專利名稱：：轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法
技術領域：
：本發明涉及作物分子育種與抗性育種
技術領域：
，尤其是轉Bt基因甘蔗抗蟲性鑒定方法。技術背景甘蔗螟蟲是我國蔗區廣泛發生且為害最為嚴重的一類甘蔗害蟲。因甘蔗螟蟲為害造成甘蔗損失一般達10%25%，重者可達40%60%，同時還導致甘蔗糖分損失和誘發某些莖部病害。甘蔗螟蟲是鱗翅目的一類鉆蛀性害蟲。我國蔗區常見的甘蔗螟蟲有條螟、二點螟、黃螟、大螟和白螟等，其中，條螟(/Vocemyvewo犯^附Walker)是為害最為嚴重的一種甘蔗螟蟲。甘蔗條螟在全國各蔗區都有發生。條螟為害在甘蔗苗期造成枯心，甘蔗拔節后造成螟害節、枯梢(死尾)、大量長側芽，遇大風時形成風折莖，導致甘蔗產量和糖分嚴重損失。由于甘蔗本身缺乏抗源，甘蔗抗螟育種未取得大的進展，生產上沒有真正的抗螟品種。雖有螟害相對較輕的品種，但多是纖維份較高而不利于螟蟲取食的品種，其工藝性狀一般也較差。多數豐產高糖的甘蔗良種也是螟害較重的品種。長期以來，甘蔗螟蟲防治主要以農藥防治為主。長期大量使用殺蟲劑，既增加了生產成本，也造成環境污染，破壞生態平衡。值得注意的是，螟蟲的發生和為害并未因連年施用大量殺蟲劑而得到理想的控制。通過分子育種手段，導入外源抗蟲基因，選育抗蟲甘蔗品種并因地制宜地推廣應用，可望有效地控制甘蔗螟蟲的種群增長，大幅度減少農藥施用量和施用次數，減輕蟲害造成的損失。這無疑對增產增收、降低生產成本和減少環境污染都有著重大的意義。蘇云金芽孢桿菌(5a"7/u^/nW"g/e"^，簡稱Bt)能產生蛋白性質的伴孢晶體，對多種昆蟲、線蟲、螨類等原生動物具有特異的殺蟲活性對人畜無害，不污染環境，因而被廣泛應用于害蟲的生物防治。其中Cryl系列的S—內毒素對鱗翅目a印Wo/7fera)害蟲特別有效，因而CryI中的許多基因已被廣泛用于植物的抗蟲基因工程。將Bt基因導入栽培甘蔗，將可解決甘蔗自身抗蟲基因源缺乏的問題，育成抗蟲品種。ArencibiaA等人(MolBreeding1997，3:247-255)將cryIAb基因構建于CaMV35S啟動子下游，轉化甘蔗，CryIAb蛋白在轉基因甘蔗中的表達量不高，無法高效地抵抗甘蔗鉆心蟲。這可能是由于適用于雙子葉植物的CaMV35S啟動子在單子葉植物中表達不佳(AdangMJ,PlantMolBiol1993,21:1131-1145)。Dawen等人(PlantScience2003,165:743-750)報道，在轉基因甘蔗中PUbi啟動子(玉米泛激素啟動子)可帶動GUS基因表達，但測不到在CaMV35S啟動子下GUS基因的表達。我們在甘蔗的轉基因瞬間表達試驗中也發現，PUbi啟動子比CaMV35S啟動子強56倍(Weng,Li-Xing等，PestManagementScience,2005InPress),獲得一批高表達的轉Bt基因抗蟲甘蔗品系。抗蟲性評價是轉基因抗蟲育種的一道重要程序。轉Bt基因甘蔗抗蟲性可通過標記基因檢測、目的基因檢測、毒蛋白檢測和生物測定等方法來評價，但最終都要以自然條件下生長甘蔗的抗蟲表現為依據，即要經過田間條件或模擬田間條件的試驗來評價。田間抗蟲性鑒定的試驗周期長，受自然條件影響(如蟲源的自然分布、天敵干擾和風、雨影響等)大，很多不能人為控制的因素導致試驗處理間條件的不一致性和試驗結果的可比性，往往需要多年多試驗的結果去作綜合評價，因此難于在短時間內得到可靠的試驗結果。人工接蟲鑒定可有效地避免田間不可控因素的影響，并可在較短時間內獲得結果。但以往人工接蟲鑒定是以田間采集蟲卵，室內孵化出幼蟲為接種蟲源。螟蟲卵天敵自然寄生率高(達90%左右，甚至更高)，難于得到足夠的幼蟲供試驗之需，特別是待鑒定品系較多時。同時由于試驗蟲源來源不一致和接蟲時間難于統一而影響測定結果。甘蔗條螟是發生最普遍、為害最嚴重的螟蟲，幼蟲在心葉取食，入侵后第2天就可見其取食留下的食痕(俗稱"花葉")，食量大，中毒表現也快。本發明以甘蔗條螟為代表螟蟲種類，主要技術特征(l)用于試驗的螟蟲種類具有較好的代表性，為害癥狀出現快、明顯可見，并有特異性，容易觀察和調查；(2)試驗蟲源來源和接蟲時間一致，接到每株待鑒定甘蔗上的幼蟲的來源和數量具可比性，并將同一來源的幼蟲在同一時間段平均分配到各株待測甘蔗植株上；(3)適宜的試驗甘蔗培育方法和抗螟性評價方法，在接蟲后710天可得到試驗結果。
發明內容本發明的目的是提出一種轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法，其可在室內環境下進行，具有試驗周期短，可排除田間天敵和特殊天氣(如暴風雨)的影響，試驗結果可靠等優點。本發明的目的可通過如下途徑來實現一種轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法，其特征在于包括如下步驟A.溫室桶栽甘蔗；B.蟲源選擇以初孵化的條螟幼蟲為試驗蟲源；C.人工接蟲將步驟B的蟲源人工接蟲到步驟A的桶栽甘蔗上；D.抗性評價經步驟C的人工接蟲7天后調查結果，根據幼蟲的成活率、甘蔗的受害程度綜合評價參試甘蔗品系的抗蟲性。其中步驟B中，對同一批待評價轉基因甘蔗品系的試驗蟲源，可以為同一頭甘蔗條螟雌蛾所產卵的初孵幼蟲，也可以是將23頭雌蛾產生的初孵幼蟲分別平均分配到每株待測蔗株。步驟B中獲得試驗蟲源的步驟如下Bl.在蔗田采集甘蔗條螟的蛹，置于盒內，在室內條件下羽化，讓雌、雄蛾自然交配；B2.選擇成功交配后的雌蛾，放入透明的塑料瓶內，每瓶1頭雌蛾，待其產卵后4天內，用剪刀或小刀將卵塊連同塑料瓶壁逐一取下，在體視鏡下計算每塊卵粒數，并將卵塊置于放有吸水紙的培養皿內保濕；根據同一雌蛾產的總卵粒數和待接蟲的試驗甘蔗的株數，計劃每株甘蔗接蟲的數量；作為優化，步驟C中接蟲時間的確定發現卵中有小黑點時，即做好接蟲的準備，有幼蟲孵化時立即開始接蟲。作為優化，步驟A中，在溫室內桶栽培育待進行抗螟性鑒定的轉Bt基因甘蔗品系及其受體品種，每桶下種4個蔗芽，成苗后每桶留苗24株；選擇株高11.5米的甘蔗作為試驗的適宜株齡；步驟C中，將初孵的幼蟲按計劃接蟲的數量接至每株試驗甘蔗的心葉部，每株甘蔗的心葉接上10頭的初孵條螟幼蟲，接蟲持續時間為12天；步驟D中，接蟲第2天后可觀察心葉的受害狀，5天后調查幼蟲的生存情況和蔗株受害程度，按"抗蟲蔗株條螟侵害程度分級標準"評定參試品系的抗性級別。作為進一步優化，步驟C中，要求同一試驗的每株甘蔗同一天接入相同數量的來自同一雌蛾的初孵幼蟲。與現有技術相比，本發明具有如下突出的實質性特點和顯著進步(1)以甘蔗條螟(尸raceraswmw^"mWalker)為代表蟲類，其在我國蔗區發生最普遍、為害最嚴重，入侵取食后癥狀出現快而明顯；(2)以采條螟蛹在室內羽化，在控制條件下獲得蟲卵，以初孵化的條螟幼蟲(一齡幼蟲)為試驗蟲源，解決了卵寄生天敵影響的問題，蟲源獲取方法的可操作性強。(3)每個試驗只用同一雌蛾產的卵的初孵幼蟲為蟲源，或將23頭雌蛾產生的初孵幼蟲分別平均分配到每株待測蔗株，最大限度地減少試驗蟲源個體之間的差異，確保抗蟲性鑒定結果的準確性；(4)試驗周期短，在接蟲后710天可得到試驗結果。(5)排除了田間天敵和特殊天氣(如曝風雨)的影響，試驗結果可靠。圖1轉基因甘蔗與對照(非轉基因)接蟲后第7天條螟幼蟲生長狀況和甘蔗受害程度比較圖中，A:中等抗性,幼蟲明顯滯育；B:強抗性，幼蟲少量取食后即死亡；C:對照(非轉基因)，幼蟲生長正常；D:7天蟲齡的幼蟲，左為對照株的幼蟲，右為轉基因蔗株的幼蟲；E:蔗莖受害狀況，左為轉基因株，右為對照株。圖2人工接蟲后15天后甘蔗受害狀比較圖中，左對照(非轉基因)，全部蔗株被害，枯心，長側芽。右轉Bt品系，螟蟲未能侵入，蔗株無蟲害。具體實施方式以下用一具體實施例對本發明作進一步的說明一種轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法，其包括如下步驟步驟A.種植轉Bt基因甘蔗植株將含Bt基因的轉化植株粵糖79-177系列5個品系(編號分別為Yl、Y2、Y3、Y4禾BY5)和新臺糖16號系列8個品系(編號分別為T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7和T8)桶栽于溫室內，每桶下種4個蔗芽，成苗后每桶留苗24株。并同時于溫室內種植未轉基因的甘蔗品種粵糖79-177(Yck)和新臺糖16號(Tck)為對照，作抗蟲鑒定用。選擇株高達11.5米的蔗株作為試驗甘蔗。步驟B.獲取試驗蟲源本發明用的螟蟲是甘蔗條螟的初孵幼蟲。(1)7月中旬在蔗田采集甘蔗條螟的蛹，置適當大小的紙盒內，在室內條件下羽化，讓雌、雄蛾自然交配。(2)選擇成功交配后的雌蛾，放入透明的塑料瓶內，每個瓶1頭雌蛾。待其產卵后4天內，用剪刀或小刀將卵塊連同塑料瓶壁逐一取下，在體視鏡下計算每塊卵粒數，并將卵塊置于放有吸水紙的培養皿內保濕。根據同一雌蛾產的總卵粒數和待接蟲的試驗甘蔗的株數，計劃每株甘蔗接蟲的數量，待其孵化后作轉Bt基因甘蔗抗蟲試驗用蟲源。步驟C.接蟲每天早上89時觀察蟲卵，發現卵中有小黑點，表明即將孵化，有幼蟲孵化即開始接蟲。將初孵幼蟲接種于甘蔗的心葉上。以受體甘蔗品種(未轉基因)為對照。每株甘蔗的心葉接上10頭的初孵甘蔗條螟幼蟲。如果1頭雌蛾產生的幼蟲不足于一批材料接蟲，可用23頭雌蛾產生的幼蟲作混合蟲源，此時應將來自同一雌蛾的初孵幼蟲各自平均分配到各株待測蔗株上。步驟D.調査及抗性評價接蟲第2天即可觀察心葉的受害狀，5天后調査幼蟲的生存情況和蔗株受害程度，按抗蟲蔗株條螟侵害程度制定分級標準，評定參試品系的抗性級別。抗蟲性評價根據幼蟲死亡率和甘蔗螟害程度綜合評價轉Bt甘蔗的抗蟲性。根據試驗結果，蔗株的受害程度與存活幼蟲生存狀況的關系較幼蟲死亡率要大。有些蔗株中幼蟲存活不多，但生長正常，蔗株的受害仍較嚴重；而有些蔗株幼蟲存活較多，但表現呆滯，取食量小，侵害性不強，蔗株受害程度較輕。據此，蔗株的受害程度可用幼蟲的生長狀態、取食位置和食痕嚴重程度等指標制定出分級評價的參考標準(表l)。表l分級標準中，l級和2級為幼蟲僅少量取食后即死亡，蔗株表現出很強的抗蟲性；3級為幼蟲有明顯的生長滯后現象食量小、生長慢、取食位置轉移速度慢；4級為幼蟲有較輕的滯育現象，植株抗蟲性較弱；5級的則在調査時與對照品種基本無差異。表1抗蟲蔗株條螟侵害程度分級標準(接蟲后第7天調查)螟害級別描述1心葉只有少量針點狀取食痕跡，無穿孔，無糞屑2心葉少量食孔，見干糞屑，但無新鮮食跡和糞屑3心葉大量食孔食跡(花葉)，少或無新鮮食跡和蟲糞，幼蟲仍在心葉葉片上取食，存活幼蟲個體明顯比對照的小4花葉嚴重，1/3以上幼蟲已轉入葉鞘部取食，存活幼蟲蟲體或蟲齡與對照的相近5花葉嚴重，多數幼蟲在葉鞘和蔗莖組織取食，有螟害節鑒定結果與分析試驗結果表明2個對照品種，即Yck和Tck，接入的幼蟲全部存活；轉Bt基因品系中，除Y1、Y5、T3和T4夕卜，其它9個品系均表現出較強的抗蟲性，其中Y2、Y3、Y4、Tl、T2、T5禾QT6等7個品系，接蟲后第7天幼蟲死亡率達100%，丁7和丁8分別達83.3%和75%，見表2。侵食Bt甘蔗的幼蟲主要表現為死亡和生長發育進度減緩，蔗株表現為食痕少、不出現"花葉"或"花葉"癥狀較輕，無或少螟害節和枯心，如圖1和圖2所示。表2溫室試驗感蟲后第7天條螟幼蟲死亡率和螟害級別<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權利要求1.一種轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法，其特征在于包括如下步驟A.溫室桶栽甘蔗；B.蟲源選擇，以初孵化的條螟幼蟲為試驗蟲源；C.人工接蟲，將步驟B的蟲源人工接蟲到步驟A的桶栽甘蔗上；D.抗性評價，經步驟C的人工接蟲5天后調查結果，根據幼蟲的成活率、甘蔗的受害程度綜合評價參試甘蔗品系的抗蟲性；其中步驟B中對同一批待評價的轉Bt基因甘蔗品系的試驗蟲源為同一頭條螟雌蛾所產卵的初孵幼蟲。2.—種轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法，其特征在于包括如下步驟A.溫室桶栽甘蔗；B.蟲源選擇，以初孵化的條螟幼蟲為試驗蟲源；C.人工接蟲，將步驟B的蟲源人工接蟲到步驟A的桶栽甘蔗上；D.抗性評價，經步驟C的人工接蟲5天后調査結果，根據幼蟲的成活率、甘蔗的受害程度綜合評價參試甘蔗品系的抗蟲性；其中步驟B中對同一批待評價的轉Bt基因甘蔗品系的試驗蟲源為將23頭條螟雌蛾產的初孵幼蟲分別平均分配到每株待測蔗株。3.如權利要求1或2所述的轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法，其特征在于步驟B中獲得試驗蟲源的步驟如下Bl.在蔗田采集甘蔗條螟的蛹，置于盒內，在室內條件下羽化，讓雌、雄蛾自然交配；B2.選擇成功交配后的雌蛾，放入透明的塑料瓶內，每瓶1頭雌蛾，待其產卵后4天內，用剪刀或小刀將卵塊連同塑料瓶壁逐一取下，在體視鏡下計算每塊卵粒數，并將卵塊置于放有吸水紙的培養皿內保濕。4.如權利要求3所述的轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法，其特征在于步驟C中人工接蟲時間的確定發現卵中有小黑點時，即做好接蟲的準備，有幼蟲孵化時立即開始接蟲。5.如權利要求1或2所述的的轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法，其特征在于步驟A中，在溫室內桶栽培育待進行抗螟性鑒定的轉Bt基因甘蔗品系及其受體品種，每桶下種4個蔗芽，成苗后每桶留苗24株；選擇株高11.5米的甘蔗作為試驗的適宜株齡；步驟C中，將初孵的幼蟲按計劃接蟲的數量接至每株試驗甘蔗的心葉部，每株甘蔗的心葉接上10頭初孵條螟幼蟲，接蟲持續時間為12天；步驟D中，接蟲第2天后觀察心葉的受害狀，5天后調查幼蟲的生存情況和蔗株受害程度，按"抗蟲蔗株條螟侵害程度分級標準"評定參試品系的抗性級別。6.如權利要求5所述的的轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的快速鑒定方法，其特征在于:步驟C中，要求同一試驗的每株甘蔗同一天接入相同數量的來自同一雌蛾的初孵幼蟲。全文摘要本發明涉及一種轉Bt基因甘蔗對螟蟲抗性的人工接蟲快速鑒定方法，包括溫室桶栽甘蔗、蟲源選擇、人工接蟲和抗性評價步驟，其中對同一批待評價的轉Bt基因甘蔗品系的試驗蟲源為同一頭甘蔗條螟雌蛾所產卵的初孵幼蟲，或將2～3頭雌蛾產生的初孵幼蟲分別平均分配到每株待測蔗株，對桶栽試驗甘蔗進行人工接蟲5天后調查結果，根據幼蟲的成活率、甘蔗的受害程度綜合評價參試甘蔗品系的抗蟲性。本發明的最顯著的特點是1.最大限度地保證試驗蟲源的一致性和接蟲時間的統一性，確保鑒定結果的準確性；2.抗蟲性鑒定周期短，7～10天即可得到試驗結果；3.不存在田間條件下天敵和特殊的天氣(如暴風雨)的影響，試驗結果可靠；4.本方法可操作性強。文檔編號G01N33/00GK101113977SQ20071002730公開日2008年1月30日申請日期2007年3月27日優先權日2007年3月27日發明者勞方業,瓊張,徐金玲,李奇偉,楊湛端,汪聯輝,沈萬寬,翁麗星,鄧海華,陳仲華,陳海寧,黎教良申請人:廣州甘蔗糖業研究所;翁麗星;徐金玲;汪聯輝