專利名稱：一種提高量子點編碼微球的編碼穩定性的方法
技術領域：
本發明屬于藥物篩選和納米技術領域，具體涉及一種提高量子點(QDs)編碼微球的編碼穩定性的方法，這種微球可在多元化檢測和分析領域有很廣闊的用途，尤其有利于新型自編碼光譜識別高通量藥物篩選系統的實現。
背景技術：
基于編碼微球的多元化分析檢測是目前藥物開發研究中的熱點，其中，利用納米量子點(QDs)的發光特性對微球進行編碼是近年才提的新思路，該方法在藥物篩選和納米技術領域具有廣闊的應用前景，尤其適用于新型自編碼光譜識別高通量藥物篩選系統的構建。
在量子點編碼微球的制備過程中，將不同發射波長的量子點按照一定比例吸附在微球表面或者滲入到微球內部，從而對微球進行特定編碼。微球的編碼信號主要是由兩個因素組成的發射波長和熒光強度。發射波長是QDs本身固有特性，與濃度無關；而熒光強度則與微球中所負載的量子點的數量有關。因此，雖然QDs有窄的半峰寬(20～30nm)，但是在可見光400～700nm范圍內，考慮到波長重疊問題，能夠用來編碼的QDs的種類也是有限的。要產生盡量多的編碼，必須對熒光強度進行重點考慮，即嚴格控制負載在微球上的QDs的數量。然而，在已報道的編碼技術中，作為編碼信號的量子點都存在不同程度的泄漏，這導致了微球中量子點數量的改變從而影響到編碼的穩定性，嚴重阻礙了利用不同波長、多個熒光強度的QDs對微球進行密集編碼的實現。見Shuming Nie et al.，NatureBiotech.2001.19.631-635.
發明內容
本發明的目的在于提供一種提高量子點編碼微球的編碼穩定性的方法，該方法可以很好地抑制微球中量子點的泄漏，提高量子點編碼的穩定性和編碼信號的精確性。
本發明提供的一種提高量子點編碼微球的編碼穩定性的方法，其步驟為(1)對待編碼的微球表面進行功能化修飾和多孔化處理；(2)將處理后的微球放入量子點溶液中，吸附到編碼溶液中的熒光強度不再變化后，取出微球進行充分洗滌；(3)將上述量子點編碼微球加入到環己烷、氨水、硅酸酯的混合溶液，其中硅酸酯的體積百分比為1～10％，氨水的體積百分比為0.04-4％，通過硅酸酯水解反應形成硅顆粒沉積在編碼微球表面，形成一層外殼；(4)將上述被包埋的量子點編碼微球與生物探針連接。
步驟(1)采用采用氯磺酸的二氯甲烷溶液對待編碼的微球表面進行多孔化處理，其中，氯磺酸的體積百分比為0.3-1％。
本發明將量子點的熒光光譜特性轉換為微球的編碼信號，進而對微球進行包被處理以獲得穩定的編碼特征。本發明以提高多孔性微顆粒的熒光編碼特別是量子點編碼精確性及其穩定性為研究對象；本發明通過對微顆粒進行處理，使其表面既有功能化接枝的“手臂”分子，又產生多孔性；本發明還通過對摻入多孔性微球的量子點進行固定化包被處理，保護摻入的量子點不被氧化和保護微球不受化學試劑或者生物試劑的破壞。本發明操作簡單，可以推廣到各種微球的編碼應用上，同時還有助于實現快速準確識別，尤其可以促進新型自編碼光譜識別高通量藥物篩選系統的實現。
圖1(a)為量子點的紫外吸收圖，圖1(b為量子點的熒光發射光譜圖；
圖2為微球的紅外光譜圖其中(a)原始微球；(b)-COOH功能化的微球；(c)硅包被微球；圖3為SEM掃描電鏡下微球表面的形貌圖(A)磺化接枝前的微球表面形貌；(B)磺化接枝后的微球表面形貌；圖4為硅包被4小時微球表面的SEM形貌圖；圖5為硅包被對微球上-COOH含量的影響；圖6為不同包被時間對量子點泄漏的影響；圖7為不同包被時間對量子點熒光半衰期(t1/2)的影響，半衰期是通過指數曲線擬合試驗數據得到的，0小時是指沒有包被的微球；圖8為不同處理條件下微球的熒光光譜圖其中(A)PS+DNA；(B)PS+EDC+DNA-FITC；(C)PS-COOH+DNA-FITC；(D)PS-COOH+EDC+DNA-FITC；硅包被條件均為4小時。
具體實施例方式
本發明的具體步驟為(1)對待編碼的微球表面進行功能化修飾和多孔化處理；對各種納米或微米級的微球(如聚合物微球、硅顆粒)，通過物理吸附或化學反應使該微球具備功能化表面，即微球的表面修飾有氨基、羧基、巰基、羥基、鹵素基(包括氟、氯、溴、碘)的分子。
功能化修飾和多孔化處理可同步或分步進行，不受操作順序限制。
采用氯磺酸的二氯甲烷溶液對待編碼的微球表面進行多孔化處理，其中，氯磺酸的體積百分比為0.3-1％。
多孔化處理也可以采用含有甲基丙烯酸酯或苯乙烯同系物的化學試劑。
(2)對上述微球進行量子點編碼將處理后的微球放入QDs溶液中，吸附到編碼溶液中的熒光強度不再變化后，取出微球進行充分洗滌。
其中QDs溶液的配制為根據編碼信號的波長和相對強度，分別將其轉化成量子點的發射波長和摩爾濃度，再根據發射波長確定溶液中量子點的種類，根據摩爾濃度確定這些量子點的濃度比例。
(3)對量子點編碼微球進行穩定化處理將上述量子點編碼微球加入到包被液中，通過包被液中的硅酸酯在堿性條件下水解形成硅顆粒沉積在編碼微球表面從而形成一層外殼，其厚度通過包被時間米控制，該外殼對其負載的量子點進行包埋處理。
其中包被液為環己烷、氨水、硅酸酯的混合溶液，其中硅酸酯的體積百分比為1～10％，氨水的體積百分比為0.04-4％。
(4)連接量子點編碼微球與生物探針。
生物探針包括蛋白質、核酸、糖類、肽等生物分子或醇和羧酸。針對不同的生物探針，采用相應的物理吸附或發生共價化學反應連接量子點編碼微球與生物探針。
包被后表面修飾的功能化分子在與生物探針連接后通過光譜儀能實現對探針信號的檢測。
實施例1下面以量子點編碼聚苯乙烯樹脂微球(PS)的制備為例，對本發明的實施做詳細說明。
(1)稱取0.5g微球，加入含0.8％(vol)氯磺酸的二氯甲烷溶液，攪拌反應0.5小時，吸出殘液，再加入10ml含有4g 6-氨基正己酸的環己烷/蒸餾水(1∶1，體積比)溶液，攪拌反應24小時，過濾取出微球，用0.1M HCl和0.1M的NaOH溶液交替洗滌3次后用蒸餾水洗滌3次，干燥。圖2是通過磺化接枝處理后微球的紅外光譜圖，圖3(B)是通過磺化處理后的微球。
(2)將步驟(1)所得微球0.45g放入5ml QDs溶液中，振蕩吸附1小時，離心，用乙醇洗滌微球至乙醇殘液中無熒光，干燥得到量子點編碼微球。
上述QDs溶液為氯仿/正丁醇(9∶1，體積比)混合液稀釋發射波長在571nm的QDs，使最終的濃度為10-7M。量子點的紫外及其發射光譜見圖1。
(3)將0.40g量子點編碼微球加入到含有7.5ml環己烷、0.2ml氨水(26％，w％)混合液中，再加入0.5ml正硅酸乙酯(TEOS)，振蕩反應2小時，過濾取出微球，用乙醇洗滌3次，干燥；改變反應時間為4、6、8、12、24小時，分別重復此步操作。圖2(c)是硅包被后的紅外光譜圖。圖4為包被時間為4小時的表面形貌圖。
稱取0.1g步驟(3)處理后的微球用3ml的KOH的甲醇溶液(含KOH為2.771mmol)浸泡24h，過濾后保留殘液用蒸餾水洗滌3次，定容至6ml，取2ml稀釋成5ml，用0.01M的HCl標準溶液滴定，作3次平行試驗，計算在不同的硅包被時間下，微球表面的-COOH的含量。結果見圖5，包被4小時剩余-COOH的含量在2.1mmol/g左右。
包被后的微球0.05g用5ml氯仿浸泡，振蕩，每隔一段時間測氯仿中的熒光強度，結果見圖6。
不同包被時間的單個編碼微球在倒置Olympus(IX71)顯微鏡下用汞燈(λ＝400~440nm)連續激發，通過光纖與顯微鏡相連的光譜儀測量其熒光強度的變化，數據經過指數擬合。見圖7，包被時間4小時的值是530秒左右。
(4)經過步驟(3)處理后的微球0.01g室溫下于2ml PBS緩沖液中與3μmol的FITC標記DNA在偶聯劑EDC存在下反應24小時，過濾取出微球，用PBS緩沖液洗滌至殘液中沒有熒光，干燥后用光譜儀測單個微球表面的熒光，結果見圖8。
權利要求
1.一種提高量子點編碼微球的編碼穩定性的方法，其步驟為(1)對待編碼的微球表面進行功能化修飾和多孔化處理；(2)將處理后的微球放入量子點溶液中，吸附到編碼溶液中的熒光強度不再變化后，取出微球進行充分洗滌；(3)將上述量子點編碼微球加入到環己烷、氨水、硅酸酯的混合溶液，其中硅酸酯的體積百分比為1～10％，氨水的體積百分比為0.04-4％，通過硅酸酯水解反應形成硅顆粒沉積在編碼微球表面，形成一層外殼；(4)將上述被包埋的量子點編碼微球與生物探針連接。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(1)采用采用氯磺酸的二氯甲烷溶液對待編碼的微球表面進行多孔化處理，其中，氯磺酸的體積百分比為0.3-1％。
全文摘要
本發明屬于藥物化學和分析技術領域，具體為一種提高量子點編碼微球的編碼穩定性的方法。其步驟為對待編碼的微球表面進行功能化修飾和多孔化處理；將處理后的微球放入量子點溶液中，吸附均勻后取出微球洗滌；再將量子點編碼微球加入到環己烷、氨水(0.04－4％vol)和硅酸酯(1～10％vol)的混合液，通過水解反應形成硅顆粒沉積在微球表面，形成外殼；最后將被包埋的微球與生物探針連接。本發明通過微顆粒表面處理，使其表面既有功能化接枝的“手臂”分子，又產生多孔性；并通過包被處理保護摻入的量子點不被氧化和保護微球不受化學或生物試劑的破壞。本發明方法簡單，易行，能利用預提取的編碼特征對微球進行準確識別，有助于高通量藥物篩選系統的實現。
文檔編號B82B3/00GK1775654SQ20051001962
公開日2006年5月24日 申請日期2005年10月19日 優先權日2005年10月19日
發明者曹元成, 黃振立, 趙元弟, 王海橋 申請人:華中科技大學