一種食源性致病菌dna的階段控溫快速提取方法
【專利摘要】本發明一種食源性致病菌DNA的階段控溫快速提取方法。本發明方法將菌液離心、收集菌體，通過洗滌緩沖液洗滌后，加入裂解液快速油浴裂解，再水浴處理，離心取上清液即為模板DNA。使用本方法提取的DNA純度OD260/OD280為1.6-1.8，能夠滿足PCR、熒光PCR以及環介導等溫擴增等快速檢測技術對食源性致病菌進行分子檢測的要求。本發明方法綜合運用了階段控溫對細胞裂解、去除蛋白質等抑制劑從而釋放出DNA，操作簡單，時間短，且無需特殊實驗儀器及試劑，實驗成本低。
【專利說明】一種食源性致病菌DNA的階段控溫快速提取方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物【技術領域】，具體涉及食源性致病菌DNA的快速提取方法。
【背景技術】
[0002] 食品安全問題一直是各國政府和人民群眾最為關心的問題，由食源性致病菌引起 的食源性疾病是影響食品安全的最主要的因素之一。在HACCP體系的建立和實施過程中， 致病性病原微生物一直是各類食品加工行業控制的重點。
[0003] 食源性致病菌是引起細菌性食物中毒的病原菌。食源性致病菌多達幾十種，主要 有金黃色葡萄球菌，沙門氏菌，志賀氏菌和副溶血性弧菌、大腸桿菌、單核增生李斯特菌、肉 毒桿菌等。食源性致病菌對人體健康的影響主要是指微生物本身及其代謝過程、代謝產物 對食品原料、加工過程和產品的污染，這種污染會對食品消費者的健康造成損害。
[0004] 傳統的食源性致病菌的分離培養檢測方法檢測周期長，需要4-7d，且操作步驟繁 瑣、特異性差。因此建立快速、靈敏、準確的檢測技術來檢測食源性致病菌顯得尤為重要，聚 合酶鏈式反應（PCR)等分子生物學檢測技術因其特異性和靈敏度高而被廣泛采用。而PCR 檢測技術的第一步就是模板DNA的制備，即樣品中DNA的提取，直接影響著PCR反應的結 果。長期以來，樣品中DNA的提取和純化一直是耗時、繁瑣的過程，嚴重減慢了檢測速度。因 此，建立一種快速的DNA提取方法對提高PCR檢測效率起著至關重要的作用。
[0005] 本【技術領域】所熟知的DNA提取方法主要有十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)、試劑盒 方法等。CTAB方法提取的DNA純度，為1. 8左右，應用較廣泛，但其操作步驟繁瑣，長達8步， 且實驗過程中用到苯酚氯仿等有毒試劑，而試劑盒方法因其提取的DNA純度高達1. 8-2. 0， 是目前應用最為廣泛的一種方法，但其操作耗時長達l_2h。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于解決現有DNA提取耗時長、步驟多的難題，提供了一種快速提 取食源性致病菌DNA的方法，且提取的DNA質量滿足后續檢測方法要求，從而加快了食源性 致病菌的檢測速度，以便更好地為食源性疾病的預防和控制提供幫助。
[0007] 本發明的技術方案是按以下步驟進行：
[0008] (a)取食品樣品10_25g(mL)或致病菌菌株至適宜液體培養基制備培養液，然后取 l-5mL細菌培養液，8000-12000rmp離心l-4min，使細菌細胞沉淀，棄上清；
[0009] (b)往步驟（a)制得的的菌體沉淀中加入100-500UL無菌雙蒸水，充分混合， 8000-12000rmp 離心 l_4min，棄上清；
[0010] (c)往步驟（b)制得的細菌沉淀中加入100-500uL細胞裂解液，懸浮細菌沉淀，并 于 105°C _126°C油浴 10s-3min ;
[0011] (d)將步驟（C)所得的混合液移至70°C -95°c水浴5-30min ;
[0012] (e)步驟（d)結束后，8000-12000rmp離心l-4min取上清，上清液即為模板DNA，對 提取所得DNA進行質量檢測，剩余DNA于-20°C保存備用。
[0013] 現有技術中的DNA提取方法耗時長達數小時，本發明方法綜合運用了水浴及油浴 進行階段控溫，通過裂解液裂解細胞，從而快速的獲取DNA，整個提取過程不到40min，簡單 有效。本方法不需要特別的實驗儀器及試劑，成本相對較低。使用本方法提取的DNA樣品 濃度在50-400ng/uL，所得的DNA純度即0D260/0D280的比值為1. 6-1. 8.且所得的DNA質 量可以滿足普通PCR、熒光PCR、環介導等溫擴增等檢測方法的要求。
[0014] 表1金黃色葡萄球菌DNA濃度及純度
[0015]
【權利要求】
1. 一種食源性致病菌DNA的階段控溫快速提取方法，該方法包括如下步驟： (a) 取l-5mL食源性致病菌培養液，8000-12000rmp離心l-4min，使細菌細胞沉淀，棄上 清； (b) 往步驟（a)制得的菌體沉淀中加入100-500uL無菌雙蒸水，充分混合， 8000-12000rmp 離心 l_4min，棄上清； (c) 往步驟（b)制得的細菌沉淀中加入100-500uL細胞裂解液，懸浮細菌沉淀，并于 105°C _126°C油浴 10s-3min ; (d) 將步驟（c)所得的混合液立即移至70°C -95°C中水浴5-30min ; (e) 步驟（d)結束后，8000-12000rmp離心l-4min取上清，上清液即為模板DNA，對提取 所得DNA用于分析檢測，剩余DNA于-20°C保存備用。
2. 根據權利要求1所述的食源性致病菌包括金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單 核增生李斯特菌、副溶血性弧菌等。
3. 根據權利要求1所述步驟（a)中，細胞培養液為取食品樣品10-25g(mL)或致病菌菌 株至適宜液體培養基，于最適培養溫度培養12-20h。
4. 根據權利要求1所述步驟（c)中，細胞裂解液為：0-10% chelex-100水溶液。
5. 根據權利要求1所述步驟（e)中所述對DNA進行分析檢測，其特征在于，所述的DNA 濃度通過瓊脂糖凝膠電泳或測定0D260, 0D260/0D280比值得到。所得致病菌DNA濃度在 50-400ng/uL，所得的DNA純度0D260/0D280比值為1. 6-1. 8 ;且所得的DNA質量可以滿足 普通PCR、熒光PCR、環介導等溫擴增等檢測方法的要求。
【文檔編號】C12N15/10GK104059906SQ201410161363
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】熊曉輝, 熊麗莎, 陸利霞, 程月花, 游京晶 申請人:南京工業大學