專利名稱：：用于檢測大豆疫霉的引物、試劑盒及方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于檢測大豆疫霉的引物、試劑盒及方法，屬于生物
技術領域：
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背景技術：
：由大豆疫霉菌PhytophthorasojaeKaufmann&Gerdemann侵染大豆弓|起的疫霉根腐病是大豆生產上的毀滅性病害之一，也是我國對外公布的一類檢疫對象(許志剛，2003)。大豆疫霉菌可以在大豆生長的各個時期侵染大豆，在潮濕多雨的季節病害發生尤其嚴重，由于大豆疫霉以同宗配合的方式進行有性生殖，在發病植株上可以產生大量的卵孢子，植物收獲后殘留在土壤中的卵孢子就成為大豆疫霉的初侵染源，據報道大豆疫霉的卵孢子可以在土壤中存活5年以上(許修宏等，2003)。因此大豆疫霉根腐病一旦發生將很難消除(朱振東等，1999)。傳統的檢測大豆疫霉的方法是進行大豆葉碟誘捕和平板培養或者將二者相結合(CanadayandSchmitthenner,1982；Oudemans,1999；朱振東等，2003；王子迎等，2005)。傳統方法在大豆疫霉檢測中發揮了重要作用，但是費時費力而且要求操作者具備專業的疫霉分離、形態學鑒定知識和豐富的經驗(Tsao，1990;Dobrowolskiand0，Brien，1993)，所以很難在生產中推廣運用。PCR技術具有快速和靈敏的優點，在病原物的鑒定和檢測中的地位越來越重要。近年來，一些疫霉菌的PCR檢測方法被開發出來。這些方法中設計的引物的來源主要都是轉錄間隔區(ITS)(Cookeetal.，1995a，b；Bonantsetal.，1997；Tooleyetal.，1997；Troutetal.,1997；Liewetal.,1998；Tooleyetal.,1998；Schubertetal.,1999；Bonantsetal.,2000；JudelsonandTooley,2000；ffinton&Hansen,2001；Groteetal.,2002；Ippolitoetal.,2002)或者elicitin基因(Coelhoetal.,1997；LacourtandDuncan,1997；Kongetal.,2003b)0這些區域或者基因在基因組中都是高拷貝的，所以很容易被檢測到。但是越來越多的研究發現，部分疫霉種的ITS序列差異很小，以此為靶標設計的引物難以將這些疫霉菌與其近緣種區分開來。Wang等(2006)根據ITS序列設計大豆疫霉特異性引物時發現，大豆疫霉與P.melonis的ITS序列的相似性高達97%，大豆疫霉的特異性引物3’末端僅僅與P.melonis的相應序列相差1個堿基，需要將退火溫度提高到660C以上才能將這兩種疫霉區分開來，但是過高的退火溫度會降低PCR反應的靈敏度。而且提高退火溫度并不能徹底解決此問題，當P.melonis的濃度較高時仍然會造成假陽性的現象。
發明內容本發明所要解決的技術問題是提供一種用于檢測大豆疫霉的引物、包含該引物的檢測試劑盒及檢測方法，利用該引物及檢測方法檢測大豆疫霉準確性高、特異性強、靈敏性尚ο本發明提供的技術方案是一種用于檢測大豆疫霉的引物，即TrapFl/TrapRl，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述。一種檢測大豆疫霉的試劑盒，包含上述的引物。所述的試劑盒，還包含4種dNTP，10XPCR反應緩沖液，2mMMg2+，1%BSA和Taq酶。本發明還提供了一種檢測大豆疫霉的方法提取待測樣品的DNA作為模板，利用所述的引物進行PCR反應，取PCR反應擴增產物進行凝膠電泳，電壓為50-100V，30分鐘后在紫外光下檢測結果，如果存在分子量約為267bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有大豆疫霉。為提高檢測的靈敏度，本發明還提供了另一種用于檢測大豆疫霉的引物，其包括兩對引物，第一對引物即TrapFl/TrapRl，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述，第二對引物，即TrapF2/TrapR2，其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所述。本發明還提供了另一種檢測大豆疫霉的試劑盒，其包含上述的第一對引物和第二對引物。上述的試劑盒，還包含4種dNTP，10XPCR反應緩沖液，2mMMg2+，1%BSA,吐溫-20和Taq酶。本發明還提供另一種檢測大豆疫霉的方法，其具體過程是提取待測樣品的DNA，進行套式PCR反應，第一輪PCR反應的模板為提取待測樣品的DNA，引物為所述的第一對引物(TrapFl/TrapRl)，第二輪PCR反應的模板為第一輪PCR反應產物，引物為所述的第二對引物(TrapF2/TrapR2)，取第二輪PCR反應擴增產物進行凝膠電泳，電壓為50_100V，30分鐘后在紫外光下檢測結果，如果存在分子量約為267bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有大豆疫霉。同時，本發明還提供了一種利用所述引物建立的PCR反應體系。PCR反應的混合液總體積為25μ1，包括相應濃度的模板DNA，0.5μM引物，4種dNTP各50μM，2.5μ110XPCR反應緩沖液，2mMMg2+，2.5μ11%BSA,1.25單位Taq酶(TaKaRa)，在PTC200(MJ公司)PCR儀上進行擴增反應。反應程序為94°C預變性5min；然后進入循環，94°C變性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸30sec，共35個循環；最后72°C延伸7min。反應結束后取7μ1擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳30min(100V)，在凝膠成像系統上檢測并拍照，如果存在分子量為267bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有大豆疫霉。為了提高檢測靈敏度，本發明進一步建立了套式PCR反應體系。以TrapFl/TrapRl作為第一輪反應引物與引物TrapF2/TrapR2分別組合進行套式PCR。第一輪PCR反應的混合液總體積為25μ1，包括:0.5μΜ引物，4種dNTP各50μΜ，2.5μ110XPCR反應緩沖液，2mMMg2+，2.5μ11%BSA,0.5μ1吐溫-20，1.25單位Taq酶(TaKaRa)，模板DNA若干，在PTC200(MJ公司)PCR儀上進行擴增反應。反應程序為94°C預變性5min；然后進入循環，94°C變性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸30sec，共35個循環；最后72°C延伸7min。取1μ1第一輪PCR反應產物作為模板進行第二輪反應，反應體系和反應程序同1.5.2中所述。反應結束后取7μ1擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳30min(100V)，在凝膠成像系統上檢測并拍照，如果存在分子量為267bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有大豆疫霉。本發明具有如下優點在進行大豆疫霉基因組的研究過程中，本發明人發現了一段大豆疫霉的類轉座子序列，在對這一序列進行生物信息學的分析過程中發現該序列高度重復且只存在于大豆疫霉中，因此非常適合做為大豆疫霉分子檢測的靶標。特異性試驗結果證實該引物具備種的特異性。本發明人根據大豆疫霉的類轉座子序列設計了大豆疫霉的特異引物TrapFl/TrapRl，利用該對引物對26種疫霉、29種其它真菌共232個菌株進行特異性驗證。試驗結果證明，該引物只能從大豆疫霉菌株中擴增得到一條267bp的條帶。其它菌株，特別是ITS序列與大豆疫霉十分近似的疫霉菌P.melonis以及亦可侵染大豆造成根腐癥狀的Fusariumsolanif.sp.glycines,Rhizoctoniasolani,Pythiumaphanidermatum禾口Colletotrichumglycines等無擴增條帶出現。本發明人利用該引物對來自不同地區和國家的大豆疫霉100余株大豆疫霉菌株進行了PCR擴增，結果從這些來源不同的大豆疫霉菌株中都能擴增出一條267bp的條帶，表明該類轉座子序列適合作為大豆疫霉分子檢測的靶標，基于該序列設計的特異引物可對大豆疫霉引起的根腐病進行準確地診斷和檢測。引物靈敏度的驗證結果證實，僅僅經過單輪PCR，該引物即可檢測出IOpg的的大豆疫霉基因組DNA。為了提高檢測的靈敏度，本發明人又在TrapFl/TrapRl擴增的片段內設計另一對引物TrapF2/TrapR2，用作套式PCR的第二輪擴增引物。引物TrapFl/TrapRl和TrapF2/TrapR2組合進行的套式PCR反應可以使檢測靈敏度提高1000倍，能夠檢測到IOfg的大豆疫霉基因組DNA。在游動孢子和卵孢子的檢測過程中，僅僅通過單輪PCR，就可以分別檢測到1個卵孢子和1個游動孢子。。大豆疫病是大豆生產上的一種毀滅性病害，同時也是我國口岸檢疫中的重要檢疫對象，在目前尚無有效防治藥物的前提下，控制其傳播是減少危害的主要措施之一。本發明人發現了一個新的大豆疫霉分子檢測靶標，并根據此序列為靶標設計了大豆疫霉檢測特異引物，建立大豆疫霉普通PCR分子檢測體系。該體系可對大豆疫霉的各種形態的繁殖體例如菌絲、卵孢子和游動孢子等進行檢測，整套技術快速、靈敏、準確。因此，無論在防止外來大豆疫霉入侵，還是對國內疫區病原菌監測及國際貿易交往等方面均具重要意義。圖1為大豆疫霉類轉座子序列。圖2為引物TrapFl/TrapRl的PCR擴增電泳圖，其中，M為2000bpDNAmarker；1為標準大豆疫霉菌株6497；2-18為其他疫霉種菌株；19陰性對照。圖3為引物TrapFl/TrapRl的PCR擴增電泳圖其中，M為2000bpDNAmarker；1為標準大豆疫霉菌株6497；2-18為其他真菌菌株；19為陰性對照。圖4為引物TrapFl/TrapRl的PCR擴增電泳圖，其中，M為2000bpDNAmarker；1為標準大豆疫霉菌株6497；2-22為來自不同國家和地區的大豆疫霉菌株；23為陰性對照。圖5為引物TrapFl/TrapRl擴增大豆疫霉不同濃度基因組DNA的靈敏度的檢測結果，其中，M為2000bpDNAmarker；1-9為25μ1的反應體系中分別含有lng、lOOpg、10pg、lpg、100fg、10fg、lfg、100ag、10agDNA的擴增結果；10為陰性對照。圖6為引物TrapFl/TrapRl和引物TrapF2/TrapR2組合套式PCR擴增大豆疫霉不同濃度基因組DNA的靈敏度的檢測結果，其中，M為2000bpDNAmarker；1-8為25μ1的反應體系中分別含有lng、100pg、10pg、lpg、100fg、10fg、lfg、100agDNA的擴增結果；9為陰性對照。圖7為引物TrapFl/TrapRl擴增大豆疫霉不同濃度卵孢子的靈敏度檢測結果，其中，M為2000bpDNAmarker；1為陽性對照；211為25μ1的反應體系中分別含有10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、1個卵孢子DNA的擴增結果；12為陰性對照。圖8為引物TrapFl/TrapRl擴增大豆疫霉不同濃度游動孢子的靈敏度，其中，M為2000bpDNAmarker；1為陽性對照；2-11為25μ1的反應體系中分別含有10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個、3個、2個、1個游動孢子DNA的擴增結果；12為陰性對照。圖9為接種大豆植株中大豆疫霉的PCR檢測結果，其中，M為2000bpDNAmarker；1為陰性對照；2-11為接種大豆中大豆疫霉的擴增結果；12為提取健康大豆組織DNA的擴增結果；13為陽性對照。圖10為大豆病田土壤中病原物的套式PCR檢測結果，其中，M為2000bpDNAmarker；1-5為感病大豆田塊中土樣；6為陽性對照；7為健康田塊土樣；8為陰性對照。具體實施例方式下面通過具體實施方式的詳細描述來進一步闡明本發明，但并不是對本發明的限制，僅僅作示例說明。實施例1設計、合成引物并建立大豆疫霉檢測試劑盒的PCR反應體系一、引物設計與合成根據大豆疫霉類轉座子序列(見圖1)設計一對用于大豆疫霉分子檢測的特異引物TrapFl/TrapRl(具體見核苷酸序列表SEQIDNO.1和SEQIDNO.2)，為了提高檢測的靈敏度，本發明基于該序列設計另一對引物TrapF2/TrapR2(具體見核苷酸序列表SEQIDN0.3和SEQIDNO.4)，作為套式PCR的第二輪擴增引物。所有引物均委托上海生工公司合成。二、建立常規PCR反應體系PCR反應的混合液總體積為25μ1，包括相應濃度的模板DNA，0.5μMTrapF1/TrapRl引物，4種dNTP各50μΜ，2.5μ110XPCR反應緩沖液，2mMMg2+,2.5μ11%BSA,1.25單位Taq酶(TaKaRa)，在PTC200(MJ公司)PCR儀上進行擴增反應。反應程序為94°C預變性5min；然后進入循環，94°C變性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸30sec，共35個循環；最后72°C延伸7min。反應結束后取7μ1擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳30min(100V)，在凝膠成像系統上檢測并拍照，如果存在分子量約為267bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有大豆疫霉。三、建立套式PCR反應體系為了提高檢測靈敏度，進一步建立了套式PCR反應體系。以TrapFl/TrapRl作為第一輪反應引物與引物TrapF2/TrapR2分別組合進行套式PCR。第一輪PCR反應的混合液總體積為25μ1，包括0.5μΜ引物，4種dNTP各50μΜ，2.5μ110XPCR反應緩沖液，2mMMg2+，2.5μ11%BSA,0.5μ1吐溫-20，1.25單位Taq酶(TaKaRa)，模板DNA若干，在PTC200(MJ公司)PCR儀上進行擴增反應。反應程序為94°C預變性5min；然后進入循環，94°C變性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸30sec，共35個循環；最后72°C延伸7min。取1μ1第一輪PCR反應產物作為模板進行第二輪反應，反應體系和反應程序同所述的常規反應體系及程序。反應結束后取7μ1擴增產物于1.0%瓊脂糖凝膠中電泳30min(100V)，在凝膠成像系統上檢測并拍照，如果存在分子量約為267bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有大豆疫霉。實施例2制備DNA模板提取各類樣品的DNA作為PCR反應的模板，具體過程如下一、菌絲粉DNA的抽提參考Sambrook等(1989)方法稍加改進。取少量菌絲粉，加900μ12%CTAB提取液和90μ110%SDS，漩渦混勻，于55°C水浴lh，中間每IOmin上下顛倒幾次。12000rpm離心lOmin，取上清加等體積酚/氯仿/異戊醇(25241)，顛倒混勻，12000rpm離心IOmin；將上清轉移至新管，加等體積氯仿，輕輕顛倒混勻，12000rpm離心5min。上清轉移至新管中，加2倍體積的無水乙醇和1/10體積的3MNaAc(pH5.2)，-20°C沉淀(>Ih)。12000rpm離心lOmin，傾去上清，沉淀用70%乙醇洗滌兩次，室溫晾干。加適量滅菌超純水或TE(pH8.0)溶解沉淀(含20μg/mlRNase)，37°C處理Ih后，_20°C保存備用。二、卵孢子懸浮液的制備和DNA的提取參見鄭小波(1997)略有改動。將含有卵孢子的培養基轉移到滅菌容器中，加水IOOml左右(視容器大小而定)，5000轉/分勻漿2分鐘，以破碎培養基并使卵孢子與菌絲和瓊脂脫離。勻漿液依次經200、300、600目篩網過濾，用水反復沖洗各目篩網，最后用少量滅菌水洗下600目篩網上收集到的卵孢子，制備成卵孢子懸浮液。在顯微鏡下對懸浮液中卵孢子的數目進行計數，將卵孢子的濃度調整為100個/μ1，用FastDNA試劑盒(Q-BiogeneLtd,USA)提取DNA，提取步驟參見試劑盒說明書。三、游動孢子懸浮液的制備和DNA的提取參考鄭小波(1997)方法誘導大豆疫霉釋放游動孢子，濾去菌絲塊，得到游動孢子懸浮液。在顯微鏡下對懸浮液中卵孢子的數目進行計數，將游動孢子的濃度調整為1000/μ1。將游動孢子懸浮液加入到1.5ml的印pendorf(EP)管中，12000g離心lOmin，棄上清液，取沉淀物，按方法1.4.1提取DNA。將提取的DNA用滅菌超純水溶解，_20°C保存備用。四、活體組織中病原菌DNA的提取參考Wang等(1993)NaOH法并稍加改進。取一段發病的植株組織，每毫克組織加Λ10μ10.5ΜNaOH，在研缽中充分研磨后轉移至1.5ml的EP管中，12000rpm離心5min，取5μ1上清液加入495μ10.ImMTris(pH8.0)，混勻后取1μ1直接用于PCR反應。每個反應至少重復三次，同時為確定植株中無PCR抑制物存在，用本方法提取健株組織DNA后經通用引物ITS1/ITS4擴增ITS片段作為空白對照。五、土壤中病原菌DNA的提取所有的土壤樣品采用FastDNASPIN試劑盒(Q-BiogeneLtd,USA)進行DNA的提取。土壤DNA提取步驟參見試劑盒說明書。用作對照的土樣采自沒有發病的健康田塊。下面用上述實施例1檢測引物、試劑盒及方法和實施例2制備的模板進行大豆疫霉的檢測。實施例3檢測引物的特異性分別用真核生物通用引物ITS1/ITS4和特異引物TrapFl/TrapRl對26個疫霉種、29個其它種的菌株共計232株進行了PCR擴增，試驗所用大豆疫霉菌株寄主、來源及數量見表1，試驗中所有菌株均為單孢菌株，保存于南京農業大學植物病理系。結果表明真核生物通用引物ITS1/ITS4能夠從所有供試菌株中擴增出一條大約700bp的條帶(見表1)。證明本研究所提的DNA可用于PCR擴增，排除了DNA質量對擴增結果造成的影響。特異性引物TrapFl/TrapRl只能從供試的120個P.sojae菌株中特異地擴增出一267bp的條帶(請見表1，圖2-4)。表明根據大豆疫霉轉座子序列(見圖1)設計的引物具有種的特異性，可以將P.sojae和其它疫霉種和真菌區分開。表1用于檢測引物TrapFl/TrapRl特異性的真菌和卵菌菌株<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>上表中+表示具有引物ITS1/ITS4或TrapFl/TrapRl的特異性擴增條帶；-表示無擴增產物。實施例4檢測引物的靈敏度1、大豆疫霉基因組DNA的靈敏度檢測將大豆疫霉菌株6497的基因組DNA從Ing/μ1開始10倍向下稀釋至IOag/μ1，每濃度梯度取1μ1為模板用特異引物TrapFl/TrapRl進行PCR擴增。結果表明在25μ1的反應體系中含有IOpg的基因組DNA時該對引物仍然可以擴增得到267bp的特異性條帶(請見圖5)。先以引物TrapFl/TrapRl對上述不同濃度的基因組DNA進行PCR擴增的產物為模板，再以大豆疫霉特異引物TrapF2/TrapR2進行套式PCR擴增。結果表明，套式PCR產物量與單獨進行特異性引物擴增的PCR產物量相比有明顯提高，能夠使原來條帶亮度非常微弱或者不可見擴增條帶的樣品產生明顯的條帶(請見圖_6)，表明以引物TrapFl/TrapRl和所設計的TrapF2/TrapR2引物組合進行的套式PCR反應可以使檢測靈敏度提高1000倍，能夠檢測到IOfg的基因組DNA。2、大豆疫霉卵孢子DNA的靈敏度檢測將濃度為100個卵孢子/μ1按10倍的梯度稀釋到1個卵孢子/μ1，分別以1μ1各個濃度的DNA為模板進行引物TrapFl/TrapRl的PCR擴增。結果顯示，在25μ1反應體系中含有1個卵孢子的DNA量時可檢測到特異性的擴增條帶(請見圖7)。3、大豆疫霉游動孢子DNA的靈敏度檢測將濃度為1000個游動孢子/μ1按10倍的梯度稀釋到1個游動孢子/μ1，分別以1μ1各個濃度的DNA為模板進行單輪PCR擴增。結果顯示，在25μ1反應體系中含有1個游動孢子的DNA量時可檢測到特異性的擴增條帶(請見圖8)。實施例5感病大豆植株的PCR檢測以NaOH裂解法提取接種大豆疫霉的大豆植株的DNA，將其作為模板用于PCR擴增。結果是接種大豆疫霉的大豆植株接種點附近組織均能擴增出267bp條帶，而健康植株只能以真核生物ITS區通用引物ITS1/ITS4擴增出一700bp的條帶，而用TrapFl/TrapRl擴增無條帶出現(請見圖9)。表明NaOH法及特異引物TrapFl/TrapRl可用于感病大豆植株的快速PCR檢測。實施例6土壤中病原物的檢測采用套式PCR檢測采自不同地區田間的病土中的病原物，所有采自大豆病田的土樣均擴增到了與陽性對照相同大小的條帶，而作為陰性對照的土樣則沒有擴增出任何條帶(請見圖10)，說明采自這些病田的土樣含有P.sojae。采用大豆葉片誘捕法的結果也證實了本發明人的PCR擴增結果。所有PCR擴增呈陽性的土樣采用葉碟誘捕法均誘出了大豆疫霉，而作為陰性對照的土樣則沒有誘出，證明本發明設計的特異引物可以用來檢測土壤中是否攜帶大豆疫霉。權利要求一種用于檢測大豆疫霉的引物，其特征在于其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述。2.一種檢測大豆疫霉的試劑盒，其特征在于包含權利要求1所述的引物。3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于還包含4種dNTP，10XPCR反應緩沖液，2mMMg2+,1%BSA禾口Taq酶。4.一種利用權利要求1所述的引物檢測大豆疫霉的方法，其特征在于提取待測樣品的DNA作為模板，利用所述的引物進行PCR反應，取PCR反應擴增產物進行檢測，如果存在分子量約為267bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有大豆疫霉。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于對PCR反應擴增產物的檢測為凝膠電泳檢測。6.一種用于檢測大豆疫霉的引物，其特征在于包括兩對引物，第一對引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所述，第二對引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.3所述，下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所述。7.—種檢測大豆疫霉的試劑盒，其特征在于包含權利要求6所述的引物。8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于還包含4種dNT，10XPCR反應緩沖液，2mMMg2+，1%BSA,吐溫-20和Taq酶。9.一種利用權利要求6所述的引物檢測大豆疫霉的方法，其特征在于提取待測樣品的DNA進行套式PCR反應，第一輪PCR反應的模板為提取待測樣品的DNA，引物為所述的第一對引物，第二輪PCR反應的模板為第一輪PCR反應產物，引物為所述的第二對引物，取第二輪PCR反應擴增產物進行檢測，如果存在分子量約為267bp的DNA條帶，則證明所檢樣品中含有大豆疫霉。10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于對PCR反應擴增產物的檢測為凝膠電泳檢測。全文摘要本發明提供一種用于檢測大豆疫霉的引物、試劑盒及方法，利用該引物及檢測方法檢測大豆疫霉準確性高、特異性強、靈敏性高，可對大豆疫霉的各種形態的繁殖體例如菌絲、卵孢子和游動孢子等進行檢測，整套技術快速、靈敏、準確，對防止外來大豆疫霉入侵、國內疫區病原菌監測及國際貿易交往等方面均具重要意義。文檔編號C12N15/11GK101805796SQ201010145429公開日2010年8月18日申請日期2010年4月13日優先權日2010年4月13日發明者孟軍,王源超,董莎萌,鄭小波申請人:南京農業大學