/L，碘量法測定水中硫離子的濃度 范圍為1.00 mg以上(參見MT/T 371-2005)。因此，發展簡單易行、檢測成本低、選擇性好、靈 敏度高的硫化物分析方法具有重要的應用價值。
[0004] 近年來，熒光化學傳感器技術的發展帶動了一批有機熒光物質的出現，例如三氰 基二氧呋喃，2，7-二醋酸汞基熒光素，α，β_不飽和醛酮等有機類化合物用于檢測水溶液中 S2_的濃度。但是，此類化合物水溶液中溶解度低，需要用有機溶劑溶解，且此類化合物合成 步驟復雜，合成過程需要大量的有機試劑，造成環境污染。因此，研發環境友好型可用于食 用性水源檢測的熒光傳感器具有非常重要的意義。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種檢測靈 敏度高，成本低，選擇性好，抗干擾，環境友好的檢測食源性水中S 2_的熒光探針。
[0006] 本發明進一步要解決的技術問題是，克服現有技術存在的上述缺陷，提供一種步 驟簡單、成本低的檢測食源性水中S2_的熒光探針的制備方法。
[0007] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案如下:一種檢測食源性水中S2-的熒光探 針，由Cu2+與含有至少3個組氨酸和至少1個色氨酸的多肽絡合而成，且色氨酸的位置在組氨 酸之間。
[0008] 進一步，所述含有至少3個組氨酸和至少1個色氨酸，且色氨酸的位置在組氨酸之 間的多肽氨基酸序列為:組氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸、組氨酸-絲氨酸-色氨酸-甘氨酸_ 組氨酸-谷氨酰胺-組氨酸或絲氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酸等。
[0009]進一步，所述Cu2+與組氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸絡合所得熒光探針的分子結構 式如下所示：
所述Cu2+與組氨酸-絲氨酸-色氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酰胺-組氨酸絡合所得熒光 探針的分子結構式如下所示：
所述Cu2+與絲氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酸絡合所得熒光探 針的分子結構式如下所示：
[0010] 進一步，所述多肽采用多肽固相合成法。
[0011] 本發明進一步解決其技術問題所采用的技術方案如下:檢測食源性水中S2-的熒光 探針的制備方法，將多肽水溶液和CuSO^H 2S〇4溶液以多肽:Cu2+的摩爾比為1.0~1.2:1的 比例，與4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液混合，即成。
[0012] 進一步，所述多肽水溶液的濃度為100~400ymol/L。多肽水溶液濃度若低于?οομ mol/L，不利于后面多肽、Cu 2+和4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液的混合，而多肽水溶液濃度若 高于400μπι〇 1 /L，由于多肽在水溶液中的溶解度不高，多肽在水中的有效濃度降低，造成多 肽-Cu2+絡合物濃度的不準確，最終導致對S 21t測的不準確。
[0013] 進一步，所述CuS〇4的H2SO4溶液是指溶解于0.2~4.0 mmol/LH2S〇4溶液中，CuS〇4濃 度為0.2~4. Ommol/L的溶液。CuS0^H2S04溶液濃度不能過大，過大會影響最終測試溶液的 pH〇
[0014] 進一步，所述4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液的濃度為10~50mmo 1 /L，pH值為7.0~ 7.8。4_羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液的濃度若低于10 mmol/L，不能發揮緩沖溶液的效果，即 CuS0d^H2S04溶液和多肽水溶液的加入會造成最終溶液pH值的改變，4-羥乙基哌嗪乙磺酸 緩沖溶液的濃度若高于50 mmol/L，則會影響多肽與Cu2+的絡合，影響本方法的靈敏度。而4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液pH值過高或過低都會影響多肽與Cu 2+的絡合，影響本方法對S2_ 的檢測。緩沖溶液的用量不需要嚴格限制。
[0015] 進一步，所述混合的溫度為20~37°C，時間為1~2min。混合的溫度若低于20°C，會 影響多肽的溶解度，若高于3 7 °C，則會影響多肽與Cu2+的絡合。多肽與Cu2+的絡合物可以迅 速絡合，混合時間并不需要太長。
[0016] 將本發明所述熒光探針用于檢測食源性水中S2'具體操作為:將所述熒光探針配 制成濃度為ΙΟμ mol/L的標準檢測溶液，向該標準檢測溶液中加入待測溶液，分別測定加入 待測溶液前標準檢測溶液的本征信號和加入待測溶液后標準檢測溶液的熒光光譜的輸出 信號，前后信號之差即為待測溶液中S 2_的含量。
[0017] 本發明的原理是:含有至少3個組氨酸和至少1個色氨酸，且色氨酸的位置在組氨 酸之間的多肽具有熒光，Cu2+與該多肽絡合后淬滅了該多肽的熒光，而S 2_可以和Cu2+與該多 肽的絡合產物多肽_Cu2+中的Cu 2+結合生成沉淀，釋放出多肽，增強溶液中自由多肽的含量， 從而使熒光強度增強。本發明以含有至少3個組氨酸和至少1個色氨酸，且色氨酸的位置在 組氨酸之間的多肽-Cu2+為熒光材料，用F-4600熒光分光光度計檢測其在不同S2!^度下的 多肽熒光光譜，根據所測數據繪制標準曲線，測得待測溶液在多肽_Cu2+絡合物溶液中的熒 光信號后，即可從標準曲線上得出待測溶液中的S 2_濃度。
[0018]本發明的有益效果如下： (1) 本發明熒光探針檢測靈敏度高，檢出限為O.Olymol/L，檢測范圍為0.05~20μπι〇1/ L，檢測速度快，不受常見陰離子干擾，成本低，選擇性好； (2) 本發明熒光探針在檢測過程中，無需復雜且昂貴的儀器設備，分析過程簡單易行， 耗樣少，無需添加有機溶劑溶解，可用于食源性水中S 2_的檢測，環境友好； (3) 本發明制備方法步驟簡單、成本低。
【附圖說明】
[0019] 圖1是ΙΟμL?οΙ/L HHWH溶液，實施例1所得ΙΟμL?θΙ/L HHWH-Cu2+溶液以及在其中加入 不同濃度S2^后的熒光發射譜圖（圖中S2!^度由下至上依次為0.5，1.0,2.0,2.5,3.0,4.0， 5·0,6·0,7·0,8·0,9·0和9.5ymol/L); 圖2是不同濃度32_在實施例1所得ΙΟμ mol/L HHWH-Cu2+中355nm處的標準曲線（線性方 程為:y= 99.00X+85.68其中，y為熒光強度值，X為S2-的濃度，R2為0.999); 圖3是不同常見陰離子在實施例1所得ΙΟμ mol/L HHWH-Cu2+中355nm處的熒光強度（圖 中1為HHWH-Cu2+溶液中直接加入S2^的溶液，2~13依次為HHWH-Cu2+溶液中分別加入S〇4 2_， S032-，S2〇32-，S 2〇82-，HC03-，CH3⑶0-，N〇2-，Cl-，Br-，Γ，L-半胱氨酸或P〇4 3-后，再加入S2-的溶 液，其中，常見陰離子在混合溶液中的濃度為1 mmo 1/L，S2^在混合溶液中的濃度為5μπι〇 1/ L)〇
【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例和附圖對本發明作進一步說明。
[0021 ]本發明實施例所使用的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液(HEPES緩沖液)購于Si gma-Aldrich;其它所使用的化學試劑，如無特殊說明，均通過常規商業途徑獲得。
[0022] 參考例1 多肽組氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸(HHWH)的制備方法為：（1)將lg 2-氯三苯甲基氯 樹脂放入反應管中，加入15 mL二氯甲烷(DCM)溶脹，振蕩30min; (2)通過沙芯抽濾掉DCM，先 加入6.5g保護組氨酸氨基酸(Fmoc-His(Trt)-OH)，再加入10 mL N，N二異丙基乙胺(DIEA)， 最后加入15 mL二甲基甲酰胺(DMH溶解，振蕩30min后，加入5mL甲醇，震蕩30min; (3)抽濾， 向固體中加20 mL 20%哌啶DMF溶液，反應5min，過濾后，再加20 mL 20%哌啶DMF溶液，反應 15min;(4)抽掉20%哌啶DMF溶液，用20 mL DMF沖洗2次，20 mL甲醇沖洗2次，20 mL DMF再沖 洗2次；（5)將51^01^溶解的68保護色氨酸氨基酸斤111〇(3-1'印(8〇(3)-0!〇,51^01^溶解的7 8 0-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯（HBTU)加入反應管，再立刻加入30mL DIEA，反應 30min;(6)用20 mL DMF沖洗2次，20 mL甲醇沖洗2次，20 mL DMF再沖洗2次；（7)重復（3)~ (6)的操作，從右到左依次連接序列中的氨基酸；（8)用20 mL DMF沖洗兩次，20 mL甲醇沖洗 2次，20 mL DMF再沖洗2次，抽干10min;(9)加200 mL切割液(三氟乙酸（TFA) 95wt%，水 2￥七％，1，2-乙二硫醇化01')2￥丨％，三異丙基硅烷(1'13)1￥丨％)避光切割12〇!1^11 ;(10)抽濾得到 固體，將裂解液用氮氣盡量吹干，用乙醚洗所得固體6次，然后常溫揮發干燥，得待純化的多 肽；（11)用高效液相色譜(HPLC)通過C18柱純化多肽：以含0. lwt%TFA的乙氰和含0. lwt%TFA 的水作為流動相，洗滌時間為40 min，流速為4.75 mL/min，產物的出峰時間為17.8 min; (12)最后將純化后的溶液凍干，即得到成品；（13)鑒定：分別取少量的成品多肽，做質譜 (MS)的分子量鑒定；（14)密封避光包裝白色粉末狀的多肽，-20°C保存。
[0023] 參考例2 多肽組氨酸-絲氨酸-色氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酰胺-組氨酸(HSWGHQH)的制備方法 與參考例1的區別僅在于:在步驟(2)與步驟(5)加入氨基酸時，按照本參考例中的氨基酸序 列按照從右至左的順序加入相應的Fmoc保護的氨基酸即可。余同參考例1。
[0024] 參考例3 多肽絲氨酸-組氨酸-色氨酸-組氨酸-甘氨酸-組氨酸-谷氨酸(DHWHGHE)的制備方法與 參考例1的區別僅在于:在步驟(2)與步驟(5)加入氨基酸時，按照本參考例中的氨基酸序列 按照從右至左的順序加入相應的Fmoc保護的氨基酸即可。余同參考例1。
[0025] 實施例1 HHWH-Cu2+熒光探針的分子結構式如下所示：
[0026] 制備方法:將10yL參考例1所得HHWH配制的濃度為200 ymol/L的HHWH水溶液和2μ L溶解于1 mmol/L H2SO4溶液中CuS〇4濃度為1 mmol/L的溶液與188yL的HEPES緩沖液(濃 度10 mmol