用于反義寡核苷酸遞送的脂質納米顆粒組合物的制作方法

用于反義寡核苷酸遞送的脂質納米顆粒組合物的制作方法
【專利摘要】本發明描述了脂質納米顆粒組合物，其包含與聚合物綴合的大分子和靶向劑。該組合物可包含治療劑。所述治療劑可以是反義寡核苷酸(ASO)。示例性ASO靶向編碼Akt-1之核酸的一部分并且調節Akt-1的表達；或者靶向編碼HIF-1之核酸的一部分并且調節HIF-1的表達。本發明還描述了包含與聚合物綴合之大分子和治療劑的脂質納米顆粒組合物，所述治療劑是ASO，例如靶向編碼Akt-1之核酸的一部分并且調節Akt-1之表達的ASO；或者靶向編碼HIF-1之核酸的一部分并且調節HIF-1之表達的ASO。本發明還公開了藥物制劑、制備所述脂質納米顆粒的方法和使用所述脂質納米顆粒的方法，例如用于治療癌癥。
【專利說明】用于反義寡核苷酸遞送的脂質納米顆粒組合物
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求于2012年5月23日提交的美國臨時申請No. 61/650,729和2013年 3月14日提交的美國臨時申請No. 61/784, 892的優先權，其內容通過引用整體并入本文。
[0003] 關于聯邦資助研究的聲明
[0004] 本發明在美國國立衛生研究院授予的資助號R01CA135243、DK088076和CA152969 的政府支持下作出。政府享有本發明的某些權利。
[0005] 序列表
[0006] 本申請包含序列表，其已通過EFS網以ASCII形式提交，并且通過引用整體并入本 文。所述ASCII拷貝創建于2013年5月23日，命名為41890-349711_SL. txt，并且大小為 3, 404字節。

【技術領域】
[0007] 本公開內容描述了可用于遞送核酸的脂質納米顆粒及相關的化合物。

【背景技術】
[0008] SiRNA及其他治療性寡核苷酸的遞送是限制其臨床轉化（translation)之潛能的 主要技術挑戰。
[0009] 脂質體是由一個或更多個脂質雙層構成的囊泡，其能夠在水性核心內攜帶親水分 子或者在其脂雙層內攜帶疏水分子。脂質納米顆粒（LN)是用于描述亞微米范圍的基于脂 質之顆粒的通用術語。它們可具有脂質體的結構特征和/或具有作為替代的非雙層型結 構。通過LN經全身途徑遞送藥物需要克服若干生理屏障。網狀內皮系統（RES)可負責從 循環中清除LN。LN -旦逃離血管系統并達到靶細胞，即通常通過內吞作用而被攝取，并且 必須在酸性內體條件中降解之前將藥物釋放到胞質中。
[0010] 在制備LN時必須考慮4電位或表面電荷。對于全身遞送而言，LN的4電位通 常不應過于正或過于負。帶有過多正電荷的LN傾向于與靶細胞和循環血漿蛋白非特異性 地相互作用，并且可引起細胞毒性。或者，帶有過多負電荷的LN不能有效并入同樣帶負電 的核酸中，而且可引起RES介導的迅速清除，從而降低治療效力。中性至帶有適度電荷的LN 最適于體內藥物和基因遞送。
[0011] LN構成了用于遞送傳統治療性化合物和基于核酸之治療劑的有前景的平臺。使 用LN配制的藥物通常可在體內表現出優越的藥代動力學（PK)特性，例如血液循環時間提 高和由于增強的透性和滯留（EPR)效應在實體瘤處的積累提高。此外，LN可在表面包被聚 乙二醇以降低由血清蛋白引起的LN的調理作用以及所導致的RES介導的攝取。LN還可用 細胞特異性配體包被以提供靶藥物遞送。
[0012] 在過去的幾十年中，對基于核酸的治療劑出現了很大的關注。基于核酸的治療 劑在引入核酸（NA)以促進或抑制基因表達的前提之下起作用。由于認為基因突變和 miRNA譜改變是癌癥及其他疾病的根本原因，所以基于核酸的試劑可潛在地直接作用于該 根本病因，使治療潛能最大化。基于核酸的治療劑的幾個實例包括質粒DNA(pDNA)、小干 擾 RNA(siRNA)、小發夾 RNA(shRNA)、微 RNA(miR)模擬物（mimic 或 mimetic)、anti-miR/ antagomiR/miR抑制劑和反義寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO)，其均包括在 本公開內容所用術語核酸的范圍內。基于核酸的治療劑的臨床轉化在其實施中面臨若干障 礙。將核酸運輸至其胞內靶標特別有挑戰性，因為核酸相對不穩定，并且易于被血清和細胞 核酸酶降解。此外，核酸上的大量負電荷也使其不能跨細胞膜運輸，這限制了其實用性。已 經開發了病毒載體來解決這個問題，但是大多數都因為體內免疫應答的活化和在宿主基因 組中誘導了非期望的突變而失敗。也對非病毒載體進行了廣泛的研究，但是只有很少取得 了成功的臨床結果，而且還需要進一步改進。
[0013] 傳統上，已經使用陽離子LN作為非病毒載體用于基因遞送。在一些實例中，用陰 離子脂質來代替陽離子脂質或者將陽離子脂質與陰離子脂質組合使用。陽離子LN的正電 荷有助于與帶負電核酸的靜電相互作用。可以將陰離子脂質與陽離子脂質或陽離子聚合物 組合，這將進而介導與核酸的相互作用。這些可通過本領域中已知的多種技術來制備，例 如，乙醇稀釋、凍融、滲濾和薄膜水合。除了陽離子組分以外，LN通常還包含輔助脂質，其包 括形成雙層的磷脂組分，例如磷脂酰膽堿及膽固醇。輔助脂質（例如二油酰基磷脂酰乙醇 胺（DOPE))并不利于雙層相，反而有助于在靶部位處破壞脂質雙層，以釋放治療劑。可以 添加穩定用組分，例如D-a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS)(其為PEG化劑）或 mPEG-DSPE來穩定制劑并保護LN免受RES介導的攝取。
[0014] 開發高效遞送載劑是寡核苷酸（ON)治療劑之臨床轉化的關鍵。理想地，脂質納米 顆粒制劑應能夠（1)保護藥物免受酶促降解；（2)穿過毛細血管內皮；（3)特異性地達到靶 細胞類型而不引起免疫原性或脫靶細胞毒性；(4)促進內吞作用和內體釋放；以及（5)形成 具有膠體穩定性和長貨架期（shelf-time)的穩定制劑。
[0015] 發明概述
[0016] 本文中提供了脂質納米顆粒，其可高效包封治療性寡核苷酸并且滿足有效遞 送的物理學和生物學標準。在本發明中，某些實施方案包括含RX〇2〇i( Archexiir5)和/或RX-0047的脂質納米顆粒，其中所述rx〇2〇i ( Archexink )是20聚體硫代 磷酸酯反義寡核苷酸，其具有包含針對Akt-I之5' gctgcatgatctccttggcg3'（Seq. Id. No. :1)的序列，所述RX-0047是20聚體硫代磷酸酯反義寡核苷酸，其具有包 含 5' aatgagccaccagtgtccaa3'（Seq. Id.No. :2)的序列，RX-0047 是"缺氧誘導因 子-I a "（HIF-1 a )的強效抑制劑。
[0017] 在某些實施方案中，脂質納米顆粒包含高度陽離子化和/或pH-響應的HSA聚合 物綴合物。在某些實施方案中，HSA-聚合物綴合物包括HSA-PEHA。在某些實施方案中，月旨 質納米顆粒使白蛋白-聚合物綴合物（albumin-polymer conjugate, APC)高度陽離子化， 以提高脂質納米顆粒制劑的轉染效率。
[0018] 本文中還提供了藥物組合物，制備脂質包被的白蛋白納米顆粒的方法及治療癌癥 或其他疾病的方法。
[0019] 在一些實施方案中，本發明是脂質納米顆粒組合物，其包含與聚合物綴合的大分 子和靶向劑。在一些實施方案中，所述脂質納米顆粒組合物還包含治療劑，例如核酸、蛋白 質、多糖、脂質、放射性物質、治療劑、前藥及其組合。在一些實施方案中，所述治療劑是核 酸。在一些實施方案中，所述核酸是pDNA、反義寡核苷酸、11111?、3111：；[1]111?、8111?嫩、811?嫩或其 組合。在一些實施方案中，所述治療劑是反義寡核苷酸（ASO)，其可以是靶向編碼Akt-I之 核酸的一部分并且調節Akt-I之表達的ASO ;或者可以是靶向編碼HIF-I之核酸的一部分 并且調節HIF-I之表達的AS0。
[0020] 本發明的一些實施方案還包括脂質納米顆粒組合物，其包含與聚合物綴合的大分 子和治療劑，所述治療劑為AS0,例如靶向編碼Akt-I之核酸的一部分并且調節Akt-I之表 達的ASO ;或者靶向編碼HIF-I之核酸的一部分并且調節HIF-I之表達的AS0。
[0021] 在本發明的任意實施方案中，聚合物可以是帶電的，例如，聚合物可以是帶正電 的。在本發明的一些實施方案中，大分子包含白蛋白。在一些示例性實施方案中，與聚合物 綴合的大分子是白蛋白-聚陽離子綴合物。綴合可以例如通過交聯劑。所述大分子或帶正 電的聚合物可以是例如五亞乙基六胺（PEHA)、四亞乙基六胺和四亞乙基五胺（TEPA)。在一 些實施方案中，所述大分子包含五亞乙基六胺（PEHA)，并且所述聚合物包含人血清白蛋白 (HSA)。PEHA分子與HSA分子之比可為約11 : 1。本發明的脂質納米顆粒可包含兩種或更 多種低分子量聚合物的混合物。所述脂質納米顆粒可包含D0TAP、SPC和TPGS，例如摩爾比 為約 25 : 70 : 5 的 DOTAP : SPC : TPGS。
[0022] 在包括ASO的一些實施方案中，所述反義寡核苷酸是具有包含 5' gctgcatgatctccttggcg3'（Seq.Id.No. :1)之序列的化合物，其革巴向編碼人Akt-I的 核酸分子并且調節Akt-I的表達。在另一些實施方案中，所述反義寡核苷酸是具有包含 5'aatgagccaccagtgtccaa3'（Seq.Id.No. :2)之序列的化合物，其革巴向編碼人HIF-1之核 酸分子并且調節HIF-I的表達。所述脂質納米顆粒組合物還可包含融合肽。在一些實施方 案中，所述脂質納米顆粒的顆粒大小小于約300nm或者小于約150nm。
[0023] 所述靶向劑可通過直接連接或通過交聯劑只與脂質納米顆粒的外表面相結合。 所述靶向劑可以是抗體或抗體片段。所述靶向劑還可以是cRGD肽、含半乳糖的部分、轉 鐵蛋白、葉酸、低密度脂蛋白和表皮生長因子。在一些示例性實施方案中，所述靶向劑是 cRGDfC或葉酸。所述靶向劑可以是綴合物，例如葉酸-PEG-CHEMS (葉酸-聚乙二醇-半 琥珀酸膽固醇酯）、葉酸-PEG-DSPE(葉酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）或 cRGDfC-PEG-DSPE (環（RGDfC)-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）。
[0024] 在一些實施方案中，本發明是包含如上所述脂質納米顆粒組合物和可藥用賦形劑 的藥物組合物。所述藥物組合物可制備成無菌溶液或混懸液。
[0025] 在另一些實施方案中，本發明是制備脂質包被的白蛋白納米顆粒（LCAN)的方法， 其中所述方法包括以下步驟：合成HSA-PEHA綴合物；制備脂質混合物；向HSA-PEHA綴合 物中添加脂質混合物；向脂質和HSA-PEHA綴合物的混合物添加反義寡核苷酸（ASO)以 得到LCAN前體；其中ASO選自：靶向編碼Akt-I之核酸的一部分并且調節Akt-I之表達 的ASO ;和靶向編碼HIF-I之核酸的一部分并且調節HIF-I之表達的AS0。在另一些實施 方案中，本發明是制備脂質包被的白蛋白納米顆粒（LACN)的方法，其包括以下步驟：合成 HSA-PEHA綴合物；制備脂質混合物；以及向HSA-PEHA綴合物添加靶向劑和脂質混合物。所 述靶向劑可以是上述的任意靶向劑。在一些實施方案中，脂質混合物包含并且靶向劑包 括 DOTAP、soyPC、TPGS 和 cRGDfC-PEG-DSPE，例如，其中摩爾比為約 25 : 70 : 4 : 1 的 DOTAP : soyPC : TPGS : cRGD-PEG-DSPE。在另一些實施方案中，所述脂質混合物包含（例 如摩爾比為約 25 : 70 : 5 的）D0TAP、SP(^PTPGS。
[0026] 本發明還是通過向有此需要的患者施用有效量的本文中所述藥物組合物來診斷 或治療癌癥或感染性疾病的方法。所治療的癌癥可以是例如腦癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑 素瘤、皮膚癌、表皮癌、結腸直腸癌（colon and rectal cancer)、非霍奇金淋巴瘤、子宮內 膜癌、胰腺癌（pancreatic cancer)、腎（腎細胞）癌、前列腺癌、白血病、甲狀腺癌、頭頸部 癌（head and neck)、卵巢癌、肝細胞癌、宮頸癌（cervical cancer)、肉瘤、胃癌、多發性骨 髓瘤、淋巴瘤、胃腸癌（gastrointestinal cancer)和子宮癌。在一些實施方案中，所述癌 癥是乳腺癌、表皮癌或胰腺癌。
[0027] 考慮到下述描述、附圖以及非限制性實施例，本發明的其他目的和優點以及優選 實施方案的結構和功能將變得明顯。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖 1 示出在用 L-RX-0047 和 cRGD-L-RX-0047 處理之后，MDA-MB-435 細胞中 HIF-I amRNA 下調。
[0029] 圖2示出用游離的RX-0047、L-RX-0047和LCAN-RX-0047處理之后，KB細胞中 HIF-I amRNA 的表達。
[0030] 圖3示出在用LCAN-RX-0201處理之后，KB細胞中Akt-ImRNA下調。
[0031] 圖4示出在LCAN-RX-0201處理之后，Panc-I細胞中Akt-ImRNA下調。
[0032] 圖5示出在KB異種移植物腫瘤模型中的體內腫瘤抑制。用3mg/kg的PBS、游離的 RX-0047、L-RX-0047或LCAN-RX-0047對小鼠（每組5只小鼠）進行靜脈注射，每3天4次 (Q3DX4)。通過每3至4天用卡尺測量來測定腫瘤尺寸。
[0033] 圖6示出在KB異種移植物腫瘤模型中的體內HIF-I a mRNA表達。用3mg/kg的 PBS、游離的RX-0047、L-RX-0047或LCAN-RX-0047對小鼠（每組5只小鼠）進行靜脈注射， 每3天4次（030父4)。通過實時1?1'-?〇?來測定11正-1(11111?敵的腫瘤內（;[111:四1：111]1〇四1)表 達。
[0034] 圖7示出在KB異種移植物腫瘤模型中用LCAN-RX-0047處理之后的動物存活。用 3mg/kg的PBS、游離的RX-0047或LCAN-RX-0047對小鼠（每組10只小鼠）進行靜脈內注 射，每3天4次（Q3DX4)。
[0035] 發明詳述
[0036] 本文中在脂質納米顆粒的上下文中描述了許多實施方案。本領域普通技術人員將 認識到，以下實施方案的詳細描述僅是示例性的，而非旨在以任何方式進行限制。在本公開 內容的教導下，對于本領域技術人員而言提出其他實施方案是容易的。在本文中提及"實施 方案"、"方面"或"實施例/實例"表示這樣描述的本發明之實施方案可包括特定特征、結構 或特性，但并非每個實施方案都必然包括所述特定特征、結構或特性。此外，重復使用短語 "在一個實施方案中"盡管可以指同一實施方案，但并非必然指同一實施方案。
[0037] 為了清楚起見，本文中并未示出和描述本文所述實施或方法的全部常規特征。當 然將理解，在研發任何這樣的實際實施時，將作出許多實施特異性的決定以實現具體目標， 例如依從施用、治療和對象相關的限制，而且這些具體的目的將在實施之間不同并且在使 用者之間不同。此外，將理解，這樣的開發工作可能是復雜且耗時的，但在本公開內容的教 導下，這對于本領域普通技術人員而言不過是常規工作。
[0038] 本文只不過提供了具有提高的轉染活性的脂質納米顆粒（LN)。所述脂質納米顆粒 可以分隔脂質膜內的疏水分子和/或包封水性核心內的水溶性顆粒。LN制劑可包含單一脂 質或脂質混合物，一般包含帶電脂質和中性脂質，并且任選地還包含PEG化脂質和/或膽固 醇。本公開內容的LN制劑可包含白蛋白-聚合物綴合物。在某些實施方案中，所述脂質納 米顆粒包含高度陽離子化的白蛋白-聚陽離子綴合物（APC)。LN的直徑可小于300nm，或者 通常為約50nm至約200nm。根據本發明的LN(尤其是在見于全身施用期間的高血清條件 下）可表現出一個或更多個優點，例如提高的轉染和降低的細胞毒性。LN適用于范圍廣泛 的現有治療劑和系統，并且可表現出血清穩定性、靶向遞送和/或高轉染效率。
[0039] 本文中使用的術語"脂質納米顆粒"是指任何由一種或更多種脂質組分形成的囊 泡。本文中所述的LN制劑可包括陽離子脂質。陽離子脂質是在任何生理pH下均攜帶凈 正電荷的脂質。正電荷用于通過靜電相互作用與帶負電的治療劑（例如AS0)締合。合適 的陽離子脂質包括但不限于3P-[N-(N'，N' -二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]膽固醇鹽 酸鹽（DC-Chol) ;1，2-二油酰基-3-三甲基銨-丙烷（DOTAP) ;1，2-二油酰基-3-二甲基 銨-丙烷（DODAP);二甲基二（十八烷基）溴化銨鹽（DDAB) ;1，2-二月桂酰基-sn-甘油 基-3-乙基磷酸膽堿氯化物（DL-EPC) ;N-[l-(2,3-二油酰基氧基）丙基]-N-N-N-三甲基氯 化銨（DOTM) ;N-[1-(2, 3-二油酰基氧基）丙基]-N-N-N-二甲基氯化銨（DODM) ;1，2-二 月桂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸膽堿氯化物（DOTM) ;N，N-二（十八烷基）-N，N-二 甲基氯化銨（DODAC) ;N-(1_(2,3-二油酰基氧基）丙基）-N_2_(精胺羧酰胺）乙基）_N， N-二甲基銨三氟乙酸鹽（DOSPA) ;1，2_二肉豆蘧基氧基丙基-3-二甲基羥乙基溴化銨 (DMRIE);二（十八烷基）酰胺基甘氨酰精胺（DOGS);與陽離子修飾基團綴合的中性脂質； 及其組合。此外，可以使用作為市售制劑的多種陽離子脂質，例如LIP0FECTIN(來自GIBCO/ BRL)、LIPOFECTAMINE(來自 GIBCO/MRL)、siPORT NEOFX(來自 Applied Biosystems)、 TRANSFECTAM(來自 Promega)和 TRANSFECTIN(來自 Bio-Rad Laboratories，Inc.)。本領 域中已知的或者以后開發的其他陽離子脂質也可在本發明中使用。本領域技術人員將認識 至IJ，有更多種陽離子脂質適合包含在本發明的LN制劑中。本公開內容的陽離子脂質可在制 劑中以脂質的約〇至約60. 0摩爾百分比的濃度存在，或者可在制劑中以脂質的約5. 0至約 50.0摩爾百分比的濃度存在。本文使用的"制劑"指脂質包被的白蛋白納米顆粒（LCAN)， 其包含本文中限定的含核酸的脂質納米顆粒和陽離子化的白蛋白-聚合物綴合物。所述制 劑還包含靶向劑（如果存在的話）。
[0040] 本文公開的LN制劑可包含陰離子脂質。陰離子脂質是在生理pH下攜帶凈負電荷 的脂質。這些脂質在與陽離子脂質組合時用于降低LN的總表面電荷，和引入LN雙層結構 的pH依賴的破壞，通過在酸性pH下引起非薄層（nonlamellar)相或者引起與細胞膜融合 來促進核苷酸釋放。合適的陰離子脂質的實例包括但不限于脂肪酸，例如油酸、亞油酸和亞 麻酸；半琥珀酸膽固醇酯（CHEMS) ;1，2-二-0-十四烷基-sn-甘油基-3-磷-(l'-rac-甘 油）（二醚PG) ;1，2_二肉豆蘧酰基-sn-甘油基-3-磷-(l'-rac-甘油）（鈉鹽）；1，2_二 肉S?蘧酰基-sn-甘油基-3-磷-L-絲氨酸（鈉鹽）；1_十六燒酰基，2_(9Z，12Z)十八碳 二烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯；1，2_二油酰基-sn-甘油基-3-[磷-rac-(l-甘油）] (DOPG);二油酰基磷脂酸（DOPA)和1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷-L-絲氨酸（DOPS); 與中性脂質綴合的陰離子修飾基團及其組合。本領域中已知或者以后開發的其他陰離子脂 質也可在本發明中使用。本公開內容的陰離子脂質以制劑的約0至約60. 0摩爾百分比的 濃度存在，或者以制劑的約5. 0至約25. 0摩爾百分比的濃度存在。
[0041] 帶電LN有利于轉染，但可能發生脫靶效應，例如細胞毒性和RES介導的攝取。為了 減弱細胞毒性和/或RES介導的攝取，可以使親水性分子（例如，聚乙二醇（PEG))與脂質錨 定物（anchor)綴合，并且包含在本文所述的LN中以阻礙LN聚集或者與膜相互作用。親水 性聚合物可與脂質組分共價鍵合或者使用交聯劑與官能團（例如，胺）綴合。用于綴合的合 適的親水性聚合物和親水性聚合物綴合物包括但不限于：聚乙烯醇（PVA);聚山梨酯80 ;1， 2_二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-PEG2000 (DSPE-PEG2000);琥珀酸D- a -生 育酚聚乙二醇lOOO(TPGS);二肉豆蘧酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000(DMPE-PEG2000)和二棕 櫚酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000 (DPPE-PEG2000)。本領域中已知的或者以后開發的其他親水 性聚合物也可在本發明中使用。親水性聚合物可以以制劑的約〇至約15. 0摩爾百分比的 濃度存在，或者制劑的約5.0至約10. 0摩爾百分比。所用親水性聚合物（例如PEG)的分 子量可以為約IOODa至約10, OOODa、約IOODa至約5, OOODa或者約IOODa至約2, OOODa。
[0042] 本文所述LN還可包含中性脂質和/或兩親性脂質作為輔助脂質。這些脂質用于 穩定制劑，降低體內清除，或者提高轉染效率。LN可配制于糖類溶液中以促進冷凍穩定性 (Iyostability)和低溫穩定性（cryostability)，所述糖類例如但不限于葡萄糖、山梨醇、 蔗糖、麥芽糖、海藻糖、乳糖、纖維二糖、棉子糖、麥芽三糖、葡聚糖或其組合。
[0043] 中性脂質在生理pH下具有零凈電荷。本文中公開的任何LN制劑均可包含 一種中性脂質或數種中性脂質的組合。合適的中性脂質包括但不限于：磷脂酰膽堿 (PC)、磷脂酰乙醇胺、神經酰胺（ceramide)、腦苷脂（cerebroside)、前列腺素、鞘磷脂 (sphingomyelin)、腦磷脂、膽固醇、甘油二酯、糖基化的甘油二酯、異戊二烯醇（prenol)、溶 酶體PLA2底物、N-酰基甘氨酸及其組合。
[0044] 其他合適的脂質包括但不限于：磷脂酰膽堿、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 甘油、磷脂酰膽堿和溶血磷脂酰乙醇胺；固醇，例如膽固醇、鏈留醇（demosterol)、谷甾 醇、酵母留醇、薯蕷皂苷配基、羊毛留烯醇、豆留醇、烯膽固烷醇（lathosterol)和脫氫 表雄酮；和鞘脂類，例如鞘氨醇、神經酰胺、鞘磷脂、神經節甘脂、鞘糖脂、磷酸神經鞘脂 (phosphosphingolipid)、植物鞘胺醇（phytoshingosine);及其組合。
[0045] 本文所述的LN制劑還可包含融合脂質或融合包衣以促進膜融合。合適的融合 脂質的實例包括但不限于甘油單油酸酯、油酸、棕櫚酸、磷脂酸、磷酸肌醇4, 5-二磷酸 (PIP2)，及其組合。本領域中已知的或者以后開發的其他融合脂質也可在本發明中使用。
[0046] 本文中所述的LN制劑還可包含陽離子聚合物或陽離子聚合物的綴合物。陽離子 聚合物或其綴合物可單獨使用或者與脂質納米載體組合使用。合適的陽離子聚合物包括但 不限于：聚乙烯亞胺（PEI)、五亞乙基六胺（PEHA);精胺；亞精胺；聚（L-賴氨酸）；聚（酰 氨基胺）（PAMAM)樹狀聚合物；聚亞丙基亞胺樹狀聚合物；聚（二甲氨基乙基）-甲基丙烯酸 酯（pDMAEMA);殼聚糖；三（2-氨乙基）胺及其甲基化衍生物；及其組合。本領域中已知或 以后開發的其他陽離子聚合物或綴合物也可在本發明中使用。在聚合物遞送系統的實施中 考慮鏈長度和分支。使用高分子量聚合物（例如，分子量為約25, 000的PEI)作為轉染劑， 但會遭受細胞毒性。低分子量聚合物（例如，分子量為約600的PEI)可能不會引起細胞毒 性，但可能由于無法促進與核酸的穩定縮合而使用受限。因此，將低分子量聚合物與較大顆 粒（例如白蛋白）綴合是可用于在制劑中提高核酸縮合的活性同時降低細胞毒性的方法。
[0047] 陰離子聚合物也可并入本文所公開的LN制劑中。合適的陰離子聚合物包括但不 限于：聚（丙基丙烯酸）（PPAA);聚（谷氨酸）（PGA);藻酸類；葡聚糖；黃原膠；衍生的聚合 物；及其組合。本領域中已知的或者以后開發的其他陰離子聚合物也可在本發明中使用。
[0048] 在某些實施方案中，LN制劑包含聚合物的綴合物。所述綴合物可以與靶向劑、親 脂性部分、肽、蛋白質或提高總體治療效力的其他分子相交聯。合適的交聯劑包括但不限 于：N-琥珀酰亞胺基3-[2_吡啶基二硫基]-丙酸酯（STOP) ;3,3'_二硫代雙丙酸亞胺酸酯 (dimethyl 3, 3' -dithiobispropionimidate，DTBP);二環己基碳二亞胺（DCC);二異丙基 碳二亞胺（DIC) ;1_乙基-3-(3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺（EDC) ;N-羥磺基琥珀酰亞胺 (Sulfo-NHS) ;N' -N' -羰基二咪唑（CDI) ;N-乙基-5-苯基異唑-3' 磺酸酯（Woodward 的試劑K);及其組合。
[0049] 多種制備LN的方法適于合成本公開內容的LN，包括本領域中已知的方法。例 如，可以采用乙醇稀釋、凍融、薄膜水化、超聲處理、擠壓、高壓均質化、洗滌劑透析、微流化 (microfIuidzation)、切向流滲濾、無菌過濾和/或凍干。此外，可采用數種方法來減小LN 的尺寸。例如，可以在適于脂質均質化的任何裝置上進行均質化，例如Avestin Emulsiflex C5。經均質化的LN可再循環回到循環中用于進一步均質化。擠出可以在使用合適孔徑 (0. 05 y m至0. 2 y m)之聚碳酸酯膜的Lipex Biomembrane擠出機上進行。可以進行多個顆 粒大小減小循環來使樣品內的尺寸差異最小化并實現期望的尺寸。然后，可使所得LN通過 Sepharose CL4B以除去過量的反應劑或者通過切向流滲濾來處理。
[0050] 本文所述LN的任意實施方案還可在LN混懸劑中包含乙醇。在LN制劑中并入約 10 %至40 %的乙醇使脂質雙層透化。破壞脂質雙層有助于與帶電部分（例如，ASO和siRNA) 縮合。以此方式制備的LN在施用之前稀釋以減小由于乙醇的存在而導致的細胞膜裂解。或 者，可以通過透析和滲濾除去乙醇，而這也會除去未包封的核酸。
[0051] 可以對LN進行滅菌。這可通過使LN通過0.2 iim或0.22 iim的無菌濾器來實現， 進行或者不進行預過濾。
[0052] LN的物理表征可通過許多方法來實現。可以使用動態光散射（DLS)或原子力顯 微鏡（AFM)來確定平均直徑及其標準偏差。理想地，LN應落在200nm的直徑以下。用4 電位計來測量（電位可用于測定顆粒的相對穩定性。動態光散射分析和（電位分析二 者均可使用去離子水或合適的緩沖液中的稀釋樣品來進行。可以使用低溫透射電子顯微鏡 (Cryo-TEM)和掃描電子顯微鏡（SEM)來確定LN的詳細形態。
[0053] 本文所述的LN在冷藏條件下可穩定數月。在LN的合成與施用之間的時間需要延 長的情況下，可使用標準方法來冷凍LN。可以在冷凍之前向LN混懸液中添加冷凍保護劑 (例如，10%蔗糖）以維持制劑的完整性。冷凍干燥的加載的LN制劑因其長期穩定性而被 推薦。
[0054] APC
[0055] 除了陽離子脂質以外，陽離子聚合物也可用于核酸遞送系統。單獨使用陽離子聚 合物或者組合使用陽離子聚合物與LN作為轉染劑常常有益于轉染效率。最良好表征的聚 合物轉染劑是高分子量的聚乙烯亞胺（分子量為約25kDa的大聚合物，其在本文中被成為 PEI25LPEI25在將pDNA遞送至細胞方面已經取得了很大的成功；然而，細胞毒性限制了其 使用。也對分子量為約600kDa的毒性較低的低分子量PEI進行了研究，但這示出縮合與遞 送核酸的能力消失。據此，本文提供了高度陽離子化的白蛋白-聚合物綴合物（APC)。APC 可單獨用于遞送試劑（例如PDNA)或者與基于脂質的制劑組合用來遞送試劑（例如SiRNA 或ASO)。白蛋白因其疏水核心還具有內體裂解活性，一旦發生構象變化所述疏水核心即可 暴露并可引起雙層破壞或膜融合。白蛋白-PEI600綴合物具有響應于pH變化的離子化特 征譜（profile)。電荷密度在內體pH下增加。
[0056] 在一個實施方案中，APC與陽離子脂質組合進行結合從而裝配成陽離子脂 質-APC-核酸納米顆粒。在另一個實施方案中，APC與陰離子脂質組合進行結合從而裝配 成脂質-APC-核酸納米顆粒。在某些實施方案中，所述脂質納米顆粒包含高度陽離子化的 白蛋白-聚陽離子綴合物。這些脂質納米顆粒具有高轉染效率而沒有額外的細胞毒性。在 另一個實施方案中，低分子量的五亞乙基六胺（PEHA)通過交聯劑與人血清白蛋白綴合，產 生高度陽離子化的響應于pH的APC，在本文中也被稱為HSA-PEHA。就HSA-PEHA而言，PEHA 與HSA之比為1至30,優選5至20,更優選8至15,更優選10至12。當并入納米顆粒時， 所得的包含脂質納米顆粒和并入的高度陽離子化的響應pH之綴合物（例如HSA-PEHA)的 制劑在本文中被稱為脂質包被的白蛋白納米顆粒（LCAN)。示例性LCAN是脂質包被的白蛋 白納米顆粒，其包含 DOTAP/sPC/TPGS/HSA-PEHA。
[0057] LCAN尤其可用于遞送NA,例如反義寡核苷酸，pDNA、siRNA、shRNA、miR和 anti-miR。不希望受到理論限制，認為HSA-PEHA提高了納米顆粒的穩定性和生物學活 性。在某些實施方案中，此制劑中的脂質是DOTAP、SPC和TPGS。在一些實施方案中， DOTAP : SPC : TPGS之比為約25 : 70 : 5 (m/m)。在一些示例性實施方案中，總脂質與 HSA-PEHA的重量比為20至1，例如15至2或12. 5至2. 5。
[0058] 靶向劑
[0059] 向LN中添加靶向劑可提供超過被動靶向方法的提高的效力。靶向涉及并入特異 性靶向部分，其例如但不限于：配體或抗體、細胞表面受體、肽、脂蛋白、糖蛋白、激素、維生 素、抗體、抗體片段、前藥和綴合物，或者這些部分的組合。靶向劑的一些非限制性實例包 括葉酸、cRGD(例如，環（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys) (RGDfC)肽、含半乳糖的部分、轉鐵蛋白、 EPPTl肽、低密度脂蛋白、表皮生長因子和抗體。cRGD可指相關的cRGD肽或其任何衍生物， 例如，cRGDfC、cRGDfK、cRGDfE等。在一些示例性實施方案中，所述cRGD肽是cRGDfC(環 (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys))。在一些實施方案中，可通過用合適的祀向部分包被LN的表面 而非包封靶向劑來實現靶向效率的最大化。該方法可使LN與細胞表面受體的相互作用最 優化。靶向劑可以在合成過程中直接并入LN中，或者在后續步驟中添加。靶向部分上的官 能團及具體的治療應用（例如，可降解連接）可有助于確定合適的并入LN中的方法。不具 有親脂區的靶向部分無法容易地直接插入LN的脂質雙層中，并且可能需要在插入之前事 先與脂質綴合，或者可以與LN形成靜電復合物。在某些情況下，靶向配體可能不能直接與 親脂性錨定物結合。在這些情況下，可以利用交聯劑形式的分子橋來促進相互作用。在錨 定的靶向部分的空間限制阻止與預期生理學靶標充分相互作用的情況下可以使用交聯劑。 此外，如果祀向部分只在某些定向（orientations)情況下（例如，單克隆抗體）起作用，貝U 經交聯劑與脂質錨定物連接可能是有益的。可以使用常規的生物綴合方法來連接靶向劑與 LN。可以使用可還原（reducible)或可水解的連接來防止制劑在體內積累以及防止后續的 細胞毒性。
[0060] 在本申請的一些示例性實施方案中，并入RGD(或cRGD)或葉酸靶向劑作為靶向綴 合物，例如，葉酸-PEG-CHEMS (葉酸-聚乙二醇-半琥珀酸膽固醇酯）或葉酸-PEG-DSPE (葉 酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）或cRGDfC-PEG-DSPE(環（RGDfC)-聚乙二醇-二 硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）。在一些靶向綴合物中，最少5摩爾％的綴合物包含靶向劑。在一 些實施方案中，所述綴合物包含至少約50摩爾％、至少約80摩爾％、至少約90摩爾％、或 者至少約95摩爾％的靶向劑。在另一些示例性實施方案中，所述綴合物包含約50摩爾％、 約80摩爾％、約90摩爾％或約95摩爾％的靶向劑。在一些示例性實施方案中，在總脂質 中靶向綴合物的摩爾百分比為約0. 05摩爾％至20摩爾％，例如約0. 5摩爾％至5摩爾％。
[0061] 治療劑
[0062] 多種治療劑或診斷劑可與本文所述的LN組合使用。這樣的治療劑和診斷劑的 非限制性實例包括核酸、蛋白質、多糖、脂質、放射性物質、治療劑、前藥及其組合。治療 劑包括但不限于抗腫瘤劑、抗感染劑、局部麻醉劑、抗過敏劑、抗貧血劑、血管發生抑制劑 (angiogenesis, inhibitor)、￠-腎上腺素能受體阻滯劑、興通道拮抗劑、抗高血壓劑、 抗抑郁劑、抗驚厥劑、抗菌劑（anti-bacterial)、抗真菌劑、抗病毒劑、抗風濕劑、驅腸蟲 劑（anthelminithics)、抗寄生蟲劑、皮質類固醇、激素、激素拮抗劑、免疫調節劑、神經遞 質拮抗劑、抗糖尿病劑、抗癲癇劑、抗出血劑、抗高滲劑（anti-hypertonics)、抗青光眼 劑（antiglaucoma agent)、免疫調節細胞因子、鎮靜劑、趨化因子、維生素、毒素、麻醉劑 (narcotic)、成像劑，及其組合。
[0063] 基于核酸的治療劑非常適用于本公開內容的LN制劑。這樣的基于核酸之治療劑 的實例包括但不限于pDNA、siRNA、miRNA、anti-miRNA、反義寡核苷酸（ASO)、及其組合。為 了保護免受血清核酸酶和穩定治療劑，可以對取代核酸和/或磷酸二酯鍵進行修飾。這樣 的修飾包括但不限于：骨架修飾（例如，硫代磷酸酯鍵）；2'修飾（例如，2'-0_甲基取代的 堿基）；兩性離子修飾（6'_氨基己基修飾的0DN);添加親脂性部分（例如，脂肪酸、膽固醇 或膽固醇衍生物）及其組合。
[0064] 在本發明的一個示例性實施方案中，治療劑是靶向編碼Akt-I之核酸的一部 分并且調節Akt-I之表達的AS0。寡核苷酸化合物設計成特異性地與一個或更多個編 碼Akt-I的核酸雜交。這樣的ASO公開于美國專利7, 122,527中，其內容通過引用整體 并入本文。一個示例性的aso(rx-〇2〇irArchexin?^)，其是2〇聚體硫代磷酸酯反義 寡核苷酸）靶向Akt-I基因之編碼區中具有如下序列的位點：Akt-I基因第1，478位的 5' cgccaaggagatcatgcagc3' (Seq.Id.No. :3)。RX-0201 的骨架序列與該位點互補。
[0065] 另一個AS0(RX-0194)靶向Akt-I基因中具有如下序列的位點：Akt-l基因的第 1,271 位的 5' agtggactggtgggggctgg3' (Seq.Id.No. :4)。RX-0194 骨架的序列與該位 點互補。包含來自取得20聚體RX-0194之序列的上游和下游5或10個核苷酸的寡聚物示 出可測量的Akt-ImRNA表達抑制。RX-0194和RX-0201的截短變體也示出抑制癌細胞增殖。 除了上述2種ASO以外，下調Akt-ImRNA表達并且引起對癌細胞系之細胞毒性的另外5個 反義寡核苷酸化合物包括：
[0066] RX-0616,其包含可與Akt-I基因的在第2101位起始的位點雜交的 5' agatagctggtgacagacag3' （Seq. Id. No. :5)，所述 Akt-I 基因的在第 2101 位起始的位 點具有如下序列：5' ctgtctgtcaccagctatct3' （Seq.Id.No. :6);
[0067] RX-0627,其包含可與Akt-I基因的在第2473位起始的位點雜交的 5' cgtggagagatcatctgagg3' (Seq. Id. No. :7)，所述 Akt-I 基因的在第 2473 位起始的位 點具有如下序列：5' cctcagatgatctctccacg3' (Seq.Id.No. :8);
[0068] RX-0628,其包含可與Akt-I基因的在第2493位起始的位點雜交的 5' tcgaaaaggtcaagtgctac3' (Seq.Id.No. :9)，所述 Akt-I 基因的在第 2493 位起始的位 點具有如下序列：5' gtagcacttgaccttttcgaS' (Seq.Id.No. :10);
[0069] RX-0632,其包含可與Akt-I基因的在第2603位起始的位點雜交的 5' tggtgcagcggcagcggcag3'（Seq.Id.No. :11)，所述 Akt-I 基因的在第 2603 位起始的位 點具有如下序列：5' ctgccgctgccgctgcacca3' （Seq.Id.No. :12);
[0070] RX-0638,其包含可與Akt-I基因的在第170位起始的位點雜交的 5' ggcgcgagcgcgggcctagc3' (Seq.Id.No. :2)，所述 Akt-I 基因的在第 170 位起始的位點 具有如下序列：5' gctaggcccgcgctcgcgcc3' (Seq.Id.No. :13)。
[0071] 在另一些實施方案中，治療劑是靶向編碼HIF-I之核酸的一部分并且調節HIF-I 之表達的AS0。寡核苷酸化合物設計成特異性地與一個或更多個編碼HIF-I的核酸雜交。 這樣的ASO公開于美國專利7, 205, 283中，其內容通過引用整體并入本文。一個示例性的 AS0(RX_0047,包含 5' aatgagccaccagtgtccaa 3' （Seq.Id.No. :2)的 20 聚體硫代憐酸 酯反義寡核苷酸）是"缺氧誘導因子-I a "（HIF-1 a )的強效抑制劑，并且靶向HIF-I基 因中具有如下序列的位點：HIF-I基因第2, 772 Id. No. : 14)。RX-0047的骨架序列與該位點互補。根據本實施方案的另一個示例性ASO(包 含 5' ggagctaacatctccaagtc3' (Seq.Id.No. :15)的 RX-0149)革巴向 HIF-1 基因的編碼區 中具有如下序列的位點：HIF-I基因的第1，936 Id. No. : 16)。RX-0149骨架的序列與該位點互補。包含來自取得20聚體RX-0047和RX-0149 之序列的上游和下游5或10個核苷酸的寡聚物示出可測量的HIF-ImRNA表達抑制和癌細 胞增殖抑制。RX-0047和RX-0149的示出一些HIF-ImRNA表達抑制的截短變體也示出癌細 胞增殖的抑制。
[0072] 本發明包括另一些寡聚反義化合物，包括但不限于寡核苷酸模擬物 (oligonucleotide mimetic)。反義化合物可包括約10至約30個核酸堿基，例如，寡核苷 酸具有約20個核苷堿基（nucleobases)(即，約20個相連的核苷）。如本領域中已知的，核 苷是堿基-糖組合。核苷的堿基部分通常是雜環堿基。這樣的雜環堿基的兩個最常見的類 別是嘌呤和嘧啶。核苷酸是包括與核苷的糖部分共價連接之磷酸基團的核苷。就包含呋喃 戊糖基糖的那些核苷而言，磷酸基團可與糖的2'、3'或5'羥基部分連接。在形成寡核苷酸 時，相鄰的核苷彼此之間通過磷酸基團共價連接從而形成線性聚合物化合物。進而，該線性 聚合物結構的各端可進一步相連以形成環結構，然而，一般優選開放的線性結構。在寡核苷 酸結構中，磷酸基團通常指形成寡核苷酸之核苷間的骨架。RNA和DNA通常的鍵或骨架是 3'或5'磷酸二酯鍵。
[0073] 本發明的反義化合物包括任何可藥用鹽、酯或這些酯的鹽或者在施用于動物（包 括人）之后能夠（直接或間接）提供生物活性代謝物或其殘余物的任何其他化合物。因 此，例如，本公開內容還包括本發明化合物的前藥和可藥用鹽，這些前藥的可藥用鹽以及其 他生物等價物（bioequivalent)。
[0074] 應用
[0075] 根據應用，本文中公開的脂質納米顆粒可設計成有利的特性，例如提高的與核酸 的相互作用、提高的血清穩定、降低的RES介導的攝取、靶向遞送或內體內pH敏感性釋放。 由于LN制劑的不同性質，本文提供的數種方法中的任意一種可用于實現特定治療目的。可 以使用陽離子脂質、陰離子脂質、PEG脂質、中性脂質、融合脂質、陽離子聚合物、陰離子聚合 物、聚合物綴合物、肽、靶向部分及其組合來滿足具體目的。
[0076] 本文中所述的脂質納米顆粒可用作治療性遞送寡核苷酸（ON)治療劑的平臺，所 述ON治療劑例如cDNA、siDNA、shDNA、miRNA、anti-miR和反義寡核苷酸（ASO)。該治療劑 可用于治療多種疾病，例如多種類型的癌癥、白血病、病毒感染以及其他疾病。當然，根據本 發明可治療的特定疾病取決于并入本發明之LN中的治療劑。本發明特別適于包封核酸，例 如反義寡核苷酸。核酸（特別是反義寡核苷酸）尤其可用于治療腫瘤和癌癥。根據本發明 可治療的腫瘤和癌癥的實例包括例如腦癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑素瘤、皮膚癌、表皮癌、 結腸直腸癌、非霍奇金淋巴瘤、子宮內膜癌、胰腺癌、腎（腎細胞）癌、前列腺癌、白血病、甲 狀腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肝細胞癌、宮頸癌、肉瘤、胃癌、多發性骨髓瘤、淋巴瘤、胃腸癌和 子宮癌。具體實例包括表皮癌、胰腺癌和乳腺癌。
[0077] 許多腫瘤在其細胞表面過表達受體。靶向部分（例如cRGD肽、葉酸、轉鐵蛋白 (Tf)、抗體、低密度脂蛋白（LDL)及表皮生長因子）可通過使得能夠進行靶向的藥物遞送而 大大提高活性。多靶向的系統是另一個可能，并且可進一步用于明確特定靶細胞亞型。
[0078] 單獨或者彼此組合實施本文中所述LN制劑的實施方案與現有范例脂質納米顆粒 設計協同作用。
[0079] 根據治療應用，本文所述的LN可通過以下方法施用：經口、腸胃外，靜脈內、肌內、 皮下、腹膜內、經皮、腫瘤內、動脈內、全身或傳遞增強的遞送。在一些特定實施方案中，LN經 靜脈內、肌內、皮下或腫瘤內遞送。可使用替代性施用途徑來進行不同或類似LN的后續給 藥。
[0080] 本公開內容的藥物組合物包含有效量的本文公開的脂質納米顆粒制劑和/或溶 解或分散于可藥用載體中的額外的試劑。術語"藥學"或"可藥用"指在施用于動物（例如， 人）后不產生不良反應、變態反應或其他不希望的反應的分子實體和組合物。在本公開內 容的教導下，制備包含至少一種化合物或另外的活性成分的藥物組合物對于本領域技術人 員而言將是已知的，如Remingtor^ s Pharmaceutical Sciences, 2003中所示，其通過引用 并入本文。此外，對于動物（例如，人）施用，將理解，所述制劑應滿足FDA局之生物標準所 要求的無菌、致熱原性（pyrogenicity)、一般安全性和純度標準。
[0081] 本文中所公開的組合物可包含不同類型的載體，取決于其以固體、液體還是氣霧 劑形式施用以及其用于諸如注射施用等途徑是否需要滅菌。本文中所公開的組合物可以通 過以下方式施用：靜脈內、皮內、經皮、鞘內、動脈內、腹膜內、鼻內、陰道內、直腸內、表面、肌 內、皮下、經粘膜、子宮內、經口、表面、局部、經吸入（例如，氣霧劑吸入）、通過注射、通過輸 注、通過連續輸注、通過局部灌注直接洗浴靶細胞、經導管、經灌洗、以乳膏劑、以脂質組合 物（例如，脂質體）或者通過本領域普通技術人員已知的其他方法或前述的任意組合（參 見，例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences，2003,其通過引用并入本文）。
[0082] 施用于動物或人患者的本文中所述公開之組合物的實際給藥量可通過物理因素 和生理因素來確定，例如體重、病癥的嚴重程度、被治療疾病的類型、之前或同時進行的治 療干預、患者的特發性疾病（idiopathy)以及施用途徑。根據該劑量和施用途徑，有效量和 /或優選劑量的施用次數可根據對象的響應而變化。在任何情況中，負責施用的醫學工作者 將確定組合物中活性成分的濃度和對于個體對象而言合適的劑量。
[0083] 在某些實施方案中，藥物組合物可包含例如至少約0. 1 %的活性化合物。在另一些 實施方案中，活性化合物可占單位重量的約2 %至約75 %，或者約25 %至約60 %，例如其間 可得出的任何范圍。自然而言，可以這樣的方式制備的每種可治療用組合物中活性化合物 的量為將在任何給定單位劑量的化合物中得到的合適的劑量。制備這樣的藥物制劑的本領 域技術人員將考慮到例如以下因素：溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途徑、產品貨架 期以及其他藥理學考慮因素，因此，可期望多種劑量和治療方案。
[0084] 在另一些非限制性實例中，一次投藥還可包含每次施用約1微克/kg/體重、約5 微克/kg/體重、約10微克/kg/體重、約50微克/kg/體重、約100微克/kg/體重、約200 微克/kg/體重、約350微克/kg/體重、約500微克/kg/體重、約1毫克/kg/體重、約5毫 克/kg/體重、約10毫克/kg/體重、約50毫克/kg/體重、約100毫克/kg/體重、約200毫 克/kg/體重、約350毫克/kg/體重、約500毫克/kg/體重、約1000mg/kg/體重或者更多， 以及其間可得出的任何范圍。從本文所列舉的數值可得出范圍的非限制性實例中，基于上 述數值，可施用如下范圍：約5mg/kg/體重至約100mg/kg/體重、約5微克/kg/體重至約 500毫克/kg/體重等。
[0085] 在某些實施方案中，本文的組合物和/或另外的試劑配制成經消化途徑施用。消 化途徑包括其中組合物與消化道直接接觸的所有可能的施用途徑。具體地，本文公開的藥 物組合物可經口、口腔（bucal Iy)、經直腸或經舌下施用。因此，這些組合物可以與惰性稀釋 劑或者與可吸收的可食用載體一起配制。
[0086] 在另一些實施方案中，本文中所述的組合物可以通過腸胃外途徑施用。本文使用 的術語"腸胃外"包括繞開消化道的途徑。特別地，本文中公開的藥物組合物可以經例如 但不限于以下途徑施用：靜脈內、皮內、肌內、動脈內、鞘內、皮下或腹膜內施用（美國專利 6, 753, 514、6, 613, 308、5, 466, 468、5, 543, 158、5, 641，515 和 5, 399, 363 各自特別地通過引 用整體并入本文）。
[0087] 作為游離堿或可藥用鹽的本文所公開之組合物的溶液可在水中合適地與表面活 性劑（例如，羥丙基纖維素）混合制備。分散體還可在如下中制備：甘油、脂質聚乙二醇及 其混合以及油。在常規儲存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物生長。適于 注射用的藥物形式包括無菌水溶液或或分散體以及用于臨時制備無菌注射液或分散體的 無菌散劑（美國專利5, 466, 468,其特別地通過引用整體并入本文）。在所有情況下，劑型 (form)都必須是無菌的并且必須是以易于注射的流動程度存在。其在制造和儲存條件下 必須是穩定的，并且必須保存為免受微生物（例如細菌和真菌）的污染作用。載體可以是 含以下的溶劑或分散介質，例如水、乙醇、多元醇（即，甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等）、其 合適的混合物和/或植物油。可以例如通過以下來保持合適的流動性：使用包衣，例如卵磷 脂；在分散體的情況下保持所需的顆粒大小以及使用表面活性劑。可以通過多種抗菌劑和 抗真菌劑（例如對羥基苯甲酸酯類、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等）來防止微生物的作用。 在許多情況下，優選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉。可以通過在組合物中使用延遲吸收的試 劑（例如，單硬脂酸鋁或明膠）來實現可注射組合物的延長的吸收。
[0088] 就水溶液的腸胃外施用而言,例如,如果必要的話,應合適地緩沖溶液,首先用足 量的鹽水或葡萄糖使液體稀釋劑等滲。這些特定水溶液尤其適于靜脈內、肌內、皮下和腹膜 內施用。就此而言，在本公開內容的教導下，本領域技術人員將知曉可使用的無菌水性介 質。例如，可以將1個劑量溶解于等滲的NaCl溶液中，或者添加到IOOOml的皮下灌注術流 體中或者在推薦的輸注部位注射（參見例如，"RemingtoY s Pharmaceutical Sciences" 第15版，第1035至1038和1570至1580頁）。根據接受治療之對象的病癥，劑量必然會 發生一些變化。在任何情況下，負責施用的人將確定對于個體對象而言合適的劑量。此外， 就人施用而言，制劑應滿足FDA局生物標準所要求的無菌、致熱原性、一般安全性及純度標 準。
[0089] 無菌注射溶液通過如下所述來制備：向具有多種上文列舉的其他成分（根據需 要）的合適溶劑中添加需要量的組合物，接著進行過濾除菌。一般而言，分散體通過如下 所述來制備：向含基本分散介質和所需的上文所列舉之其他成分的無菌載劑中添加多種無 菌組合物。在用于制備無菌注射溶液的無菌散劑的情況下，一些制備方法是真空干燥和冷 凍干燥技術，其產生活性成分加上來自其此前的經過濾無菌溶液之任何其他期望成分的散 齊U。在使用或者不使用穩定劑的情況下，將粉末化的組合物與液體載體（例如，水或鹽水溶 液）組合。
[0090] 在另一些實施方案中，所述組合物可配制成經多種混雜途徑施用，例如表面（即， 經皮）施用、經粘膜施用（鼻內、經陰道等）和/或經吸入。
[0091] 用于局部施用的藥物組合物可包括配制用于給藥應用的組合物，例如軟膏、糊劑、 乳膏劑或散劑。軟膏包括所有用于局部施用的油質的吸收性乳劑和基于水溶性的組合物， 而乳膏劑和洗劑是僅包括乳劑基質的那些組合物。局部施用的藥物可包含滲透增強劑以促 進活性成分通過皮膚吸收。合適的滲透增強劑包括甘油、醇類、烷基甲基亞砜、吡咯烷酮及 luarocapram。對于用于表面施用的組合物而言的可用的基質包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜 和礦脂以及任何其他合適的吸收、乳劑或水溶性軟膏基質。表面制劑在必要時還可包含乳 化劑、凝膠化劑和抗微生物防腐劑以保存該組合物和提供均勻的混合物。所述組合物的經 皮施用還可包括使用"貼劑（patch)"。例如，貼劑可以預定速率和連續的方式在固定時間 段提供一種或更多種組合物。
[0092] 在某些實施方案中，所述組合物可通過滴眼劑、鼻內噴霧劑（intranasal spray)、 吸入劑和/或其他氣霧劑遞送載體來遞送。用于將組合物經鼻內氣霧噴霧直接遞送至肺 的方法描述于美國專利5, 756, 353和5, 804, 212中（均特別地通過引用整體并入本文）。 同樣，使用鼻內微顆粒樹脂（Takenaga等，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物（美國專利 5, 725, 871，其特別地通過引用整體并入本文）進行藥物遞送在藥學領域是公知的，并且可 用于遞送本文所述的組合物。同樣，以聚四氟乙烯支持物基質的形式進行透粘膜藥物遞送 描述于美國專利5, 780, 045 (其特別地通過引用整體并入本文）中，并且可用于遞送本文所 述的組合物。
[0093] 還考慮，本文公開的組合物可經氣霧劑遞送。術語氣霧劑指分散于液化或加壓氣 體拋射劑中的微細固體或液體顆粒的膠體系統。用于吸入的典型氣霧劑由活性成分在液體 拋射劑或者液體拋射劑與合適溶劑之混合物中的懸浮液組成。合適的拋射劑包括烴和烴 醚。合適的容器將根據拋射劑的壓力要求而不同。氣霧劑的施用將根據對象的年齡、體重 以及癥狀的嚴重程度和響應而不同。 實施例
[0094] 實施例1.脂質體制劑和LCAN制劑的制備
[0095] 1.制備和表征用于反義寡核苷酸的脂質體制劑
[0096] 通過乙醇擴散方法來制備用于RX-0047的脂質體制劑（L-RX-0047)。脂質體組合 物為摩爾比為45 : 50 : 5的D0TAP/D0PE/TPGS或DOTAP/soyPC/TPGS。簡言之，將脂質 溶解于含有或不含EPI2K(即，分子量為約2000的PEI)的乙醇中。脂質與PEI2K之比為 12. 5 : 1。將RX-0047溶解于檸檬酸鹽緩沖液（20mM，pH4)中，然后在渦旋下添加到脂質溶 液或脂質/PEI2K溶液中，從而在40% (v/v)的乙醇濃度自發形成預脂質體。RX-0047與脂 質的重量比為12.5 : 1。然后在室溫下用檸檬酸鹽緩沖液（20mM，pH4)對該復合物進行透 析2小時，接著在室溫下用HEPES緩沖鹽水（HBS，20mM HEPES，145mM NaCl，pH 7. 4)透析過 夜，使用 MWCO IOOOODalton Spectra/Por Float-A-Lyzer 儀（SDectrum Laborato ries， Rancho Dominguez，CA)除去游離的 RX-0047。
[0097] 按照與如上所述相同的方法制備用于RX-0047的葉酸靶向的脂質體制劑 (F-L-RX-0047)。該脂質體包含摩爾比為 45/50/4. 5/0. 5 或 45/50/4/1 的 DOTAP/sPC/TPGS/ F-PEG-CHEMS。
[0098] 按照與如上所述相同的方法制備用于RX-0047的R⑶靶向的脂質體制劑 (cRGD-L-RX-0047)。該脂質體包含摩爾比為 45/50/4. 5/0. 5 或 45/50/4/1 的 DOTAP/sPC/ TPGS/cRGD-PEG-DSPE〇
[0099] 2. HSA-PEHA綴合物的合成
[0100] 通過用EDC活化HSA上的羧基并與PEHA上的胺形成酰胺鍵來合成HSA-PEHA綴 合物。在合成期間使用的HSA : PEHA : EDC摩爾比為1 : 1500 : 200(mol/mol)。通過 使HSA與大幅過量的PEHA在50mM硼酸緩沖液或水（pH 8. 0)中的1-乙基-3- (3-二甲氨 基）_丙基碳二亞胺（EDC)和磺基-N-羥基琥珀酰亞胺的存在下反應來使HSA(25%，購自 Octapharma)與五亞乙基六胺綴合（PEHA，購自Sigma-Aldrich)。簡言之，將5g的PEHA(MW 232. 37,工業級）溶解于80mL CldH2O中，然后使用IM HCl調節至pH 8.0。然后，在攪拌下向 PEHA溶液中添加 Ig (4mL)的HSA和562. 5mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基）-丙基碳二亞胺 (EDC，溶解于DMSO中）。反應在室溫持續3至4小時。通過凝膠膜色譜在ro-10脫鹽柱上 純化HSA-PEHA產物，或者使用MWCO 10, 000色譜膜用CldH2O (雙蒸水）在4°C進行透析以除 去未反應的PEHA和副產物。每3至4小時更換透析緩沖液一次，直到通過標準的茚三酮或 三硝基苯磺酸（TNBS)胺測定在透析循環結束時的3小時時間點的外部緩沖液中檢測不到 來自PEHA的胺。對于大規模合成，應當用切向流滲濾來代替透析方法，例如使用MiIlipore Pellicon盒系統或Spectropor中空纖維系統。該方法可用于將產物濃縮至期望的濃度。 使產物通過0. 22 y m無菌濾器進入無菌容器中，并且在4°C保存。對于長期儲存而言，產物 可在-20°C保存。還可以將產物凍干。
[0101] 通過BCA蛋白質測定來測定產物蛋白質濃度，并使用基于PEHA的標準曲線通過 TNBS胺含量測定來測定產物中的PEHA含量。通過基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜 法（MADLI TOF MS)來測定HSA-PEHA綴合物的分子量。平均上，基于示出m/z為66405. 756 的結果，每個HSA連接有11個PEHA。SDS-PAGE分析示出，綴合物作為一個單獨的條帶遷移， 表明HSA-PEHA產物中缺少分子間交聯。
[0102] 3. cRGDfC-PEG-DSPE 綴合物的合成
[0103] cRGDfC (環（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys))和 PEG-DSPE-馬來酰亞胺通過-SH 和-馬 來酰亞胺反應形成的硫醚鍵綴合。反應期間使用的cRGDfC和PEG-PSPE-馬來酰亞胺摩爾比 為1. 5 : 1。合并分別溶解于含5mM EDTA (pH = 7. 0)的PBS緩沖液中的cRGDfC和PEG-DSPE 溶液，并伴隨攪拌于室溫反應6小時。通過在ro-io柱上凝膠過濾來純化產物以從產物中 除去未反應的/過量的cRGDfC。對于大規模反應，可以用GPC (使用MWCO 2000膜的透析） 或切向流滲濾來代替凝膠過濾。可以將產物冷凍或凍干以保持長期穩定性。通過HPLC和 LC-MS來確認產物純度。按照說明書可以建立最低的cRGDfC綴合水平（例如，80% )和游 離肽含量（例如，< 1% )。可以通過BCA蛋白質測定來確定產物中的cRGDfC含量。
[0104] 4.葉酸-PEG-DSPE綴合物的合成
[0105] 使IOmg葉酸與在具有少量三乙胺（20 ill)之DMSO (0. 5ml)中的7mg的N， N'-二環己基碳二亞胺（DCC)和2. 87mg的N-羥基琥珀酰亞胺（NHS)以葉酸/DCC/NHS = 1/1. 5/1. 1的摩爾比在室溫反應3小時。對反應混合物進行離心以出去副產物二環己基脲。 將77mg的DSPE-PEG-胺溶解于具有少量三乙胺（20 yl)的DMSO (0.5ml)中，然后與以上合 成的葉酸-NHS以I : 1的摩爾比在室溫反應3小時。通過用IOX體積丙酮沉淀來純化葉 酸-PEG-DSPE。通過離心來收集沉淀物，然后在真空下干燥。使用MWCO 2000膜用CldH2O通 過透析進一步純化產物，接著進行凍干。通過HPLC來確認產物純度。按照說明書建立相對 于全部PEG化脂質的最低葉酸綴合水平（例如，80%)并且檢測不到的游離葉酸含量。通 過UV光譜在37 Inm處或者通過HPLC測定產物中的葉酸含量
[0106] 5?葉酸-PEG-DSPE綴合物的合成
[0107] 通過使葉酸-PEG-胺與CHEMS-NHS反應來進行葉酸-PEG-CHEMS的合成。葉 酸-PEG-胺與CHEMS-NHS二者均通過先前所述方法來合成（Xiang等，Int J Pharm.， 356(2008)29-36)。簡言之，對于葉酸-PEG-雙-胺的合成，將葉酸（26. 5mg)和PEG-雙-胺 (167. 5mg)溶解于ImL DMSO中。然后，向溶液中添加8. 6mg的NHS和15. 5mg的DCC，使反 應在室溫過夜進行。然后通過Sephadex G-25凝膠過濾色譜來純化產物葉酸-PEG-胺。對 于CHEMS-NHS的合成，使CHEMS(Ig)與四氫呋喃中的475mg NHS和I. 25g DCC在室溫反應 過夜。通過重結晶純化產物CHEMS-NHS。最后，對于F-PEG-CHEMS的合成，將葉酸-PEG-胺 (13711^，4011111〇1)和(：冊]^-順3(29.211^，5011111〇1)溶解于〇1(：13(501^)中，并在室溫下反應 過夜。然后通過旋轉蒸發除去溶劑（CHCl3),并在50mM Na2CO3(IOmL)中水合殘余物以形成 F-PEG-CHEMS膠束。然后使用分子量截止（MWCO)為14kDa的譜透析膜用去離子水來透析 膠束，以除去低分子量副產物。然后通過凍干來干燥產物F-PEG-CHEMS，其產生黃色粉末產 物（130mg)，產率為76. 5%。通過薄層色譜（TLC)以及通過DMS0-d6中的1H NMR來確認產 物的身份。
[0108] 6.制備與表征用于反義寡核苷酸的LCAN制劑
[0109] 通過乙醇稀釋方法來制備脂質包被的白蛋白納米顆粒（LCAN)。將脂質1，2-二油 酰基-3-三甲基銨-丙燒（DOTAP) (Avanti Polar Lipids)、來自大豆的L-a-磷脂酰膽堿 (SPC) (Avanti Polar Lipids)以及 d_ a-生育酌?聚乙二醇 1000 玻拍酸酯（TPGS) (Eastman Chemical)溶解于乙醇中。以25 : 70 : 5(m〇l/m〇l)組合脂質。將HSA-PEHA與脂質溶液 以12.5 : 3的重量比混合。反義組合物/總脂質/HSA-PEHA的重量比為I : 10 : 3。簡 言之，在渦旋下將H印es緩沖劑（20mM，pH 7. 4)中的HSA-PEHA與溶解于EtOH中的脂質混 合，所得的EtOH濃度為60%。將RX-0047或RX-0201溶解于H印es緩沖液（20mM，pH 7. 4) 中，然后在渦旋下添加到脂質和HSA-PEHA溶液中，從而在40 % (v/v)的EtOH濃度自發形 成預LCAN。然后在室溫用Ifepes緩沖液（20mM，pH 7. 4)對該復合物進行透析2小時，然后 在室溫使用JEPES緩沖鹽水（HBS，20mM HEPES，145mM NaCl，pH 7. 4)對復合物進行透析過 夜，使用MWCO IOOOODalton Snakeskin透析管除去游離的AS0。
[0110] 將LCAN制劑濃縮到20倍然后用Ifepes緩沖液（5mM，pH 7. 4)洗滌以除去NaCl。 將產物稀釋至期望的濃度并添加10 %蔗糖。然后經〇. 45 y m濾器過濾終產物，然后儲存 在-70。。。
[0111] 7.制備和表征用于反義寡核苷酸的靶向LCAN制劑
[0112] 按照與實施例5所述相似的方法制備RGD靶向的LCAN制劑。對于該RGD靶向的 LCAN 制劑，脂質由 DOTAP/soyPC/TPGS/cRGDfC-PEG-DSPE 以 25 : 70 : 4 : 1 的摩爾比構 成，并且反義組合物/總脂質/HSA-PEHA的重量比為I : 10 : 3。通過以25 : 70.4 : 1 的比例混合DOTAP、soyPC、TPGS和cRGDfC-PEG-DSPE來制備含靶向劑的脂質混合物。通 過兩個泵和Y連接器將60%乙醇中的脂質混合物組分（溶液A)和20%乙醇中的等體積 hsa-peha (溶液B)合并以得到4〇 %乙醇溶液（溶液O。將rx-〇2〇i (Archexin?])溶解 于具有40%乙醇的HEPES緩沖液（20mM，pH 7. 4)中，以形成溶液D。通過兩個泵和Y連接 器將等體積的溶液C和溶液D合并以得到40%乙醇溶液（溶液E)，并且邊攪拌邊用CldH2O 將溶液E稀釋四倍得到10%乙醇。向溶液E中添加等體積的0. 5M NaCl以產生含250mM NaCl和5%乙醇濃度的溶液（溶液F)。通過切向流滲濾來純化R⑶靶向的LCAN產物溶液 F，MWCO 30kDa膜中包括將溶液F中RX-0201濃縮為0. 5mg/mL的濃度作為第一步，用5mM 磷酸緩沖液（PH7.4)進行滲濾直至滲透液滴中的RX-0210濃度降低至低于lOyg/ml作為 第二步驟，而產物的濃度達到RX-0201濃度為2. 5mg/mL為最終步驟。向產物中添加1/4體 積的50%蔗糖以產生10%的蔗糖溶液，并經過0. 22 無菌濾器過濾；如果必要的話采用 預過濾。對于凍干，在無菌條件下，將經過濾的產物（IOmL)轉移到50mL小瓶中，采用2階 段程序冷凍和凍干：將托架（shelf)冷卻到0°C，以0. 5°C /分鐘冷卻到_40°C，將壓力降低 至0. 12-0. 16個大氣壓（atm)，在-25°C初始干燥30小時。以5°C /分鐘加熱到25°C，進行 6小時最大真空干燥。將最終的cRGD靶向LCAN產物儲存在4°C，并在使用時用水重新構建 用于注射。
[0113] 其他靶向的 LCAN 產物例如葉酸-LCAN-RX-0201、cRGD-LCAN-RX-0047 和葉 酸-LCAN-RX-0047按照與如上所述相同的方法來制備。
[0114] 實施例2 :脂質體制劑和LCAN制劑的表征
[0115] R⑶靶向的脂質體制劑由 DOTAP/sPC/TPGS/cRGDfC-PEG-DSPE 以 45/50/4. 5/0. 5 或 45/50/4/1的摩爾比組成。顆粒大小和4電位示于表1中。cRGDfC-PEG-DSPE濃度不改變 脂質體顆粒大小和（電位。
[0116] 表I. RGD靶向脂質體制劑的表征
[0117]

【權利要求】
1. 脂質納米顆粒組合物，其包含與聚合物綴合的大分子和靶向劑。
2. 脂質納米顆粒組合物，其包含與聚合物綴合的大分子和治療劑，所述治療劑包含選 自以下的反義寡核苷酸（ASO): 靶向編碼Akt-1之核酸的一部分并且調節Akt-1之表達的ASO ;和 靶向編碼HIF-1之核酸的一部分并且調節HIF-1之表達的ASO。
3. 根據權利要求1所述的脂質納米顆粒組合物，其還包含治療劑，所述治療劑包含選 自以下的反義寡核苷酸（ASO): 靶向編碼Akt-1之核酸的一部分并且調節Akt-1之表達的ASO ;和 靶向編碼HIF-1之核酸的一部分并且調節HIF-1之表達的ASO。
4. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述聚合物是帶電荷的。
5. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述聚合物是帶正電荷的。
6. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述大分子包含白蛋白。
7. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述與聚合物綴合的大分子 包含白蛋白-聚陽離子綴合物。
8. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述綴合是通過交聯劑綴合。
9. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述大分子包含五亞乙基六 胺（PEHA)，并且所述聚合物包含人血清白蛋白（HSA)。
10. 根據權利要求5所述的脂質納米顆粒組合物，其中PEHA分子與HSA分子的比為約 11 ： 1〇
11. 根據權利要求5所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述帶正電的聚合物包含四亞 乙基六胺。
12. 根據權利要求5所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述帶正電的聚合物包含四亞 乙基五胺。
13. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述脂質納米顆粒包含兩種 或更多種低分子量聚合物的混合物。
14. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述脂質納米顆粒包含 DOTAP、SPC和 TPGS。
15. 根據權利要求14所述的脂質納米顆粒組合物，其中DOTAP : SPC : TPGS的摩爾比 為約 25 : 70 : 5。
16. 根據權利要求1所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述納米顆粒還包含選自以下 的治療劑：核酸、蛋白質、多糖、脂質、放射性物質、治療劑、前藥及其組合。
17. 根據權利要求14所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述治療劑是核酸。
18. 根據權利要求17所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述核酸選自pDNA、反義寡核 苷酸、miR、antimiR、shRNA、siRNA 或其組合。
19. 根據權利要求2或18所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述反義寡核苷酸是具有 包含5'gctgcatgatctccttggcg 3'（Seq.Id.No. :1)之序列的化合物，其革巴向編碼人Akt-1 的核酸分子并調節Akt-1的表達。
20. 根據權利要求2或18所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述反義寡核苷酸是具有 包含5'aatgagccaccagtgtccaa 3'（Seq.Id.No. :2)之序列的化合物，其革巴向編碼人HIF-1 的核酸分子并調節HIF-1的表達。
21. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其還包含基因融合肽。
22. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述脂質納米顆粒的顆粒大 小小于約300nm。
23. 根據權利要求1或2所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述脂質納米顆粒的顆粒大 小小于約150nm。
24. 根據權利要求1所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述靶向劑通過直接連接或者 通過交聯劑與所述脂質納米顆粒的外表面相結合。
25. 根據權利要求1所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述靶向劑包含抗體或抗體片 段。
26. 根據權利要求1所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述靶向劑包含選自以下的部 分：cRGD肽、含半乳糖的部分、轉鐵蛋白、葉酸、低密度脂蛋白、表皮生長因子和抗體。
27. 根據權利要求26所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述靶向劑包含cRGDfC或葉 酸。
28. 根據權利要求27所述的脂質納米顆粒組合物，其中所述靶向劑包含選自以下的綴 合物：葉酸-PEG-CHEMS (葉酸-聚乙二醇-半琥珀酸膽固醇酯）、葉酸-PEG-DSPE (葉酸-聚 乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）和cRGDfC-PEG-DSPE (環（RGDfC)-聚乙二醇-二硬脂 酰基磷脂酰乙醇胺）。
29. 藥物組合物，其包含根據前述權利要求中任一項所述的脂質納米顆粒組合物和可 藥用賦形劑。
30. 根據權利要求29所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物是無菌溶液或混懸液。
31. -種制備脂質包被的白蛋白納米顆粒（LCAN)的方法，所述方法包括： 合成HSA-PEHA綴合物； 制備脂質混合物； 向所述HSA-PEHA綴合物中添加該脂質混合物；以及 向所述脂質混合物和所述HSA-PEHA綴合物中添加反義寡核苷酸（ASO)，以得到LCAN前 體；其中所述ASO選自靶向編碼Akt-1之核酸的一部分并且調節Akt-1之表達的ASO ;和靶 向編碼HIF-1之核酸的一部分并且調節HIF-1之表達的ASO。
32. -種制備脂質包被的白蛋白納米顆粒（LCAN)的方法，所述方法包括： 合成HSA-PEHA綴合物； 制備脂質混合物；和 向所述HSA-PEHA綴合物中添加靶向劑和所述脂質混合物。
33. 根據權利要求32所述的方法，其中所述靶向劑包含選自以下的部分：cRGD肽、含半 乳糖的部分、轉鐵蛋白、葉酸、低密度脂蛋白、表皮生長因子和抗體。
34. 根據權利要求33所述的方法，其中所述靶向劑包含cRGDfC或葉酸。
35. 根據權利要求34所述的方法，其中所述靶向劑包括選自以下的綴合物：葉 酸-PEG-CHEMS (葉酸-聚乙二醇-半琥珀酸膽固醇酯）、葉酸-PEG-DSPE (葉酸-聚乙二 醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）和cRGDfC-PEG-DSPE (環（RGDfC)-聚乙二醇-二硬脂酰基 磷脂酰乙醇胺）。
36. 根據權利要求32所述的方法，其中所述脂質混合物包含DOTAP、soyPC、TPGS和 cRGDfC-PEG-DSPE〇
37. 根據權利要求36所述的方法，其中DOTAP : soyPC : TPGS : cRGDfC-PEG-DSPE的 摩爾比為約25 : 70 : 4 : 1。
38. 根據權利要求31或32所述的方法，其中所述脂質混合物包含D0TAP、SPC和TPGS。
39. 根據權利要求38的方法，其中DOTAP : SPC : TPGS的摩爾比為約25 : 70 : 5。
40. 根據權利要求32所述的方法，其還包括向所述脂質混合物和靶向劑中添加治療 齊U，其中所述治療劑是選自以下的核酸：PDNA、反義寡核苷酸、miR、antimiR、shRNA、siRNA 或其組合。
41. 根據權利要求40所述的方法，其中所述治療劑包含選自以下的反義寡核苷酸 (AS0):祀向編碼Akt-1之核酸的一部分并且調節Akt-1之表達的AS0 ;和靶向編碼HIF-1 之核酸的一部分并且調節HIF-1之表達的AS0。
42. 根據權利要求31或41所述的方法，其中所述反義寡核苷酸是具有包含 5'gctgcatgatctccttggcg 3'（Seq.Id.No. :1)之序列的化合物，其革巴向編碼Akt-1的核酸 分子并且調節Akt-1的表達。
43. 根據權利要求31或41所述的方法，其中所述反義寡核苷酸是具有包含 5'aatgagccaccagtgtccaa 3'（Seq.Id.No. :2)之序列的化合物，其革巴向編碼人HIF-1的核 酸分子并且調節HIF-1的表達。
44. 一種診斷或治療癌癥或感染性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用 有效量的權利要求29所述的藥物組合物。
45. 根據權利要求44所述的方法，其中所述癌癥選自：腦癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑 素瘤、皮膚癌、表皮癌、結腸直腸癌、非霍奇金淋巴瘤、子宮內膜癌、胰腺癌、腎（腎細胞）癌、 前列腺癌、白血病、甲狀腺癌、頭頸部癌、卵巢癌、肝細胞癌、宮頸癌、肉瘤、胃癌、多發性骨髓 瘤、淋巴瘤、和胃腸癌以及子宮癌。
46. 根據權利要求44所述的方法，其中所述癌癥選自乳腺癌、表皮癌和胰腺癌。
【文檔編號】A61K47/48GK104428005SQ201380026005
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年5月23日 優先權日:2012年5月23日
【發明者】羅伯特·J·李, 李永福, 金德中, 安昌浩 申請人:俄亥俄州立大學