一種食源性致病菌細胞死活的鑒別方法

專利名稱：一種食源性致病菌細胞死活的鑒別方法
技術領域：
本發明涉及微生物細胞活性檢測方法，具體涉及一種食源性致病菌細胞死活的鑒別方法。
背景技術：
據世界衛生組織估計，全世界每年數以億計的食源性疾病患者中，70%是由于各 種致病性微生物污染食品和飲用水引起。我國過去十年間食物中毒發生情況的統計表明， 微生物食物中毒居各類食物中毒病源的首位，約占食物中毒規模的40%，導致的中毒人數 占總中毒人數的一半以上。沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、空腸彎曲菌、大腸桿 菌、志賀氏菌、肉毒梭菌、單增李斯特菌等都是重要的食源性致病菌。其中，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一種嗜鹽性細菌，主要分布于沿 岸海水、海河交界處及海產品中，并能以水和水生生物等為媒介，人食用了受該菌污染的海 產品后，會引起人類腸胃炎或食物中毒。輕癥患者會出現腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐等癥狀， 重癥患者還會脫水、休克昏迷，甚至死亡。近年來，副溶血性弧菌引起的食物中毒次數略高 于沙門氏菌引起的食物中毒次數，發生規模以及人群暴露規模亦呈明顯上升趨勢，成為微 生物食源性疾病的首要病因，特別是在一些沿海城市，由該菌引起的食物中毒占細菌性食 物中毒總數的61%以上，嚴重威脅人們的身體健康，越來越受到水產養殖和公共衛生機構 的重視。志賀菌(Shigella)通稱痢疾桿菌，是人類細菌性痢疾最為常見的病原菌，具有高 度傳染性和嚴重危害性。據報道，每年因志賀氏菌引起食物中毒事件十分頻繁，尤其以牲畜 禽肉和乳品的污染較為嚴重。人體在感染后會出現惡心、嘔吐、腹痛等癥狀，嚴重威脅著消 費者的身體健康，造成了巨大的經濟損失。因此，建立快速、靈敏、特異、簡便有效的檢測食 源性致病菌的方法具有重要意義。目前，食源性致病菌的檢測方法主要采用增菌、選擇性培養、生理生化鑒定、傳統 PCR、實時定量熒光PCR等分子生物學方法以及血清學反應等技術。但以DNA為基礎的PCR 檢測方法因其能從活細胞和死細胞中擴增出目的基因，從而無法有效地區分活細胞和死細 胞，死細胞或自由狀態的DNA已經沒有危害性卻仍然被檢測出來，易出現假陽性結果，具有 較低的特異性和準確性。因而研究發明一種快速有效區分活細胞和死細胞的方法在食品衛 生檢驗及進出口商品檢疫工作中十分重要。EMA(ethidium monoazide)是一種DNA結合染料，能滲透到細胞壁或細胞膜不完 整的死細胞內，在光激活的作用下，易形成氮賓化合物進而與DNA或其它分子共價結合，而 這種結合是不可逆的結合，從而抑制死細胞DNA的擴增，即未出現特異性擴增條帶；而活細 胞完整的細胞壁或細胞膜能阻止EMA滲透到活細胞內，從而對活細胞的DNA不起作用。

發明內容
本發明目的在于根據現有PCR技術檢測食源性致病菌時存在無法區別活細胞和 死細胞，檢測的特異性和準確性較低的問題，通過將EMA選擇滲透性和PCR檢測技術相結合，建立一種快速、有效檢測鑒別副溶血弧菌及其他食源性致病菌的死活細胞的新方法。本發明目的通過以下技術方案予以實現一種食源性致病菌細胞死活的鑒別方法，包括如下步驟取食源性致病菌細胞菌 懸液，加入終濃度為5 50 y g/mL的EMA并置于黑暗中3 lOmin后，冰浴條件下用鹵素 燈曝光5 15min，提取菌液DNA，進行PCR擴增和電泳分析，當出現特異性擴增條帶時，則 食源性致病菌細胞為活細胞；未出現特異性擴增條帶時，食源性致病菌細胞為死細胞。本發明鑒別方法中，所述PCR擴增可以為如下步驟(1)取EMA處理后的菌液離心、棄上清、洗滌，加入TE重懸后100°C水浴，冷卻、離 心，取上清液作為PCR模板；(2)PCR 反應體系為10 Xbuffer 緩沖液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/LdNTP 2ii L，0. 6iimol/L 弓| 物 2ii L，TapDNA 聚合酶 1 y L(5U/y L)，DNA 模板 4 y L，加水補足到 50 u L ；PCR 反應循環參數為94°C預變性 5min，94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s, 30 個循環，終 延伸 72 °C 7min。作為一種優選方案，本發明鑒定方法包括如下步驟(l)EMA處理食源性致病菌死/活細胞取一定濃度的食源性致病菌活/死細胞菌懸液各lmL置無菌離心管中，分別加入 終濃度為5 50 y g/mL的EMA并置于黑暗中3 lOmin，然后將離心管置于冰浴中且打開 管蓋，用650W鹵素燈曝光5 15min。(2)經EMA處理后菌液DNA模板的制備取EMA處理后菌液lmL于無菌離心管中，10000r/min離心5min，棄上清，用生理鹽 水洗滌2 3次，加入TE 100 u L重懸，100°C水浴lOmin,冰浴中冷卻lOmin, 12000r/min離 心5min，取上清液作為PCR模板。(3)PCR擴增反應PCR 反應體系10 X buffer 緩沖液(含 20mmol/L Mg2+)5u L, 10mmol/L dNTP2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L (5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水補足到 50 u L。PCR 反應的循環參數94°C預變性 5min ；94°C 30s,58°C 30s,72°C 30s，30 個循環； 終延伸72 °C 7min。(4)結果判定取5 u LPCR產物點樣于瓊脂糖凝膠中，100V電壓電泳30min，在凝膠成像系統 中觀察結果，當出現特異性擴增條帶時，即為食源性致病菌活細胞陽性，當未出現特異性擴 增條帶時，即為食源性致病菌活細胞陰性(即死細胞)。目前，容易引起食物中毒的食源性致病菌主要有副溶血弧菌和志賀氏菌等，因此 本發明中，主要以這兩種菌為例來進行闡述。當受鑒定的菌為副溶血弧菌時，PCR擴增中所用的特異性引物是tlh基因引物，上 游引物序列如SEQ ID N0:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO 2所示。當受鑒定的菌為志賀氏菌時，PCR擴增中所用的特異性引物是ipaH基因引物，上 游引物序列如SEQ ID N0 3所示，下游引物序列如SEQ ID N0 4所示。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明鑒別方法可以快速檢測出食源性致病菌特別是副溶血弧菌細胞的死活，避免在實際樣品檢測中產生假陽性結果，為食源性疾病的預防和控制提供可靠依據，為食品 衛生檢驗、進出口商品檢疫工作提供科學方法和理論基礎，可以廣泛用于多個領域。


圖1為EMA處理對副溶血弧菌活、死細胞PCR擴增的影響，其中，M是DL2000 DNA marker ；1 10是EMA處理不同濃度的副溶血弧菌活細胞；11 13是EMA處理不同濃度的 副溶血弧菌死細胞；14是陰性對照；圖2為EMA處理對志賀氏菌活、死細胞PCR擴增的影響，其中，M是DL2000DNA marker ；2 7是EMA處理不同濃度的志賀氏菌活細胞；8 11是EMA處理不同濃度的志賀 氏菌死細胞；12是陰性對照。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明做任何形式的限定。實施例1(l)EMA處理不同濃度的副溶血弧菌活/死細胞取不同濃度的副溶血弧菌活/死細胞菌懸液各lmL置無菌離心管中，分別加入終 濃度為5 50ii g/mL的EMA并置于黑暗中3 lOmin，將離心管置于冰浴中且打開管蓋， 650W鹵素燈曝光5 15min。(2)經EMA處理后副溶血弧菌DNA模板的制備取EMA處理后菌液lmL于無菌離心管中，10000r/min離心5min，棄上清，用生理鹽 水洗滌2 3次，加入TE 100 u L重懸，100°C水浴lOmin,冰浴中冷卻lOmin, 12000r/min離 心5min，取上清液作為PCR模板。(3)PCR擴增反應引物合成引物序列如下，擴增片段長度約為450bp。上游引物序列如SEQ ID NO 1所示，下游引物如SEQ ID NO 2所示。PCR 反應體系10 X buffer 緩沖液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/L dNTP2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L (5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水補足到 50 u L。PCR 反應的循環參數94°C預變性 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 30 個循環； 終延伸72 °C 7min。(4)結果判定取5 ii L PCR產物點樣于1 %瓊脂糖凝膠中，100V電壓電泳30min，在凝膠成像系 統中觀察結果，當在450bp處出現特異性擴增條帶時，即為副溶血弧菌活細胞陽性，當在 450bp處未出現特異性擴增條帶時，即為副溶血弧菌活細胞陰性。實施例2(l)EMA處理不同活細胞比例的副溶血弧菌混合菌懸液將副溶血弧菌活細胞菌懸液和死細胞菌懸液(2. OX 107CFU/mL)配制含有100%、 75%,50%,25%,20%,10%,5%,4%,3%,2%,1%>0% (均為體積百分數)的活細胞菌懸 液混合體系，分別加入終濃度為5 50 y g/mL EMA并置于黑暗中3 lOmin，將離心管置于冰浴中且打開管蓋，650W鹵素燈曝光5 15min。(2)經EMA處理后副溶血弧菌DNA模板的制備取EMA處理后菌液lmL于無菌離心管中，10000r/min離心5min，棄上清，用生理鹽 水洗滌2 3次，加入TE 100 u L重懸，100°C水浴lOmin,冰浴中冷卻lOmin, 12000r/min離 心5min，取上清液作為PCR模板。(3)PCR擴增反應PCR 反應體系10 X buffer 緩沖液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/L dNTP2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L (5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水補足到 50 u L。PCR 反應的循環參數94°C預變性 5min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s, 30 個循環； 終延伸72 °C 7min。(4)結果判定取5 ii L PCR產物點樣于1 %瓊脂糖凝膠中，100V電壓電泳30min，在凝膠成像系 統中觀察結果，當在450bp處出現特異性擴增條帶時，即為副溶血弧菌活細胞陽性，當在 450bp處未出現特異性擴增條帶時，即為副溶血弧菌活細胞陰性。實施例3(l)EMA處理不同濃度的志賀氏菌活/死細胞取不同濃度的志賀氏菌活/死細胞菌懸液各lmL置無菌離心管中，分別加入終濃 度為5 50 ii g/mL的EMA并置于黑暗中3 lOmin，將離心管置于冰浴中且打開管蓋，650W 鹵素燈曝光5 15min。(2)經EMA處理后志賀氏菌DNA模板的制備取EMA處理后菌液lmL于無菌離心管中，10000r/min離心5min，棄上清，用生理鹽 水洗滌2 3次，加入TE 100 u L重懸，100°C水浴lOmin,冰浴中冷卻lOmin, 12000r/min離 心5min，取上清液作為PCR模板。(3)PCR擴增反應引物合成引物序列如下，擴增片段長度約為250bp。上游引物如SEQ ID NO 3所示，下游引物如SEQ ID NO 4所示。PCR 反應體系10 X buffer 緩沖液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/L dNTP2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L (5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水補足到 50 u L。PCR 反應的循環參數94°C預變性 5min ；94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，30 個循環； 終延伸72 °C 7min。(4)結果判定取5 ii L PCR產物點樣于瓊脂糖凝膠中，100V電壓電泳30min，在凝膠成像系統 中觀察結果，當在250bp處出現特異性擴增條帶時，即為志賀氏菌活細胞陽性，當在250bp 處未出現特異性擴增條帶時，即為志賀氏菌活細胞陰性。
權利要求
一種食源性致病菌細胞死活的鑒別方法，其特征在于包括如下步驟取食源性致病菌細胞菌懸液，加入終濃度為5～50μg/mL的EMA并置于黑暗中3～10min后，冰浴條件下用鹵素燈曝光5～15min，提取菌液DNA，進行PCR擴增和電泳分析，當出現特異性擴增條帶時，則食源性致病菌細胞為活細胞；未出現特異性擴增條帶時，食源性致病菌細胞為死細胞。
2.根據權利要求1所述食源性致病菌細胞死活的鑒別方法，其特征在于所述PCR擴增 步驟如下(1)取EMA處理后的菌液離心、棄上清、洗滌，加入TE重懸后100°C水浴，冷卻、離心，取 上清液作為PCR模板；(2)PCR反應體系為10Xbuffer緩沖液(含 20mmol/L Mg2+) 5 u L, lOmmol/LdNTP 2 u L, 0. 6u mol/L 引物 2 ii L，TapDNA 聚合酶 1 u L(5U/ u L)，DNA 模板 4u L,加水補足到 50 u L ； PCR反應循環參數為94°C預變性5min，94°C 30s,58°C 30s,72°C 30s，30個循環，終延伸 72 °C 7min。
3.根據權利要求1或2所述食源性致病菌細胞死活的鑒別方法，其特征在于所述食源 性致病菌為副溶血弧菌或志賀氏菌。
4.根據權利要求3所述食源性致病菌細胞死活的鑒別方法，其特征在于鑒別副溶血弧 菌細胞死活時所用的特異性引物是tlh基因引物，上游引物序列如SEQ ID NO :1所示，下游 引物序列如SEQ ID NO 2所示。
5.根據權利要求3所述食源性致病菌細胞死活的鑒別方法，其特征在于鑒別志賀氏菌 細胞死活時所用的特異性引物是ipaH基因引物，上游引物序列如SEQ ID NO :3所示，下游 引物序列如SEQ ID NO 4所示。
全文摘要
本發明公開了一種食源性致病菌細胞死活的鑒別方法。本發明鑒別方法包括如下步驟取食源性致病菌細胞菌懸液，加入終濃度為5～50μg/mL的EMA并置于黑暗中3～10min后，冰浴條件下用鹵素燈曝光5～15min，提取菌液DNA，進行PCR和電泳分析，當出現特異性擴增條帶時，則食源性致病菌細胞為活細胞；未出現特異性擴增條帶時，食源性致病菌細胞為死細胞。通過本發明鑒別方法，可以快速檢測出食源性致病菌特別是副溶血弧菌細胞的死活，避免在實際樣品檢測中產生假陽性結果，為食源性疾病的預防或控制提供可靠依據，也為食品衛生檢驗、進出口商品檢疫工作提供科學方法和理論基礎。
文檔編號C12Q1/68GK101845492SQ201010105729
公開日2010年9月29日 申請日期2010年1月29日 優先權日2010年1月29日
發明者孫遠明, 李青, 王麗, 鐘青萍 申請人:華南農業大學