專利名稱：乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶的方法
技術領域：
本發明涉及微生物學、酶工程、發酵工程、生物化學、食品化學、食品科學、食品安全等領域，具體涉及一種乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶的方法。該發明生產的亞硝酸還原酶主要應用于消除農產品、食品、飼料和環境中亞硝酸鹽殘留，提高食品安全和食品質量，減少亞硝酸鹽引起的食物中毒和癌癥發生率。
背景技術：
農業生產氮肥大量施用，N、P、K比例失調，使環境中硝酸鹽、亞硝酸鹽大量富集，致使農產品、食品及飼料中大量亞硝酸鹽殘留。亞硝酸鹽是一種對人體有害的物質，它不僅使人、畜和禽直接中毒、致死；而且是致癌物亞硝胺的前體。據我國衛生部食品衛生監督檢驗所對北京、河南、青島、吉林地區的蔬菜、糧食、鮮魚類、鮮肉類、鮮蛋類、食鹽、醬腌菜、乳與乳制品中亞硝酸鹽分析，調查結果表明，市場供應的正常八大類食品均有亞硝酸鹽被檢出，其中醬腌菜的檢出率高達94.7％，最高值為85.6mg/kg。據山東省食品衛生監督檢驗所食物中毒資料顯示1983～1997年全省共發生亞硝酸鹽引起的食物中毒82起，發病1089人，造成死亡39人。亞硝酸鹽中毒，潛伏期最短為10min，最長的4h，平均在30min左右發病。據不完全統計，目前全國的發病率增加了十幾倍甚至幾十倍。因此，采取有效措施消除和減少農產品、食品、飼料和環境中亞硝酸鹽殘留是食品安全生產、提高食品質量，減少亞硝酸鹽引起的食物中毒和癌癥發生率的必要條件。查新表明消除農產品、飼料、食品及環境中亞硝酸鹽殘留國內外還沒有比較科學、便捷、有效、快速的方法。
亞硝酸還原酶是降解亞硝酸鹽最有效途徑。亞硝酸鹽在亞硝酸還原酶的作用下轉化為氨，可表示為因此，在農產品、食品、飼料和環境中加入亞硝酸還原酶可以快速降解亞硝酸鹽，排除其對人類的危害和致病性。利用對人有益的乳酸菌發酵生產的亞硝酸還原酶，在原料前處理時期添加0.01‰～0.5‰的亞硝酸還原酶，在20～60℃保溫5～60min，即可將殘留于農產品、食品、飼料和環境中的亞硝酸鹽完全降解。在應用上解決了亞硝酸鹽殘留對人、畜和禽產生的危害和致病性。
發明內容
本發明的目的是提供一種乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶的方法，該方法是在26～32℃、亞硝酸鹽誘導下乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶的方法，這種生產方法獲得的亞硝酸還原酶粗酶液活性可以達到2600U/ml，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度和純度的酶制劑。當該酶的活性為1000U/ml或1000U/g，0.01‰～0.5‰的使用量應用于農產品、食品、飼料和環境中，在20～60℃保溫5～60min可以將殘留的亞硝酸鹽完全降解。利用亞硝酸還原酶消除亞硝酸鹽殘留操作簡單、方便、快捷、成本低、安全可靠。可以從根本上解除亞硝酸鹽殘留引起人、畜和禽直接中毒、致死、致癌的危害。
本發明所述的一種乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶的方法具體包括以下步驟(1)將產生亞硝酸還原酶的乳酸菌進行活化、按常規方法逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(2)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3～8％接種量接入液體產酶培養基中，在26～32℃培養36～72h時，添加40～150mg/L亞硝酸鹽，再培養12～24h，即乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶結束；(3)將(2)的發酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(4)用(3)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后在8,000～10,000rpm離心收集乳酸菌菌體，重復上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(5)將(4)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(6)將(5)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
(7)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
本發明中使用的菌種來源于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，可商購獲得，活化和生長條件按菌種保藏單位提供的說明進行。亞硝酸還原酶產生乳酸菌(例如，CGMCC菌種編號1.11或1.19或1.557或1.2029或1.1480或1.1878等)，菌株活化后發酵生產亞硝酸還原酶時按產酶條件進行培養，該菌株在4℃環境中可保存4個月。
具體實施例方式實施例一(1)、培養基制備①菌種活化培養基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH值6.8，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②液體種子培養基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，自來水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③產酶培養基酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸鈉0.5～2.0g，檸檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自來水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產生亞硝酸還原酶的乳酸菌，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行活化；(3)將(2)活化好的乳酸菌接種3針至5ml的液體種子試管中，在26～28℃培養48～72h，而后按5％的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(4)將(3)制備的二級種子按發酵液體積3～5％的接種量接入10L的產酶培養基中，在26～28℃培養60～72h時，添加40～80mg/L亞硝酸鹽，再培養12～24h，即乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶結束。
(5)將(4)的發酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(6)用(5)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的磷酸鹽緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后在8,000～10,000rpm離心收集乳酸菌菌體，重復上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(7)將(6)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(8)將(7)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
(9)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(8)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
實施例二(1)、培養基制備①菌種活化培養基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH值6.8，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②液體種子培養基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，自來水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③產酶培養基酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸鈉0.5～2.0g，檸檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自來水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產生亞硝酸還原酶的乳酸菌，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行活化；(3)將(2)活化好的乳酸菌接種3針至5ml的液體種子試管中，在28～30℃培養48～60h，而后按5％的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(4)將(3)制備的二級種子按發酵液體積6～8％的接種量接入20L的產酶培養基中，在28～30℃培養36～48h時，添加81～120mg/L亞硝酸鹽，再培養12～24h，即乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶結束。
(5)將(4)的發酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(6)用(5)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的磷酸鹽緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后在8,000～10,000rpm離心收集乳酸菌菌體，重復上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(7)將(6)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(8)將(7)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
(9)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(8)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
實施例三(1)、培養基制備①菌種活化培養基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgS04·7H2O0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，瓊脂15.0g，蒸餾水1.0L，pH值6.8，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
②液體種子培養基酪蛋白胨10.0g，牛肉提取物10.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸鈉5.0g，檸檬酸二胺2.0g，Tween 80 1.0g，K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·H2O0.05g，CaCO320.0g，自來水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
③產酶培養基酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸鈉0.5～2.0g，檸檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自來水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
(2)將產生亞硝酸還原酶的乳酸菌，按中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)提供的菌株說明進行活化；(3)將(2)活化好的乳酸菌接種3針至5ml的液體種子試管中，在30～32℃培養36～48h，而后按5％的接種量進行逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(4)將(3)制備的二級種子按發酵液體積3～5％的接種量接入50L的產酶培養基中，在30～32℃培養36～48h時，添加121～150mg/L亞硝酸鹽，再培養12～24h，即乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶結束。
(5)將(4)的發酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(6)用(5)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的磷酸鹽緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后在8,000～10,000rpm離心收集乳酸菌菌體，重復上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(7)將(6)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(8)將(7)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
(9)根據不同需要和使用對象不同，還可以將(8)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
實施例四按實施例一、二和三方法生產的乳酸菌亞硝酸還原酶，經測定，粗酶液平均酶活性為2600U/ml，如再經過分離和純化，可以得到不同活性、純度和劑型的酶制劑。將活性為1000U/ml或1000U/g的亞硝酸還原酶，按原料重量0.01‰～0.5‰的量添加于農產品、食品、飼料和環境中，在20～60℃處理5～60min進行亞硝酸鹽檢測，檢測結果見下表。
檢測結果表明殘留于農產品、食品、飼料和環境中的亞硝酸鹽，經亞硝酸還原酶制劑處理，亞硝酸鹽完全降解；同時也說明亞硝酸還原酶是消除亞硝酸鹽殘留最簡單、方便、快捷，有效的方法。
權利要求
1.一種乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶的方法，其包括以下步驟(1)將產生亞硝酸還原酶的乳酸菌按常規方法進行活化、逐級擴大培養，制備成液體一級種子和二級種子；(2)將液體一級種子或二級種子，按發酵液體積的3～8％接種量接入液體產酶培養基中，在26～32℃培養36～72h時，添加40～150mg/L亞硝酸鹽，再培養12～24h；(3)將(2)的發酵液在8,000～10,000rpm，離心收集乳酸菌菌體；(4)用(3)收集到的菌體體積2～3倍pH值7.0的緩沖液清洗，待菌體完全懸浮后，在8,000～10,000rpm下離心收集乳酸菌菌體，重復上述清洗菌體操作2～3次，最終將菌體制備成乳酸菌菌懸液；(5)將(4)制備成的乳酸菌菌懸液減壓破碎菌體；(6)將(5)得到的菌體破碎懸液在12,000～140,000rpm、4℃離心，收集到的上清液即為粗酶液。
2.根據權利要求1所述的方法，在步驟(6)之后包括將步驟(6)得到的粗酶液進一步濃縮、分離純化，制備成不同活性、純度和劑型的酶制劑。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其中液體產酶培養基為酪蛋白胨3.0～7.0g，牛肉提取物2.0～8.0g，酵母提取物3.0～9.0g，玉米淀粉糖3.0～10.0g，乙酸鈉0.5～2.0g，檸檬酸二胺0.6～2.0g，Tween80 0.3～1.4g，K2HPO40.4～1.5g，CaCO320.0g，自來水1.0L，pH值7.0，121℃高壓蒸氣滅菌30min。
全文摘要
本發明提供一種乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶的方法，將產生亞硝酸還原酶的乳酸菌進行活化、按常規方法逐級擴大培養，制備成液體種子；按發酵液體積的3～8％接種量接入液體產酶培養基中，在26～32℃培養36～72h時，添加40～150mg/L亞硝酸鹽，再培養12～24h，即乳酸菌發酵生產亞硝酸還原酶結束；這種生產方法獲得的亞硝酸還原酶粗酶液活性可以達到2600U/ml，如再經過分離和純化，可以得到不同濃度、純度和劑型的酶制劑。
文檔編號C12N9/02GK1687408SQ200510073389
公開日2005年10月26日 申請日期2005年6月3日 優先權日2005年6月3日
發明者張慶芳, 遲乃玉 申請人:張慶芳, 遲乃玉