專利名稱：一種北美大豆猝死綜合癥病菌活性檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種微生物活性檢測方法，特別是涉及一種北美大豆猝死綜合癥病菌 (Fusarium virguliforme 0’ Donnell et Τ. Aoki)的活性檢測方法。
背景技術：
北美大豆猝死綜合癥病菌(Fusariumvirguliforme 0，Donnell etT. Aoki)是引起大豆猝死綜合癥(Sudden Death Syndrome，簡稱SDQ的病原菌之一，主要分布在美國、 加拿大、阿根廷等國家，在我國還未有該病菌發生危害的報道(吳品珊等，200 。其病害分布廣，危害大，2003年 2005年，該病害對美國大豆產量造成的損失累計達到189萬噸 (ffrather et al. ，2006)。目前對北美大豆猝死綜合癥病菌的檢測主要是分子生物學方法，如PCR等，這類方法能準確、靈敏、快速的檢測出北美大豆猝死綜合癥病菌，但是不能檢測其活性。最新發布的國際標準(ISPM. 27)指出，在鑒定進境產品是否攜帶檢疫性有害生物的同時，要對病原菌活性要進行描述。但目前對北美大豆猝死綜合癥病菌的活性檢測分析研究較少，主要采用傳統的孢子萌發Colony Forming Units (CFU)計數法，該方法雖然對活性的檢測準確、可靠，但檢測時間較長。另外，還有基于北美大豆猝死綜合癥病菌分離培養的分子檢測方法，該方法對孢子進行分子檢測，可替代對孢子萌發法檢測孢子活性，縮短了檢測時間， 且針對單個孢子即可進行活性檢測。其它活性檢測方法，如單細胞分析系統活性檢測法， 雖然檢測時間短，最短檢測時間僅需20分鐘，但對樣品中孢子濃度要求較高，至少需菌量 1000 2000個孢子，使得該方法在樣品稀少時無法進行活性檢測。
發明內容
本發明的目的是針對目前北美大豆猝死綜合癥病菌活性檢測中存在的檢測時間長或需要孢子量大等問題，提供一種新的檢測時間短、所需孢子量極少，甚至1個孢子即可進行的北美大豆猝死綜合癥病菌活性檢測方法。為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案本發明公開了一種檢測北美大豆猝死綜合癥病菌活性的方法，所述方法采用碘化丙啶為染料對北美大豆猝死綜合癥病菌孢子進行染色檢測。所述染色方法中染色孢子采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察，活孢子染色后孢子內部沒有熒光，而死孢子內部顯示紅色熒光。所述激光掃描共聚焦顯微鏡參數設置包括熒光信號激發波長為480-500nm，熒光信號發射波長為555-565nm。所述碘化丙啶的染色濃度為0. 000025mmol/L-0. 0025mmol/L,優選為 0.000025mmol/L-0. 0000625mmol/L。所述碘化丙啶的染色時間為15min-30min，優選為15min。由于采用以上技術方案，本發明的有益效果在于
本發明的活性檢測方法用于北美大豆猝死綜合癥病菌的活性檢測，能夠有效的區分孢子的死活，從制樣到檢測完成僅需要30分鐘，可以直接對單個孢子的染色情況進行死活判斷。本發明具有快速、準確、靈敏、重復性好等特點，有望替代傳統的孢子萌發方法，適合于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。
圖1為本發明一種實施例的北美大豆猝死綜合癥病菌單個孢子活性檢測圖，圖中 A和B為活孢子的掃描結果圖，A為激光掃描通道下的掃描結果，B為明場通道下的掃描結果，C和D為死孢子的掃描結果圖，C為激光掃描通道下的掃描結果，D為明場通道下的掃描
結果；圖2為本發明另一種實驗例中北美大豆猝死綜合癥病菌2個孢子活性檢測中染色條件篩選結果圖，圖中A和B為活孢子的掃描結果圖，A為激光掃描通道下的掃描結果，B為明場通道下的掃描結果，C和D為死孢子的掃描結果圖，C為激光掃描通道下的掃描結果，D 為明場通道下的掃描結果。
具體實施例方式本發明公開了一種北美大豆猝死綜合癥病菌活性檢測方法，包括如下步驟(1)孢子懸浮液配制；用滅菌去離子水配置北美大豆猝死綜合癥病菌孢子懸浮液，收集于1. 5mL離心管中，振蕩混勻，IOOOOrpm離心lmin，棄上清收集孢子；再加入ImL滅菌去離子水洗滌孢子，IOOOOrpm離心lmin，棄上清，最后加入ImL滅菌去離子水重懸，獲得孢子懸浮液，濃度約為IO5-IO6個/mL。(3)孢子染色處理；采用碘化丙啶對孢子懸浮液進行染色，室溫下避光染色 15min-30min,優選15min，離心移棄含有染料的上清液，終止染色，滅菌蒸餾水洗滌兩次，重懸孢子，制片。所用染料碘化丙啶與孢子懸浮液混合后，碘化丙啶在混合液中的適合染色終濃度應在0. 000025mmol/L-0. 0025mmol/L 濃度范圍內，優選0. 000025mmol/ L-0. 0000625mmol/L。(4)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察；采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察對染色制片的孢子進行觀察，為確保掃描的準確性，觀察明場通道下所得孢子圖像是否清晰。顯微鏡參數設置如下物鏡Objective為63倍油鏡，激光管為氬離子激光器，熒光信號激發波長為480-500nm，熒光信號發射波長為555-565nm，設置一個明場通道作為對照，探測針孔 Pinhole為IAU即IAiry Units = 0. 8 μ m，光電倍增管增益feiin為560，激光掃描強度Scan Str為5%，掃描模式為line，重復掃描次數Average為2，掃描速度kan speed為6，精確掃描方式xy為2048X2048。(5)結果判定；根據激光掃描共聚焦顯微鏡對單個孢子的染色情況掃描結果進行判斷，活孢子染色后孢子內部沒有熒光，而死孢子內部顯示紅色熒光(圖1)。為確保檢測的準確性，每個樣品隨機觀察30個孢子。其中，碘化丙啶染色法通常應用于植物和動物的細胞染色，由于真菌的孢子外壁及膜成分組成與動植物的細胞不同，研究對象的不同，會造成結果的差異，適合植物或動物細胞活性染色的染料不一定適合真菌孢子染色，因此需要進行詳細的實驗論證才能篩選出適合真菌活性染色檢測的染料和染色條件。下面通過具體實施例和實驗例并結合附圖對本發明作進一步詳細說明。以下實施例和實驗例僅僅對本發明進行進一步的說明，不應理解為對本發明的限制。實施例北美大豆猝死綜合癥病菌活性檢測一、材料和儀器北美大豆猝死綜合癥病菌菌株ARG1. 1，碘化丙啶，LSM5E)(CITER激光掃描共聚焦顯微鏡GEISQ，DK-S28電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)。二、實驗方法以北美大豆猝死綜合癥病菌ARG1. 1作為實驗材料，新鮮配制的孢子懸浮液lmL， 分裝為兩組一組為未經水浴處理的活孢子(unkilled，UK)，另一組為經50°C水浴處理 3min的死孢子，表示為killed (K)。取初始濃度0. 5mmol/L的碘化丙啶(溶解于DMS0) 1 μ L 加入200 μ L孢子懸浮液，混勻，碘化丙啶染色終濃度為0. 0025mmo 1/L，室溫避光染色 15min，13000rpm離心Imin去上清液，加入滅菌去離子水200 μ L洗滌一次，離心去上清，加滅菌去離子水50 μ L重懸，制片，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察對染色制片的孢子進行觀察，顯微鏡參數設置如下物鏡Objective為63倍油鏡，激光管為氬離子激光器，熒光信號激發波長為 488nm，熒光信號發射波長為560nm，設置一個明場通道作為對照，探測針孔Pinhole為IAU 即IAiry Units = 0. 8μπι，光電倍增管增益feiin為560，激光掃描強度kan Str為5%， 掃描模式為line，重復掃描次數Average為2，掃描速度kan speed為6，精確掃描方式xy 為 2048X2048。三、實驗結果根據激光掃描共聚焦顯微鏡掃描結果，活孢子經過碘化丙啶染色后孢子內部沒有熒光，而死孢子顯示紅色熒光(圖1)。實驗例1 碘化丙啶染色濃度和時間篩選一、材料和儀器北美大豆猝死綜合癥病菌菌株ARG1. 1，碘化丙啶，LSM5E)(CITER激光掃描共聚焦顯微鏡GEISQ，DK-S28電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，MLR-350HT生化培養箱(SANYO)。二、實驗方法以北美大豆猝死綜合癥病菌ARG1. 1作為材料，對碘化丙啶的染料濃度和染色時間進行篩選。新鮮配制孢子懸浮液，共分成三組；一組為不經處理的用于萌發實驗的活孢子作為萌發試驗對照；一組為不經處理的用于染色實驗的活孢子(UK組)；一組為經50°C水浴處理:3min的死孢子(K組)。設計4種不同染料濃度的濃度梯度實驗原液0. 5mmol/L、 10倍稀釋液0. 05mmol/L、40倍稀釋液0. 0125mmol/L、100倍稀釋液0. 005mmol/L，4個不同的染色時間的時間梯度實驗染色15min、20min、25min、30min。染色方法為取1 μ L染料分別與200 μ L孢子懸浮液混勻，在室溫下避光染色，13000rpm離心Imin去上清液，滅菌去離子水洗滌一次，重懸，制片，然后采用激光掃描共聚焦顯微鏡掃描，觀察分析結果。其中染色后的UK組樣品分兩部分，一部分進行LSCM掃描分析，一部分用于萌發實驗，與未經處理的孢子萌發試驗作對比，用以檢測染色對孢子活性的影響，從而篩選出對孢子活性影響最小且染色效果最佳的染料濃度和染色時間。三、實驗結果1、萌發實驗結果表1不同的染料濃度-染色時間處理后的萌發率(％ )
染料濃度
染色時間
原液
15 20 25 30
27.82 20.91 14.99 10.15
10倍稀40倍稀100倍稀釋液釋液釋液87.18100.00100.0074.00100.00100.0071.67100.00100.0068.33100.00100.00
空白對照
100.00表1顯示染料濃度和染色時間篩選的萌發實驗對照。其中，空白對照中不經染色處理的孢子萌發率為100%。經碘化丙啶原液或10倍稀釋液染色，染料濃度越高，孢子萌發率越低；同一濃度下，染色時間越長，孢子萌發率越低。經碘化丙啶40倍稀釋液(對應染料終濃度0. 0000625mmol/L)和100倍稀釋液(0. 000025mmol/L)染色后萌發率均為100%。2、最佳染色條件結合染色對孢子活性的影響，以及染色后激光掃描共聚焦顯微鏡掃描對死活孢子的區分效果，篩選出不影響孢子活性且染色效果最佳的染色條件為碘化丙啶染料40倍稀釋液，對應染料終濃度0. 0000625mmol/L，染色時間為15min。染色效果參見圖2。實驗例2 北美大豆猝死綜合癥病菌活性檢測定量分析一、材料與儀器來自于美國、阿根廷等國的北美大豆猝死綜合癥病菌菌株8株，碘化丙啶， LSM5E)(CITER激光掃描共聚焦顯微鏡(ZEIS S),DK-S28電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)，MLR-350HT生化培養箱(SANYO)。二、實驗方法以北美大豆猝死綜合癥病菌8個菌株作為實驗材料。新鮮配制的孢子懸浮液，分別在5種水浴溫度42°C、44°C、46°C、48°C、50°C下均進行5種時間處理即lmin、 anin、3min、^iin、5min，將所有樣品分為兩組，一組用碘化丙啶40倍稀釋液(染色終濃度 0. 0000625mmol/L)染色15min后，制片，LSCM掃描，分析病菌孢子活性，測量單個孢子的熒光強度值，對每個樣品隨機測量30個孢子，計算平均值；另一組進行萌發試驗，運用SPSS軟件，對各處理條件與熒光強度值、孢子萌發率以及熒光強度值與孢子萌發率的關系進行統計分析。三、實驗結果
權利要求
1.一種北美大豆猝死綜合癥病菌活性檢測方法，其特征在于采用碘化丙啶作為染料對北美大豆猝死綜合癥病菌孢子進行染色。
2.如權利要求1所述方法，其特征在于孢子染色后采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察， 活孢子內部沒有熒光，死孢子內部顯示紅色熒光。
3.如權利要求2所述方法，其特征在于激光掃描共聚焦顯微鏡參數包括如下設置 熒光信號激發波長為480-500nm，熒光信號發射波長為555-565nm。
4.如權利要求1-3所述方法，其特征在于碘化丙啶的染色濃度為0.000025mmOl/ L-0. 0025mmol/Lo
5.如權利要求4所述方法，其特征在于碘化丙啶的染色濃度為0.000025mmOl/ L-0. 0000625mmol/L。
6.如權利要求1-3所述方法，其特征在于碘化丙啶的染色時間為15min-30min，且染色過程于室溫避光條件下進行。
7.如權利要求6所述方法，其特征在于碘化丙啶的染色時間為15min。
全文摘要
本發明公開了一種北美大豆猝死綜合癥病菌活性檢測方法，該方法采用碘化丙啶染色，利用激光掃描共聚焦顯微鏡檢測，能夠快速、準確、靈敏的區分北美大豆猝死綜合癥病菌孢子的死活，可以替代傳統的孢子萌發方法，適合于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。
文檔編號G01N21/64GK102346107SQ201010241418
公開日2012年2月8日 申請日期2010年7月30日 優先權日2010年7月30日
發明者代京莎, 向才玉, 王穎, 程穎慧, 章桂明 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心