多特異性受體的改進的純化的制作方法

專利名稱：多特異性受體的改進的純化的制作方法
技術領域：
本發明涉及復合受體，即能夠結合癥狀引發分子例如氨基酸或碳水化合物上的多個結構的受體的純化領域。本發明還涉及治療數種代謝紊亂的方法，在這些代謝紊亂中來源于普通膳食的生物分子在患者體內引發疾病癥狀。
背景技術：
親和層析是利用層析基質上的分子與該分子的結合配偶體之間的相互作用以從與該分子具有不同親和力的物質的更大池中或從粗混合物例如發酵儲液中選擇結合配偶體亞群的方法。利用分子之間的結合以用于純化、分析、診斷等目的的方法，例如親和層析，受到由層析基質上的分子的取向導致的位阻和受到其與基質偶合的方式(經由載體分子、間隔物、接頭等)的固有限制。這種限制的后果是僅分子總集的有限部分的不連續結合位點暴露于受體-用于與基質偶合的那些位點不能靠近與被包被的層析基質處于接觸狀態的結合配偶體。在許多情況中，由于感興趣的是結合配偶體的單獨一個特定結合特征，這不存在問題。當開發受體時，無論是所謂的天然受體例如抗體，或合成受體例如分子印跡聚合物(MIP)，可溶或不溶的最佳結合單獨受體實體-抗體分子或MIP顆粒的選擇/分離是提高所得的基于受體的產品的親和力、特異性、容量等的手段-關于MIP，參考WO 2007/095949 其中公開了純化方法，該純化方法產生具有提高的對靶分子的結合親和力和容量的MIP組合物。然而，存在對進一步提高組合物例如MIP和多克隆抗體的結合特性的需要。發明概述當制備靶分子的受體組合物時，與靶分子結合的親和力或親合力(avidity)取決于幾個因素。相對大的受體分子例如多克隆抗體和MIP與較小的靶在該靶上的幾個不同的不連續位點(discrete site)上結合且將靶分子用作層析基質上的捕獲劑，其中經由一個特定的官能團連接靶分子的純化方法將具有的結果是純化產物不必要結合那個官能團 (因為其在與基質偶合之后是結合不可及的)。另一方面，這些多位點結合受體的獨特性質是第一輪純化之后獲得的分子將包括至少部分地結合第一輪純化不可及的位點的受體。所以，如果技術人員設計使用相同靶分子作為捕獲劑，但經由不同的官能團結合的另外步驟， 進一步富集對第一純化步驟中的“隱藏結合位點”也顯示出適度高特異性的那些受體應該是可能的。富集與期望靶分子的“特有”部分結合的受體也將是可能的-對于其中官能團經由其與基質的結合而隱藏的每一純化步驟，將在純化程序期間排除其結合依賴隱藏官能團的受體-因此，如果靶分子包括與許多其他分子(如氨基酸的情形，其中每一種氨基酸都具有在氨基酸之間結構上相同的N端和C端)共有的非特有官能團，其中每一種非特有官能團依次被隱藏的多步純化程序將提供與靶分子真正特有的官能團結合的受體組合物。
因此，第一方面本發明涉及制備富集與因子(agent)結合的受體的組合物的方法，其中所述受體各自特異性結合所述因子上的至少兩個不連續位點，所述方法包括a.提供包含所述受體的樣品，b.對所述樣品進行第一親和層析步驟，其中所述因子用作親和純化劑，且其中經由與所述至少兩個不連續位點的單個位點結合將所述因子固定在固相或半固相上，c.回收與所述因子結合的受體，d.對前述步驟中回收的受體進行至少一個另外的親和層析步驟，其中所述因子用作親和純化劑，且其中經由與所述至少兩個不連續位點的另一個位點結合將所述因子固定在固相或半固相上，并回收與所述因子結合的受體，其中，在每一個所述至少一個另外的親和層析步驟中，所述至少兩個不連續位點的所述另一個位點與已用于前述步驟b和d中將所述因子固定在固相或半固相上的所述至少兩個不連續位點的任何一個位點不同。第二方面，本發明涉及制備富集與因子結合的受體的組合物的方法，其中所述受體各自特異性結合所述因子上的至少兩個不連續位點，所述方法包括按照本發明第一方面的方法制備至少兩種組合物并隨后組合所述至少兩種組合物以獲得富集與所述因子結合的受體的組合物，其中在制備所述至少兩種組合物中的步驟b和d中使用相同因子，且其中i.對于至少兩種組合物，用于固定到固相或半固相上以制備所述至少兩種組合物的每一種的所述因子中的不連續位點的組合不同，和/或ii.在制備所述至少兩種組合物的至少兩種的過程中，用于固定到固相或半固相上以制備所述至少兩種組合物的每一種的所述因子中的不連續位點的使用順序 (sequential order)不同。第三方面，本發明涉及治療、改善或預防選自由苯丙酮尿癥(PKU，福蘭格氏病 (Folling's disease ))、高苯丙氨酸血癥(HPA)、尿黑酸尿癥(黑尿病)、酪氨酸血癥、高酪氨酸血癥、重癥肌無力、組氨酸血癥、尿刊酸尿癥(urocanic aciduria)、楓糖尿癥(MSUD)、異戊酸血癥(異戊酰輔酶A脫氫酶缺乏癥)、高胱氨酸尿癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、1型戊二酸尿癥(GA-I)和半乳糖血癥組成的組的疾病的方法，所述方法包括向需要其的患者的胃腸道施用有效量的分子印跡聚合物(MIP)組合物，所述組合物能夠結合所述疾病的癥狀引發劑(symptom provoking agent) 0有關這一方面該方法中使用的是MIP組合物。最后，第四方面，本發明涉及制備藥物組合物的方法，所述方法包括通過使用本發明第一或第二方面的方法制備組合物并隨后將所述組合物與藥學上可接受的載體、稀釋劑或媒介物混合。發明公開詳述定義本文使用術語“受體”以指定顯示出對目的因子即靶有親和力并能夠特異性結合目的因子的物質。因此該術語包括通常稱作生物受體分子的物質而且包括發揮特異性結合作用的其他分子例如抗體和分子印跡聚合物。關于這點，特異性結合的性質是重要的，且有效地排除結合數種無關靶的物質；然而，不排除受體與看似無關分子結合的交叉反應，因為這一特征要求被該受體結合的兩個靶中存在共同的結構元件。通常，特異性結合的特征是與在結合測定中用作陰性對照的一種或多種無關分子的結合相比，對靶有更高的結合親和力。“分子印跡聚合物”(MIP)是包含至少部分地與聚合前已被整合到包括交聯單體的單體基質中的一種或多種模板分子對應的空穴(或空腔)的聚合物。聚合后得到的聚合物包括形狀上與模板分子對應的多個空穴。通常，MIP掩蔽(sequester)成小顆粒，從而促進模板的去除并使部分空穴開放以與類似于模板分子或與模板分子相同的靶分子相互作用。在本說明書和權利要求書中，術語MIP通常是指任何形式的MIP (可溶的以及不溶的)，含義是術語“MIP”和“MIPs”可分別與表述MIP顆粒(MIP particle)和MIP顆粒(MIP particles)互換地使用。將應理解本發明純化或使用的某些MIP是不溶性分子/實體-這是指例如根據WO 2007/095949中的原理制備的MIP的情況。由于其不溶性限制或阻止其從胃腸道進入身體 (例如，進入循環)，這些MIP尤其適合作為用于胃腸道中的藥物。換句話說，當口服時，用于本發明的不溶性MIP將大體上保持局限于胃腸道直到將其在排泄物中排泄出去。然而，根據本文提供的原理純化的MIP也可以是可溶性MIP，其在多種不同的應用中是有用的，在這些應用中不是特別關注將MIP局限于胃腸道。“抗體”是由B淋巴細胞對免疫刺激的應答產生和分泌的可溶性生物分子。在本文上下文中，該術語大多用來指多克隆抗體，即由多個B淋巴細胞克隆產生的抗體的混合物。 該術語也可指用于噬菌體展示技術中的由噬菌體顆粒編碼并與噬菌體顆粒結合的抗體或抗體片段。根據本發明純化的抗體可以是任何抗體類型，且可以是例如IgA、IgD、IgE、IgG 和IgM類型。另外，非人類的抗體種類例如單鏈抗體(例如駱駝或羊駝抗體)在該術語的范圍內。在本文上下文中，“靶分子”是受體可與其特異性結合的任何分子，且通常是當最終為某一目的使用受體時，期望純化的受體應當與其結合的分子。在本文上下文中，當討論受體與“因子”的結合時，術語“靶分子”與術語“因子”可互換地使用，但應當注意在本發明的方法中使用的“因子”不必要必須與靶分子相同-而是，因子常常是對本文討論的純化步驟有用的靶分子的模擬物或衍生物。例如因子可以構成與靶分子相比更大的分子的一部分-例如，如果期望的靶分子是氨基酸，形成蛋白質或肽的一部分的相應的氨基酸殘基也可以用作步驟b和d中的因子。例如，可設計純化工藝以富集結合氨基酸殘基的受體，其中純化中的一個步驟使用其中該氨基酸位于C端的肽，且其中另一步驟使用該氨基酸位于 N端的肽-在這種情況下，該因子是純化步驟中使用的物質，然而認為靶分子是被富集的受體有效結合的物質。同樣地，“模板分子”通常與靶分子/因子相同，但也可以是其模擬物或衍生物(即，具有至少部分地與靶分子的三維結構和組成匹配的相同的三維結構和組成的分子-例如模擬物可由靶分子的片段構成)。模板用作MIP結構中隨后將能夠結合靶分子的空腔的“發生器”。還應當注意除了用作模板的那些分子或在本文所述的本發明的方法中用作因子的那些分子，富集受體組合物(例如，MIP組合物)可發揮與其他分子的特異性結合。因此， 這些受體組合物可用于可能被篩選以用于結合潛在(且不必要相關)靶分子的文庫。這可與噬菌體展示技術比較，其中除了最初用來結合受體分子的抗原，已表明噬菌體表達的受體分子(例如，抗體文庫)與完全不同來源的分子結合。例如，在2010年8月9-12日， 新奧爾良，洛杉磯的關于分子印跡的第六次國際會議(the 6thInternational Meeting on Molecular Imprinting)上，Ecevit Yilmaz博士(SE)提出了表現出與最初用于MIP合成工藝中的模板分子結構上極其不同的分子的交叉反應的MIP的已發表的實例。另外，Yilmaz 博士提出了可用來鑒定對特定靶分子具有親和力的聚合物組合物的通用MIP文庫。這些鑒定之后，可對所選的聚合物進行本專利中所述的親和純化工藝并從而得到具有比天然未經純化的MIP更高的容量的MIP。“親和層析”表示其中使用結合在固相支持體(例如層析基質)上的捕獲物質的親和純化劑，利用受體和結合配偶體之間的特異性結合純化受體的任何方法。本領域中已知的典型實例是，使用抗體作為偶聯到層析珠上的捕獲劑以純化結合抗體的抗原的親和純化。將應理解，根據本發明使用的親和純化方法是能夠純化具有本文所述的特征的MIP顆粒的那些方法。因此，不溶性MIP的典型親和純化方法可以是本領域技術人員已知的膨脹床吸附(EBA)。在本文上下文中，“固相或半固相”是可用來通過共價或非共價結合錨定捕獲劑的任何材料。因此，常規用于制備層析材料的任何材料(塑料聚合物、糖、金屬、玻璃、硅石、橡膠等)可用作固相。固相材料可包含允許捕獲劑與所討論的材料偶合的合適官能團。這些衍生材料是蛋白質和其他大分子層析純化領域中的技術人員已知的。另外，固定相可具有允許捕獲相對較大和不溶性顆粒例如MIP (當與單個生物分子例如蛋白質相比時)的任何物理形式。因此，參考下文，固相可以是纖維形式(優選是中空的)、層析基質(優選適合 EBA的基質)、珠子(優選可通過磁性手段分離的那些珠子)或任何其他合適的形式。寡核苷酸是核苷酸的短序列，通常具有至多30個核苷酸的長度，例如至多25個、 至多20個、至多19個、至多18個、至多17個、至多16個、至多15個、至多14個、至多13 個、至多12個、至多11個、和至多核苷酸殘基。該術語覆蓋RNA和DNA寡核苷酸兩者。“寡核苷酸衍生物”意在表示衍生的寡核苷酸，其中骨架與寡核苷酸中的基本相同，但其中有在核糖骨架的糖中引入的化學變化，因此該術語將例如序列中包括LNA核苷酸的那些分子包括在其范圍內。然而，寡核苷酸衍生物也可以是寡核苷酸的模擬物例如 PNA。本發明第一方面的實施方案如以上提及，第一方面涉及制備富集與因子結合的受體的組合物的方法，其中所述受體各自特異性結合所述因子上的至少兩個不連續位點，所述方法包括a.提供包含所述受體的樣品，b.對所述樣品進行第一親和層析步驟，其中所述因子用作親和純化劑，且其中經由與所述至少兩個不連續位點的單個位點結合將所述因子固定在固相或半固相上，c.回收與所述因子結合的受體，d.對前述步驟中回收的受體進行至少一個另外的親和層析步驟，其中所述因子用作親和純化劑，且其中經由與所述至少兩個不連續位點的另一個位點結合將所述因子固定在固相或半固相上，并回收與所述因子結合的受體，其中，在每一個所述至少一個另外的親和層析步驟中，所述至少兩個不連續位點的所述另一個位點與已用于前述步驟b和d中將所述因子固定在固相或半固相上的所述至少兩個不連續位點的任何一個位點不同。因此該原理允許富集初始組合物中的那些受體，所述受體與因子上的結構結合， 這些結構包括在第一輪親和層析中因子的可及部分和在第二輪和任何隨后輪次的親和層析中因子的可及部分兩者。如以上提及，因子可以是較大分子的部分-一個實際的實例是這種情形，其中靶分子是氨基酸例如苯丙氨酸(或參考下文的其他氨基酸)以及包括所述氨基酸的短肽。為了能夠富集與所述氨基酸最佳結合的受體，技術人員可制備例如二肽，其中所述氨基酸作為N端氨基酸殘基存在且然后在第一純化步驟中將所述肽偶聯到固相或半固相上。為進一步富集，其中在隨后的純化步驟中可將現在所述氨基酸是C端殘基的二肽經由其N端偶聯到固相或半固相上。組合的步驟將富集與不是唯一參與肽鍵或構成自由N-端或C-端的所述氨基酸的部分結合的那些受體的組合物。受體通常選自由分子印跡聚合物(MIP)和多克隆抗體組成的組，其中期望獲得這些分子的富集混合物，但是這些受體也可以是例如在其表面上表達抗體片段的噬菌體顆粒群體。實際上，該技術隨后包括兩輪針對捕獲劑的淘選，捕獲劑在這兩輪中具有不同的取向。因此本發明專門可用于其中與靶分子上相關表面積的密度相比，受體具有相對較大的接觸面積的情形。第一方面的方法可適用于其中受體選自可溶性MIP或不溶性MIP的情形，且在一個實施方案中所述受體是不溶性MIP。在另一個實施方案中，所述受體是可溶性MIP。在某些實施方案中，所述受體是單特異性多克隆抗體。術語“單特異性”意在是指構成多克隆抗體的不同抗體都特異性結合同一因子。親和層析可通過技術人員已知的方法進行。例如，親和層析可能包括使用流化床系統，例如膨脹床吸附系統；當受體是不溶性懸浮分子時這是特別有用的。但是，親和層析也可以是傳統的基于柱的層析(包括HPLC和FPLC模式)，其對于可溶性受體是特別有用的。在上述實施方案中，因子可以是具有式H3N+-CH(R)-C00_的化學物質，例如氨基酸， 或因子可以是具有至多5個氨基酸殘基的肽。氨基酸通常選自苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、 亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸。另外，肽通常是其序列中包括選自由苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸組成的組的至少一種氨基酸的肽。在特別的實施方案中，這些氨基酸在肽中作為 N端氨基酸和/或C端氨基酸出現。在其中所述因子是肽的實施方案中，其通常是二肽、三肽、四肽或五肽。在上述的本發明第一和第二方面的某些其他實施方案中，因子是碳水化合物，例如具有最多10個單糖單元的支鏈的或線性的低聚糖。因此在某些實施方案中，碳水化合物選自單糖、二糖和三糖。特別感興趣的碳水化合物是D-半乳糖和乳糖。另外，因子可以是脂肪酸或脂質；在因子是脂質的情況下，其通常選自由膽固醇、 甘油三酯、和膽汁酸或其鹽組成的組。另外，因子可以是寡核苷酸或寡核苷酸衍生物，例如選自由RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸、LNA寡核苷酸、PNA寡核苷酸和混合寡核苷酸組成的組的寡核苷酸或寡核苷酸衍生物。在某些實施方案中，寡核苷酸或寡核苷酸衍生物是混合寡核苷酸，其包括至少一個核糖核苷酸單元或脫氧核糖核苷酸單元和至少一個LNA核苷酸單元或PNA核苷酸單元。通過使用凝集法而不是親和層析法，可以可替代地采用所有上述實施方案。在本發明第一方面的這些實施方案中，受體的分離通過凝集獲得，其中受體形成多個靶因子之間的“橋”。實際考虎因素現在公開的選擇/分離工藝可使用負載有由不溶性材料(典型的實例是交聯多糖、聚苯乙烯、玻璃等)制成的層析介質(基質)的柱，其中通過官能團借助(通常)共價鍵將分子(因子)偶聯在基質上。因子可以如以上提及的是氨基酸、肽、碳水化合物、膽固醇、膽汁酸、甘油三酯、脂肪酸等。將受體實體的溶液或懸液上樣到層析介質(在柱上或在膨脹床系統中)，且在選擇工藝中，對因子的暴露部分有最高親和力的受體實體或受體分子將與層析介質上的因子結合，且當從柱上洗脫下來時，這將導致提供具有比起始材料更高的親和力和更高的容量的受體實體或分子的亞群。如果對來自第一次選擇的所選受體實體或分子進行第二次選擇，但現在使用相比第一次選擇中以不同取向與層析介質偶聯的因子，結果將是識別所述因子的兩種取向的受體實體或分子的新亞群。這些雙重的或串聯的所選受體實體或分子將以比來自第一次選擇的受體實體或分子亞群更高的親和力、特異性和容量結合自由的、未結合的因子分子。一個實例是純化用苯丙氨酸作為靶聚合的MIP群。由Piletsky和合作者 (Piletsky，S.A，Andersson，H 和 Nicholls，I. A. , Polymer Journal, 37 (2005) 793-796)制備的苯丙氨酸MIP具有三個潛在靶特異性相互作用位點苯環、氨基和羧基。在使用以苯丙氨酸作為親和劑的膨脹床吸附(EBA)層析的隨后選擇或純化工藝中，苯丙氨酸分子可由氨基或由羧基(或原則上也可由苯基，如果向其提供反應基的話)結合到EBA介質上。但是，如由Piletsky在論文中以示意圖形式說明的，MIP可包含與苯基加氨基兩者、苯基加羧基、氨基加羧基、或苯基同時加氨基和羧基兩者相互作用的結合空穴。如果使用膨脹床吸附或允許通過與靶分子的親和純化不溶性顆粒的另一種方法純化苯丙氨酸MIP，且靶分子經由例如苯丙氨酸的氨基固定在層析基質上，則將選擇到具有同時與苯環和羧基最佳結合的 MIP0這一 MIP亞群可包含主要具有也可與苯環和氨基相互作用的結合空穴的另一個MIP 亞群。這種亞-亞群必須具有可與苯環、羧基和氨基同時相互作用的結合空穴。預期包括所有3個官能團的結合具有更高的親和力和更高的選擇性且將為MIP顆粒提供與主要具有僅識別三個潛在相互作用位點中的兩個的結合位點即不連續結合位點的MIP顆粒相比更高的結合容量。在第二個實例中，苯丙氨酸MIP顆粒被研磨至其變得可溶的尺寸。在那種情況下， 單獨的MIP顆粒將具有與較大的MIP顆粒相比更少的結合空穴和具有以下可能性給定的顆粒主要具有一種類型的結合空穴，即，可與苯丙氨酸分子上的所有三個官能團相互作用的結合空穴，或與苯丙氨酸的僅兩個官能團相互作用的結合空穴等。如在第一個實例中，如果在其中經由氨基將苯丙氨酸固定在層析基質上的第一次純化之后是其中經由羧基將苯丙氨酸固定在層析基質上的第二次純化，所得的亞-亞群將主要具有可通過苯環、羧基和氨基與苯丙氨酸相互作用的結合空穴。在其中MIP是可溶的情況下，層析不必要必須是膨脹床吸附層析，而可以是常規的填充床層析。在第三個實例中，針對具有復雜表位集合和高度立體化學的抗原例如單糖或二糖產生抗體。當將糖因子偶合到層析基質上以親和純化抗體時，僅總集的一部分表位被暴露。 用所述取向的因子純化的抗體分子的亞群還可包括識別以所述取向暴露的表位加上當因子取向不同時暴露的表位集的組合的抗體分子的另一亞群。如果將第一亞群上樣到具有以另一取向偶聯的糖因子的第二層析柱上，可選擇到這種第二亞群。這種第二亞群可具有比第一亞群和天然未經純化的抗體兩者更高的親和力、更高的選擇性和更高的結合容量。本發明第二方面的實施方案第一方面中所述的本發明的方法得到與包括由用于每一個層析步驟中的所有那些官能團所界定的結合空穴的靶因子上的表面區域結合的受體的富集組合物。然而，不能排除的是，由于來自因為其不與因子上的兩個相關不連續結合位點結合而隨后被排除的受體的競爭，一部分的期望多位點結合受體在第一層析步驟中被排除掉。當根據本發明的原理制備受體的富集組合物時，為了完全利用靶上的多個結合空穴，因此一個有利的方法是在每一步驟中平行地進行多個親和層析程序，其中不同的程序利用因子借助于因子上的不同不連續位點與層析基質的結合-在此之后，對第一步驟中富集的材料進行隨后的步驟，在步驟的程序中仍然使用不同不連續結合位點。最后，匯集來自連續純化步驟的每個“臂”的富集組合物。這保證每個層析步驟的施加次序不會導致非故意排除實際上能夠結合因子上期望的大區域的受體。這一方法的一個簡單版包括使用經由兩個不同官能團結合因子將包含受體分子的樣品分成兩個部分，對該兩個部分都使用本發明第一方面的方法，但是將層析步驟的次序顛倒；最后，匯集所得到的兩個富集部分。更通常構想的本發明的這個第二方面涉及制備富集與因子結合的受體的組合物的方法，其中所述受體各自特異性結合所述因子上的至少兩個不連續位點，所述方法包括根據本發明第一方面和其任何實施方案的方法制備至少兩種組合物并隨后組合所述至少兩種組合物以獲得富集與所述因子結合的受體的組合物，其中在制備所述至少兩種組合物中的步驟b和d中使用相同因子，且其中i.對于至少兩種組合物，用于固定到固相或半固相上以制備所述至少兩種組合物的每一種的所述因子中的不連續位點的組合不同，和/或ii.在制備所述至少兩種組合物的至少兩種的過程中，用于固定到固相或半固相上以制備所述至少兩種組合物的每一種的所述因子中的不連續位點的使用順序不同。這一方面的優選的實施方案是其中當制備至少兩種組合物的每一種時，因子中的相同不連續位點被用于固定的那些實施方案，其中至少兩種組合物的數目等于至少兩個不連續位點的數目，且其中對于至少兩種組合物的每一種來講，用于固定到固相或半固相上以制備所述至少兩種組合物的每一種的不連續位點的使用順序是唯一的。通常，不連續位點的數目是2或3。本發明第三方面的實施方案本發明的第三方面涉及治療、改善或預防選自由苯丙酮尿癥(PKU，福蘭格氏病)、 高苯丙氨酸血癥(HPA)、尿黑酸尿癥(黑尿病)、酪氨酸血癥、高酪氨酸血癥、重癥肌無力、組氨酸血癥、尿刊酸尿癥、楓糖尿癥(MSUD)、異戊酸血癥(異戊酰輔酶A脫氫酶缺乏癥)、高胱氨酸尿癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥、和1型戊二酸尿癥(GA-I)、半乳糖血癥組成的組的疾病的方法，所述方法包括向需要其的患者的胃腸道施用有效量的分子印跡聚合物(MIP) 組合物，所述組合物能夠結合所述疾病的癥狀弓I發劑。已知幾種先天性代謝錯誤，其中天然存在的氨基酸代謝的功能障礙導致代謝產物的病理濃度的積累或這些氨基酸自身的積累。對患這些疾病的個體來講，不得不控制每日攝食以避免這些代謝產物的積累。典型的實例是疾病苯丙酮尿癥。患這種疾病的個體缺乏酶苯丙氨酸羥化酶(PAH)。 這種酶是將氨基酸苯丙氨酸代謝成氨基酸酪氨酸所必需的，導致苯丙氨酸聚積在患者體內且被轉化成代謝產物苯丙酮酸。如果不治療，這種情況可能會導致大腦發育問題，導致進行性智力低下，和其他神經方面的問題。如今用低苯丙氨酸飲食的組合治療苯苯丙酮尿癥，其經常與以降低血液苯丙氨酸水平為目標的治療方案結合以達到安全且無毒的濃度范圍。將苯丙氨酸水平降低至安全范圍可通過將低苯丙氨酸膳食與藥物治療結合來實現。本發明提供現有治療方案的有吸引力的替代方案。通過口服特異性結合苯丙氨酸和含苯丙氨酸的短肽的MIP組合物(通常是由于其不溶性將確定無疑地不能穿過胃腸道粘膜的不溶性MIP)，可避免或減少毒性量的苯丙氨酸進入血流。另外，這些MIP在胃腸道中的存在將把游離的苯丙氨酸“拖”到胃腸道粘膜上(通過簡單地為胃腸道中的結合的苯丙氨酸提供較大容量)，從而降低其血液濃度。這一特別原理通常適用于多種其他疾病，在這些疾病中由于缺乏代謝酶發生游離氨基酸和/或其代謝產物的積聚。原則上，不溶性MIP的任何組合物在這一方法中是有用的，但是如WO 2007/095949中所表明的，不溶性MIP的典型組合物包括大量的不結合期望靶分子的MIP-結果，這些組合物必須以非常大的量施用，然而根據WO 2007/095949中公開的方法或根據本發明的方法制備的組合物將由于其基本上沒有不結合性MIP而有效得多。 根據本發明制備的MIP組合物(和根據WO 2007/095949制備的那些組合物)的特別有吸引力的特征是這樣的事實這些MIP將不但結合所討論的游離氨基酸而且結合在其氨基酸序列中包括相關氨基酸的短肽。因此本發明的該第三方面的重要實施方案使得MIP組合物基本上不含不結合所述癥狀引發劑的MIP。因此，通過口服結合相應的靶(即，疾病引發劑)的MIP對以下指出的先天性代謝錯誤的治療優選通過使用根據2007/095949中公開的方法制備的不溶性MIP且更優選根據本發明第一和第二方面包括其所有實施方案制備的不溶性MIP的組合物進行。
權利要求
1.一種制備富集與因子結合的受體的組合物的方法，其中所述受體各自特異性結合所述因子上的至少兩個不連續位點，所述方法包括a.提供包含所述受體的樣品，b.對所述樣品進行第一親和層析步驟，其中所述因子用作親和純化劑，且其中經由與所述至少兩個不連續位點的單個位點結合將所述因子固定在固相或半固相上，c.回收與所述因子結合的受體，d.對前述步驟中回收的受體進行至少一個另外的親和層析步驟，其中所述因子用作親和純化劑，且其中經由與所述至少兩個不連續位點的另一個位點結合將所述因子固定在固相或半固相上，并回收與所述因子結合的受體，其中，在每一個所述至少一個另外的親和層析步驟中，所述至少兩個不連續位點的所述另一個位點與已用于前述步驟b和d中將所述因子固定在固相或半固相上的所述至少兩個不連續位點的任何一個位點不同。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述受體選自由分子印跡聚合物(MIP)和多克隆抗體組成的組。
3.根據權利要求2所述的方法，其中所述受體選自可溶性MIP或不溶性MIP。
4.根據權利要求3所述的方法，其中所述受體為不溶性MIP。
5.根據權利要求3所述的方法，其中所述受體為可溶性MIP。
6.根據權利要求2所述的方法，其中所述受體為單特異性多克隆抗體。
7.根據前述權利要求任一項所述的方法，其中所述親和層析包括使用流化床系統，例如膨脹床系統。
8.根據前述權利要求任一項所述的方法，其中所述因子是具有式H3N+-CH(R)-COO-的化學物質，例如氨基酸或具有至多5個氨基酸殘基的肽。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述氨基酸選自苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸。
10.根據權利要求8所述的方法，其中所述肽在其序列中包括選自由苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸組成的組的至少一種氨基酸。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述肽在N端、在C端或在兩端具有選自由苯丙氨酸、酪氨酸、組氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、色氨酸、蘇氨酸、纈氨酸和賴氨酸組成的組的氨基酸。
12.根據權利要求8或10所述的方法，其中所述肽為二肽、三肽、四肽或五肽。
13.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中所述因子是碳水化合物。
14.根據權利要求13所述的方法，其中所述碳水化合物是具有最多10個單糖單元的支鏈或線性低聚糖。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述碳水化合物選自單糖、二糖和三糖。
16.根據權利要求15所述的方法，其中所述碳水化合物選自D-半乳糖和乳糖。
17.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中所述因子是脂肪酸或脂質。
18.根據權利要求17所述的方法，其中所述因子是選自由膽固醇、甘油三酯、和膽汁酸或其鹽組成的組的脂質。
19.根據權利要求1-6任一項所述的方法，其中所述因子是寡核苷酸或寡核苷酸衍生物。
20.根據權利要求19所述的方法，其中所述寡核苷酸或寡核苷酸衍生物選自由RNA寡核苷酸、DNA寡核苷酸、LNA寡核苷酸、PNA寡核苷酸和混合寡核苷酸組成的組。
21.根據權利要求19所述的方法，其中所述寡核苷酸是混合寡核苷酸，所述混合寡核苷酸包括至少一個核糖核苷酸單元或脫氧核糖核苷酸單元和至少一個LNA核苷酸單元或 PNA核苷酸單元。
22.—種制備富集與因子結合的受體的組合物的方法，其中所述受體各自特異性結合所述因子上的至少兩個不連續位點，所述方法包括按照根據前述權利要求任一項所述的方法制備至少兩種組合物并隨后組合所述至少兩種組合物以獲得富集與所述因子結合的受體的組合物，其中在制備所述至少兩種組合物中的步驟b和d中使用相同因子，且其中iii.對于所述至少兩種組合物，用于固定到固相或半固相上以制備所述至少兩種組合物的每一種的所述因子中的不連續位點的組合不同，和/或iv.在制備所述至少兩種組合物的至少兩種的過程中，用于固定到固相或半固相上以制備所述至少兩種組合物的每一種的所述因子中的不連續位點的使用順序不同。
23.根據權利要求22所述的方法，其中當制備所述至少兩種組合物的每一種時所述因子中的相同不連續位點用于固定，其中所述至少兩種組合物的數目等于所述至少兩個不連續位點的數目，且其中對于所述至少兩種組合物的每一種來講，用于固定到固相或半固相上以制備所述至少兩種組合物的每一種的所述不連續位點的使用順序是唯一的。
24.根據權利要求22或23所述的方法，其中所述不連續位點的數目為2或3。
25.一種治療、改善或預防選自由苯丙酮尿癥(PKU，福蘭格氏病)、高苯丙氨酸血癥 (HPA)、尿黑酸尿癥(黑尿病)、酪氨酸血癥、高酪氨酸血癥、重癥肌無力、組氨酸血癥、尿刊酸尿癥、楓糖尿癥(MSUD)、異戊酸血癥(異戊酰輔酶A脫氫酶缺乏癥)、高胱氨酸尿癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥和1型戊二酸尿癥(GA-I)、半乳糖血癥組成的組的疾病的方法，所述方法包括向需要其的患者的胃腸道施用有效量的分子印跡聚合物(MIP)組合物，所述組合物能夠結合所述疾病的癥狀弓I發劑。
26.根據權利要求25所述的方法，其中所述MIP組合物基本不含不結合所述癥狀引發劑的MIP。
27.根據權利要求25或沈所述的方法，其中所述MIP組合物根據權利要求I-M任一項所述的方法或根據WO 2007/095949中公開的方法制備。
28.一種制備藥物組合物的方法，所述方法包括根據權利要求I-M任一項所述的方法制備組合物并隨后將所述組合物與藥學上可接受的載體、稀釋劑或媒介物混合。
29.根據權利要求28所述的方法，其中制備所述藥物組合物以適合口服。
全文摘要
公開了制備富集與因子結合的受體(通常是分子印跡聚合物，MIP)的組合物的方法，其中所述受體各自特異性結合所述因子上的至少兩個不連續位點，所述制備是通過對受體樣品進行使用所述因子的第一親和純化步驟，其中所述因子上的一個結合位點是受體結合不可及的，并隨后對純化的受體進行使用所述因子的至少一個另外的親和純化步驟，其中所述因子上的第二結合位點是不可及的。還公開了治療、改善或預防選自由苯丙酮尿癥(PKU，福蘭格氏病)、高苯丙氨酸血癥(HPA)、尿黑酸尿癥(黑尿病)、酪氨酸血癥、高酪氨酸血癥、重癥肌無力、組氨酸血癥、尿刊酸尿癥、楓糖尿癥(MSUD)、異戊酸血癥(異戊酰輔酶A脫氫酶缺乏癥)、高胱氨酸尿癥、丙酸血癥、甲基丙二酸血癥和1型戊二酸尿癥(GA-1)、半乳糖血癥組成的組的疾病的方法，所述方法包括向需要其的患者的胃腸道施用有效量的分子印跡聚合物(MIP)組合物，所述組合物能夠結合所述疾病的癥狀引發劑。
文檔編號B01J20/26GK102548629SQ201080041158
公開日2012年7月4日 申請日期2010年9月16日 優先權日2009年9月16日
發明者克勞斯·格利高里斯, 尼古拉斯·奧托·克羅赫 申請人:米普薩盧斯公司