大豆疫霉的檢測試劑盒及其檢測方法

專利名稱：大豆疫霉的檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種大豆疫霉的檢測試劑盒及其檢測方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
大豆疫霉根腐病是由大豆疫霉菌(Phytophothora sojae)引起的，是分布廣泛、危 害極嚴重的土傳性病害。是我國對外公布的Al類進境植物檢疫對象。該病1948年首次發 現于美國的印第安那州，1955年公開報道后，在世界大豆主產國巴西、阿根廷、加拿大等15 個國家先后發現該病。僅在1989至1991年的3年中，大豆疫病在美國中北部的12個州即 造成279萬噸的產量損失，經濟價值高達5. 6億美元。1989年北京農業大學沈崇堯等首次在我國東北地區發現了大豆疫霉病菌，目前已 在北京、山東、吉林、內蒙古等地發現了疫霉根腐病。黑龍江省植保站1997、1998兩年對黑 龍江省大豆疫病發生情況進行普查，結果表明僅黑龍江省發病面積已超過30萬公頃，占全 省大豆播種面積的15%。該病已由初發生階段向盛發生階段轉化，是一個急需解決的問題。近年來，我國從美國等有大豆疫霉分布的國家進口商品大豆日趨增多，每年從境 外進口大豆的數量幾乎超過了國產大豆的總量，其中經常夾帶一定量的土壤。由于大豆疫 霉是典型的土傳真菌病害，卵孢子能在土壤中長期生存，因此進境大豆夾帶的土壤中極有 可能攜帶大豆疫霉病菌。國內外大豆的頻繁貿易增加了大豆疫病傳播擴散的風險，這種嚴 峻的形勢要求應盡快建立一套快速靈敏的檢測方法。雖然有直接從土壤分離和檢測大豆疫霉的報道，但實際上，由于種植大豆的土壤 中也往往含有大量的腐霉等腐生真菌，能選擇性地抑制多種腐霉菌的惡疫靈(hymexazo) 也強烈抑制大豆疫霉，因而從土壤中直接分離和檢測大豆疫霉極為困難，成功率較小；種子 也可能是大豆疫霉傳播的途徑之一，但從干燥甚至稍微陰干的帶病大豆種子中分離不到病 原，或需經2個月的濕冷處理才能使病種子中的卵孢子萌發，不適合檢疫檢驗；酶聯免疫熒 光(ELISA)雖已廣泛地應用于疫霉病害的檢測和診斷，但所用抗體缺乏種的特異性，甚至 能和某些腐霉和霜霉菌發生交叉反應，檢測到的病原也有可能是死的，也不適合檢疫檢驗； 采用土壤浸泡后用大豆幼苗、子葉或葉碟(Ieafdisc)誘集(baiting)的方法可有效地檢測 到土壤中活的大豆疫霉，也是目前海關檢疫部門的主要檢測手段，但這種生物學檢測方法 約需15-20天，而且靈敏度低，每克土壤需含有50個以上的卵孢子，因此難以適合外檢和內 檢的需求。PCR技術具有快速和靈敏的優點，在病原物的鑒定和檢測中的地位越來越重 要。近年來，一些疫霉菌的PCR檢測方法被開發出來。這些方法中設計的引物的來源主 要都是轉錄間隔區(ITS) (Cooke et al. , 1995a, b ；Bonants et al. , 1997 ；Tooley et al. , 1997 ；Trout etal. , 1997 ；Liew et al. ,1998 ；Tooley et al. ,1998 ；Schubert et al.，1999 ；Bonants et al.，2000 ；Judelson&Tooley，2000 ；Winton&Hansen，2001 ；Grote et al.,2002 ；Ippolito et al. ,2002)或者 elicitin 基因(Coelho et al.，1997 ； Lacourt&Duncan, 1997 ；Kong et al.，2003b)。這些區域或者基因在基因組中都是高拷貝的，所以很容易被檢測到。但是越來越多的研究發現，部分疫霉種的ITS序列差異很小，以 此為靶標設計的引物難以將不同種區分開來。Wang等(2006)根據ITS序列設計大豆疫霉 特異性引物時發現，大豆疫霉與P. melonis的ITS序列的相似性高達97%，大豆疫霉的特異 性引物3’末端僅僅與P. melonis的相應序列相差1個堿基，需要將退火溫度提高到66°C以 上才能將這兩種疫霉區分開來，但是過高的退火溫度會降低PCR反應的靈敏度。而且提高 退火溫度并不能徹底解決此問題，當P. melonis的濃度較高時仍然會造成假陽性的現象。 此外，由于ITS的拷貝數非常高，導致應用該靶標位點進行病原菌的定量檢測不夠準確。因 此篩選新的分子靶標，是改進大豆疫霉檢測技術的重要途徑。除了 ITS序列和elicitin基因之外，有研究者將線粒體基因Coxl、Cox2(Martin et al.，2004)和可能編碼儲存蛋白的Lpv基因(Kong et al.，2003a)分別作為P. ramorum 和P. cinnamomi檢測的靶標。大豆疫霉和P. melonis的線粒體基因的相似性也比較高，要 設計區分二者的引物比較困難。而Lpv基因在除了隱地疫霉之外的其他疫霉中的研究比 較少，不像ITS序列那樣幾乎所有的疫霉種都可以從GenBank中獲取其序列。Schena和 Cooke (2006)的研究為疫霉菌的檢測開啟了一扇新的大門。Schena等(2006)成功地利用 Yptl 基因作為革巴標對 P. ramorum、P. kernoviae、P. citricola 禾口 P. quercina 這四種疫霉進 行檢測。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是解決現有技術中大豆疫霉的生物學檢測方法所需 周期長(15-20天)、特異性差(50-100卵孢子/克土)的問題，為此，本發明提供了大豆疫 霉的檢測引物、試劑盒及方法，對大豆疫霉進行PCR檢測，實用性強，準確性和靈敏性高。本發明提供的技術方案是一種用于檢測大豆疫霉的引物，其為大豆疫霉的特異 性引物，即PsYpt3F/PsYpt2R 其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物核苷 酸序列如SEQ ID No. 2所述。一種檢測大豆疫霉的試劑盒，其特征在于包含上述的PsYpt3F/PsYpt2R引物。上述的試劑盒，還包含4種dNTP，Tris. Cl溶液、KCl溶液、MgCl2溶液、dNTPs、BSA、 Taq DNA聚合酶。本發明還公開了一種利用上述的引物檢測大豆疫霉的方法，其檢測過程是提取 待測樣品DNA作為模板，進行PCR擴增，其中，PCR擴增程序為94°C變性5分鐘，94°C變性1 分鐘；60°C退火30秒；72°C延伸1分鐘；35個循環，最后72°C延伸10分鐘；然后檢測擴增 產物取擴增產物，在的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓為50-100V，30分鐘后在紫外光下 檢測結果，如果存在分子量約為220bp的DNA條帶，則證明所檢病原為大豆疫霉。為提高檢測的靈敏度，本發明還提供了另一種用于檢測大豆疫霉的引物，其包括 兩對引物，第一對引物即:PsYpt3F/PsYpt2R，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所 述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 2所述，第二對引物為疫霉屬通用引物，S卩YptlF/ YptlR，其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4 所述。本發明還提供另一種檢測大豆疫霉的試劑盒，其包含上述的第一對引物和和第二 對引物。
本發明還提供另一種檢測大豆疫霉的方法，其具體過程是提取待測樣品的DNA， 利用上述的兩對引物進行套式PCR反應，第一輪PCR反應的模板為提取待測樣品的DNAdI 物為所述的第二對引物，第二輪PCR反應的模板為第一輪PCR反應產物，引物為所述的第一 對引物，取第二輪PCR反應擴增產物進行凝膠電泳，如果存在分子量約為220bp的DNA條 帶，則證明所檢樣品中含有大豆疫霉。同時本發明還公開了一種用于檢測大豆疫霉的PCR反應體系，以總體積ImL計，其包括模板 DNA 若干、0. 05mmol Tris. C1、0. 125mmol KC1、0. 005mmol MgCl2, 0. OlmmoldNTPs.O. 25mmol 所述的 PsYpt3F/PsYpt2R 引物、0. ImgBSAUOO 單位 Taq DNA 聚合
酶，余量為滅菌去離子水。本發明還公開了另一種用于檢測大豆疫霉的套式PCR反應體系，其包括第一輪 PCR反應體系和第二輪PCR反應體系，其中，第一輪PCR反應體系以總體積25ul計，其包 括5 μ L DNA模板，10 μ L權利要求4所述試劑盒溶液，10 μ L滅菌去離子水，引物為所述的 疫霉屬通用引物ptlF/YptlR ；第二輪PCR反應體系以總體積25ul計，其包括5 μ L DNA 模板，10 μ L上述的試劑盒溶液，10 μ L滅菌去離子水，引物為所述的特異性引物PsYpt3F/ PsYpt2R，其中，第二輪PCR反應體系中的模板DNA為所述第一輪PCR反應產物。本發明分析了大豆疫霉和其他疫霉菌在Yptl基因序列上的差異，設計了新的特 異性引物，在此基礎上建立了檢測大豆疫霉的PCR體系，本發明具有如下優點(1)實用性好用卵孢子富集的方法檢測含卵孢子土壤具重要的實際應用價值。 大豆疫霉隨貿易往來最可能的傳播途徑是隨大豆中的塵土傳播，在貿易口岸中，檢疫部門 也正是通過檢測口岸大豆塵土中是否存在卵孢子作為重要指標。但事實上，在貿易口岸中 截獲的“土壤”中，不可能含很多的卵孢子，因此海關目前所用的大豆葉碟法很難有效地進 行檢測。此外目前的方法由于需要將病原菌卵孢子萌發、誘捕、分離鑒定等過程，需要約 15-20天的時間，根本無法滿足海關檢疫的需要。為了使我們的檢測方法更具有實際應用價 值，我們在檢測方法上作了如下改進，隨機取30-50g帶菌土樣。把土壤碾碎以后，先用200 目篩網除去較大的顆粒，再過400目篩網，最后用500、800目篩網加水沖洗，由于卵孢子不 能透過800目篩網，這樣通過700目篩網達到了使卵孢子富集的效果，富集以后的土壤經過 核酸抽取后直接進行PCR擴增，可在1天之內達到對大豆疫霉的檢測。因此本方法大大提 高了檢測效率。(2)準確性高由于傳統大豆疫霉檢測技術只是根據形態特征來確定檢疫對象， 無法排除人為因素的干擾，很難區分形態相近種，檢測準確性只有60-80% ；而本發明根據 大豆疫霉的Yptl基因序列，同時包含保守與變異序列，利用Bioedit軟件對這些DNA序列 進行比較，選定的大豆疫霉特有的一段保守序列做特異引物。能根據變異序列設計特異性 引物進行擴增比較，為病原菌的鑒定和檢測提供了很好的靶位點。經過與大豆疫霉近似種 以及其他不同植物病原菌的比較，該引物的準確率為100%。(3)靈敏度高傳統大豆疫霉檢測技術首先要進行卵孢子的萌發，釋放游動孢子 后再進行誘捕，由于大豆疫霉菌卵孢子萌發率只有10-30%，因此只有土壤中卵孢子量超過 每克土 50-100個時才有可能檢出。本發明提供的大豆疫霉的特異引物檢測方法及其高效 準確的檢測試劑盒，由于可以有效的富集卵孢子，而且PCR擴增的高靈敏度，使得本研究的 方法可以有效地從每克含有1個卵孢子的土壤中檢測出卵孢子。


圖1為特異引物PsYpt3F/PsYpt2R擴增大豆疫霉的電泳圖，其中，泳道3-24為22個P. sojae菌株擴增結果，泳道2為陰性對照。圖2為大豆感病組織的檢測結果，其中，泳道1為2000bp DNA marker ；泳道2為 陽性對照；泳道3為陰性對照；泳道4-5為接種大豆中大豆疫霉的擴增結果；泳道6為提取 健康大豆組織DNA的擴增結果；泳道7為提取健康大豆植株DNA，用引物ITS1/ITS4擴增的 結果(空白對照)。圖3a為引物PsYpt3F/PsYpt2R擴增不同濃度游動孢子的靈敏度結果，其中，泳道1 為2000bp DNA marker ；泳道2為陰性對照；泳道3_6為25 μ 1的反應體系中分別含有1000 個、100個、10個、1個游動孢子DNA的擴增結果。圖3b為以引物YphlF/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R組合進行套式PCR反應的靈敏 度結果，其中，泳道1為2000bp DNA marker ；泳道2為陰性對照；泳道3_6為25 μ 1的反應 體系中分別含有1000個、100個、10個、1個游動孢子DNA的擴增結果。圖4a為引物PsYpt3F/PsYpt2R擴增不同濃度卵孢子的靈敏度結果，其中，泳道1 為2000bp DNA marker ；泳道2為陰性對照；泳道3_5為25 μ 1的反應體系中分別含有100 個、10個、1個卵孢子DNA的擴增結果。圖4b不以引物YphlF/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R組合進行套式PCR反應的靈敏 度結果，其中，泳道1為2000bp DNA marker ；泳道2為陰性對照；泳道3_5為25 μ 1的反應 體系中分別含有100個、10個、1個卵孢子DNA的擴增結果。
具體實施例方式下面通過具體實施方式
的詳細描述來進一步闡明本發明，但并不是對本發明的限 制，僅僅作示例說明。實施例1 設計、合成引物并建立大豆疫霉檢測試劑盒的PCR反應體系一、引物設計與合成設計大豆疫霉的特異性引物PsYpt3F/PsYpt2R PsYpt3F(20bp) :5，-TACCAATAATCAGAAGCGTA-3，(SEQ ID NO. 1)；PsYpt2R(18bp) :5，-CCTTGTCTGCCCTCTCGA-3，(SEQ ID NO. 2)。同時，還設計了疫霉屬的Yptl通用引物YphlF/YphlR(具體見核苷酸序列表SEQ IDN0. 3和SEQ ID NO. 4)作為套式PCR的一輪反應引物YphlF(20bp) :5，-CGACCATTGGCGTGGACTTT-3，(SEQ ID NO. 3)；YphlR(20bp) :5，-ACGTTCTCGCAGGCGTATCT-3，(SEQ ID NO. 4)。所有引物委托Invitrogen公司合成。二、建立PCR反應體系1、建立常規PCR反應體系ImL 常規 PCR 反應體系中包括模板若干、0. 05mmol Tris. C1、0. 125mmol KCl, 0. 005mmol MgCl2、0. OlmmoldNTPs、大豆疫霉的特異引物 PsYpt3F/PsYpt2R 0. 25mmol、 0. ImgBSAUOO單位Taq DNA聚合酶，余量為超純水。
2、建立套式PCR反應體系為了提高檢測靈敏度，進一步建立了套式PCR反應體系。以疫霉菌Yptl基因通用引物YphlF/YphlR作為第一輪反應引物與特異引物PsYpt3F/PsYpt2R分別組合進行套式 PCR。ImL第一輪PCR反應的混合液，包括模板若干、0.05mmol Tris. C1、0. 125mmol KCl、0. 005mmol MgCl2、0. OlmmoldNTPs、疫霉屬的通用引物 YphlF/YphlR 0. 25mmol、 0. ImgBSAUOO 單位 Taq DNA 聚合酶。ImL第二輪PCR反應的混合液，包括模板若干、0.05mmol Tris. C1、0. 125mmol KC1、0. 005mmol MgCl 2、0. OlmmoldNTPs、大豆疫霉的特異引物 PsYpt3F/PsYpt2R 0. 25mmol、0. lmgBSA、100單位Taq DNA聚合酶，其中，第二輪PCR反應的模板為第一輪反應 的擴增產物。實施例2 檢測土壤樣品中大豆疫霉從海關進境大豆帶菌土樣中檢測大豆疫霉，檢測過程如下1、富集土壤中卵孢子取待檢土壤樣品20-100克，研碎，先采用200目篩網去除較大土粒，然后經過400、 500,800目篩網過濾，同時用3-10升水反復沖洗，從800目篩網上收集卵孢子，用Iml無菌 水懸浮。由于卵孢子不能透過800目篩網，這樣處理可以達到使卵孢子富集的效果。2、從微量卵孢子中提取DNA 將用無菌水懸浮的卵孢子轉移到1. 5mL的離心管中，在12000r. mirT1轉速下離心 5分鐘，倒出液體；加入50 μ L CTAB buffer，研磨，再加入 500 μ L CTAB buffer，水浴 30 分鐘；加入等體積氯仿抽提，在12000r. mirT1轉速下離心10分鐘，吸取上清；加入1/10體積的3M NaAc, 2倍體積的無水冰乙醇，室溫沉淀30分鐘，12000r. mirT1 轉速下離心10分鐘，倒干液體；加ImL 70% (V/V)乙醇洗滌，12000r. mirT1轉速下離心10分鐘，倒干液體，晾干至 無酒精味；加10 μ L無菌雙蒸水溶解，用于以下的PCR擴增。3、大豆疫霉的PCR檢測(1)采用實施例1中的常規PCR反應體系檢測取1 μ L DNA溶液，加入9 μ L常規PCR反應體系溶液和15 μ L滅菌去離子水，總體 積為25 μ L0 PCR擴增程序為94°C變性5分鐘，94°C變性1分鐘；60°C退火30秒；72°C延伸 1分鐘；35個循環，最后72°C延伸10分鐘。擴增產物的電泳檢測取10μ L PCR擴增產物，在的瓊脂糖凝膠上進行電泳， 電壓為50-100V，30分鐘后在紫外光下檢測結果。如果存在分子量約為220bp的DNA條帶， 則證明所檢病原為大豆疫霉。檢測結果見圖4a，圖4a中，3_5泳道為25 μ 1的反應體系中 分別含有100個、10個、1個卵孢子DNA的擴增結果。(2)采用實施例1中的套式PCR反應體系檢測第一輪PCR反應取1 μ L DNA溶液，加入9 μ L第一輪PCR反應混和溶液和15 μ L 滅菌去離子水，總體積為25 μ L0 PCR擴增程序為94°C變性5分鐘，94°C變性1分鐘；60°C退火30秒；72°C延伸1分鐘；35個循環，最后72°C延伸10分鐘。第二輪PCR反應取1 μ L第一輪PCR反應的擴增產物，加入9 μ L第二輪PCR反應 混和溶液和15 μ L滅菌去離子水，總體積為25 μ L0 PCR擴增程序為94°C變性5分鐘，94°C 變性1分鐘；60°C退火30秒；72°C延伸1分鐘；35個循環，最后72°C延伸10分鐘。擴增產物的電泳檢測取10 μ L第二輪PCR擴增產物，在1 %的瓊脂糖凝膠上進行電泳，電壓為50-100V，30分鐘后在紫外光下檢測結果。如果存在分子量約為220bp的DNA 條帶，則證明所檢病原為大豆疫霉。檢測結果見圖4b，圖4b中，3-5泳道為25 μ 1的反應體 系中分別含有100個、10個、1個卵孢子DNA的擴增結果。實例3 從污染水中檢測大豆疫霉的游動孢子取大豆疫霉污染的灌溉水500mL，在6000g的離心力下離心20min，倒去上清液，沉 淀的游動孢子用IOOuL水懸浮，轉入1. 5mL離心管，加入0. 05g石英砂，渦旋震蕩lOsec，取 IuL游動孢子破碎液為模板，按照實施例2的方法進行基因擴增，可以擴增出大豆疫霉特有 的片斷，結果見圖3a和圖3b。其中，圖3a為引物PsYpt3F/PsYpt2R擴增不同濃度游動孢 子的靈敏度；圖3b為引物YphlF/Yph2R和PsYpt3F/PsYpt2R組合進行套式PCR反應擴增不 同濃度游動孢子的靈敏度；泳道1為2000bp DNA marker ；泳道2為陰性對照；泳道3_6為 25 μ 1的反應體系中分別含有1000個、100個、10個、1個游動孢子DNA的擴增結果。實例4 從發病大豆組織中鑒定大豆疫霉將有水浸狀病斑的大豆葉片或根莖部位用70%酒精消毒后，采用CTAB法或者堿 裂解法提取DNA，吸取IuLDNA溶液，按實施例2常規PCR擴增方法，進行PCR擴增，電泳檢測 擴增產物，如果為大豆疫霉侵染引起的疫病，則可見一條清晰的分子量為220bp的特異性 條帶，結果見圖2，其中，泳道2、4、5為大豆疫霉侵染樣品。實例5 從發病大豆組織中鑒定大豆疫霉用特異引物PsYpt3F/PsYpt2R對26個疫霉種、30個其它種的菌株共計164株進行 了常規PCR擴增，特異性引物PsYpt3F/PsYpt2R只能從供試的22個P. sojae菌株中特異地 擴增出一條220bp的條帶，結果見圖1，其中，泳道3-24為22個P. sojae菌株樣品，泳道2 為陰性對照。表明該引物具有種的特異性，可以將P. sojae和其它近似種及其它相關種區 分開。
權利要求
一種用于檢測大豆疫霉的引物，其特征在于其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述。
2. 一種檢測大豆疫霉的試劑盒，其特征在于包含權利要求1所述的引物。
3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于還包含4種dNTP，Tris.Cl溶液、KCl溶 液、MgCl2溶液、BSA、Taq DNA聚合酶。
4. 一種利用權利要求1所述的引物檢測大豆疫霉的方法，其特征在于提取待測樣品 DNA作為模板，進行PCR擴增；PCR擴增程序為94°C變性5分鐘，94°C變性1分鐘；60°C退火 30秒；72°C延伸1分鐘；35個循環，最后72°C延伸10分鐘；然后取擴增產物進行檢測，如果 存在分子量約為220bp的DNA條帶，則證明所檢病原為大豆疫霉。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于對PCR反應擴增產物的檢測為凝膠電泳 檢測。
6. 一種用于檢測大豆疫霉的引物，其特征在于包括兩對引物，第一對引物其上游引 物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所述，第二對引物 其上游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 3所述，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No. 4所述。
7. —種檢測大豆疫霉的試劑盒，其特征在于包含權利要求6所述的引物。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于還包含4種dNTP，Tris.Cl溶液、KCl溶 液、MgCl2溶液、BSA、Taq DNA聚合酶。
9. 一種利用權利要求6所述的引物檢測大豆疫霉的方法，其特征在于提取待測樣品 的DNA，進行套式PCR反應，第一輪PCR反應的模板為提取待測樣品的DNA，引物為所述的第 二對引物，第二輪PCR反應的模板為第一輪PCR反應產物，引物為所述的第一對引物，取第 二輪PCR反應擴增產物進行檢測，如果存在分子量約為220bp的DNA條帶，則證明所檢樣品 中含有大豆疫霉。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于對PCR反應擴增產物的檢測為凝膠電泳 檢測。
全文摘要
本發明涉及一種大豆疫霉的檢測試劑盒及其檢測方法，解決現有技術中大豆疫霉的生物學檢測方法所需周期長(15-20天)、特異性差(50-100卵孢子/克土)的問題，屬于農作物防病治病及植物檢疫范疇。利用本發明引物、試劑盒及方法對大豆疫霉進行PCR檢測，實用性強，準確性和靈敏性高。
文檔編號C12Q1/68GK101805795SQ201010145420
公開日2010年8月18日 申請日期2010年4月13日 優先權日2010年4月13日
發明者王源超, 王穎, 董莎萌, 鄭小波 申請人:南京農業大學