專利名稱：一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的效力檢驗方法
技術領域：
本發明涉及一種獸用滅活疫苗的效力檢驗方法，尤其涉及一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力的檢驗方法，屬獸用生物制品檢驗技術領域。
背景技術：
鴨出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DH0)是新近流行的、急性、高度接觸性的一種新型鴨傳染病，其病原為鴨出血性卵巢炎病毒 (Duck Hemorrhagic OvaritisVirus, DH0V),在病毒分類上屬于黃病毒科的成員，感染不同日齡鴨，引起性成熟鴨卵巢出血、睪丸萎縮、產蛋量、受精率和孵化率下降，鴨死淘率增加。在病毒分類地位的研究中，通過對分離病毒株的F4代鴨胚傳代病毒的基因組序列與已知的病毒進行序列同源性分析和進化分析，發現該病毒與黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇病毒的遺傳距離最近。在診斷方面，曹貞貞、萬春和、蘇敬良、滕巧泱等人報道可以采用臨床癥狀、大體及組織病理變化、RT-PCR擴增和病毒分離等方法確診該病。關于該病的防控，北京市農林科學院和瑞普(保定)生物藥業有限公司、齊魯動物保健品有限公司、福建省農業科學院畜牧獸醫研究所和重慶市農科院畜牧獸醫研究所報道了利用該病暴發期間所分離的毒株制備疫苗的方法。林健、劉月煥等報道了利用產蛋鴨成功建立了鴨出血性卵巢炎的人工感染模型，為疫苗的評價奠定了實驗基礎。尚未見有客觀、可行、操作性強和科學的疫苗效力評價方法的詳細報道。
發明內容
本發明目的之一是提供一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價鴨的日齡范圍。本發明目的之二是提供鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價用疫苗免疫次數、采樣時間、采集的組織樣本。本發明目的之三是提供一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價方法。本發明所用病毒毒株命名為鴨出血性卵巢炎病毒HB株，保藏號為CCTCCV201122 ;所述鴨出血性卵巢炎病毒是ssRNA病毒，有囊膜，能夠凝集鴿紅細胞；病毒顆粒大體呈球狀，直徑40 60nm ;所述病毒對外界環境的抵抗力較強，在4°C中存放幾周，在-20°C中存放幾個月，其感染力均不受影響；所述病毒對乙醚、氯仿敏感；大多數去污劑能將它迅速滅活；在371條件下，用0. I %福爾馬林熏蒸6h便可把它滅活。該病毒可在9 13日齡鴨胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，9 10日齡雞胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，6日齡雞胚卵黃囊，7 8日齡鴨胚卵黃囊中培養，也可在鴨胚成纖維細胞和BHK21細胞上培養。本發明所用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備方法已于2011年申報發明專利，申請號為 201110255115. I。本發明提供一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗方法，該方法使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫鴨，共免疫2次，首免后2周進行二免，采集二免后3飛周的鴨血清進行ELISA抗體檢測，非免疫對照組鴨ELISA抗體陽性率為0%，ELISA抗體陽性率為不低于80%判為疫苗效力檢驗合格。進一步地，本發明方法根據易感性實驗結果，確定鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗用鴨的日齡為42飛60日齡。進一步地，本發明方法中2次免疫的劑量為0. 5ml/只 2ml/只。進一步地，本發明提供的一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗方法是使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫42 560日齡鴨，首免后2周進行二免，采集二免后3飛周的鴨血清，使用ELISA抗體檢測試劑盒檢測免疫鴨血清，進行效力評價。進一步地，上述ELISA抗體檢測是以純化的黃病毒科病毒為包被抗原的ELISA檢測試劑盒。進一步地，所述的鴨為肉用鴨、蛋用鴨或SPF鴨。
本發明提供的一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗方法，具體是使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫42 560日齡鴨，同時設一定數量的非免疫對照組鴨；首免后2周進行二免，兩次免疫的劑量均為0. 5ml/只 2ml/只，采集二免后3飛周的鴨血清，使用ELISA抗體檢測試劑盒檢測免疫鴨血清，進行效力評價，非免疫對照組鴨ELISA抗體陽性率為0%，免疫組鴨ELISA抗體陽性率> 80%，判定疫苗效力檢驗合格。進一步地，上述ELISA抗體檢測試劑盒是以純化的黃病毒科病毒為包被抗原的ELISA檢測試劑盒。進一步地，所述的鴨為肉用鴨、蛋用鴨或SPF鴨。本發明首次提出了用于鴨出血性卵巢炎滅活疫苗血清學效力檢驗使用鴨的日齡、 疫苗效力檢驗時疫苗的免疫次數、取材時間、采集的組織樣本，提出了血清學ELISA疫苗效力檢驗方法、判定標準及疫苗質量合格的標準。解決了鴨出血性卵巢炎滅活疫苗血清學效力評價方法和判定標準的空白。本發明確定的方法客觀、全面、操作性強，可用于鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的實驗室和臨床效力評價。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的生物、化學試劑均為常規市售，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例中所用的北京鴨購自鴨出血性卵巢炎抗體陰性鴨場(北京金星鴨業中心南口種鴨場)，麻鴨購自鴨出血性卵巢炎抗體陰性鴨場(北京延慶縣四海鎮珍珠泉下花樓村)，SPF鴨由購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心的SPF鴨蛋孵化，SPF雞隔離器中飼養至試驗所需日齡。易感鴨的檢驗標準5只來自未經鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫或有鴨出血性卵巢炎流行史鴨群的鴨，每只鴨口服I. 0毫升無菌0. 5%水解乳蛋白Hank’ s液100倍稀釋的檢驗用毒株。攻毒后4-5日，采血，分離血清進行病毒分離。病毒分離率應至少4/5陽性，判斷檢驗用鴨為易感鴨。實施例I鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(ELISA抗體測定法)效力檢驗用鴨的日齡、免疫劑量、采樣時間(I)
使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號201101，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫560日齡且未感染DHOV的麻鴨10只，0. 5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同劑量和相同途徑進行二免，采集二次免疫后4周鴨的血清，使用附注的ELISA抗體檢測方法檢測免疫鴨血清，非免疫對照組鴨ELISA抗體陽性率為0%，免疫組鴨ELISA抗體陽性率為80%，說明疫苗效力檢驗合格。實施例2鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(ELISA抗體測定法)效力檢驗用鴨的日齡、免疫劑量、采樣時間(2)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號201102，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫42日齡且未感染DHOV的北京鴨10只，Iml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同劑量和相同途徑二免，采集二次免疫后4周鴨的血 清，使用附注的ELISA抗體檢測方法檢測免疫鴨血清，非免疫對照組鴨ELISA抗體陽性率為0%，免疫組鴨ELISA抗體陽性率為90%，說明疫苗效力檢驗合格。實施例3鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(ELISA抗體測定法)效力檢驗用鴨的日齡、免疫劑量、采樣時間(3)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號201103，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫180日齡且未感染DHOV的北京鴨10只，2ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同劑量和相同途徑二免，采集二次免疫后4周鴨的血清，使用附注的ELISA抗體檢測方法檢測免疫鴨血清，非免疫對照組鴨ELISA抗體陽性率為0%，免疫組鴨ELISA抗體陽性率為100%，說明疫苗效力檢驗合格。實施例4鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(ELISA抗體測定法)效力檢驗用鴨的日齡、免疫劑量、采樣時間(4)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號201104，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫560日齡且未感染DHOV的SPF鴨10只，0. 5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同劑量和相同途徑進行二免，采集二次免疫后3周鴨的血清，使用附注的ELISA抗體檢測方法檢測免疫鴨血清，非免疫對照組鴨ELISA抗體陽性率為0%，免疫組鴨ELISA抗體陽性率為80%，說明疫苗效力檢驗合格。實施例5鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(ELISA抗體測定法)效力檢驗用鴨的日齡、免疫劑量、米樣時間(5)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號201105，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫300日齡且未感染DHOV的麻鴨10只，Iml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同劑量和相同途徑進行二免，采集二次免疫后5周鴨的血清，使用附注的ELISA抗體檢測方法檢測免疫鴨血清，非免疫對照組鴨ELISA抗體陽性率為0%，免疫組鴨ELISA抗體陽性率為80%，說明疫苗效力檢驗合格。實施例6鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(ELISA抗體測定法)效力檢驗用鴨的日齡、免疫劑量、米樣時間(6)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號201106，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫400日齡且未感染DHOV的北京鴨10只，2ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周按照相同劑量和相同途徑進行二免，采集二次免疫后5周鴨的血清，使用附注的ELISA抗體檢測方法檢測免疫鴨血清，非免疫對照組鴨ELISA抗體陽性率為0%，免疫組鴨ELISA抗體陽性率為80%，說明疫苗效力檢驗合格。實施例7直接競爭-ELISA試劑盒的制備與抗體測定I.試劑盒組成
酶標板96孔板陽性對照血清Iml陰性對照血清Iml酶標抗體IOml
底物液(A、B液)5ml 洗液20ml(100倍濃縮液)
樣品稀釋液I Oml
說明書I份2.材料2. I生物材料抗原純化病毒抗原抗體抗原病毒單抗辣根過氧化物酶2. 2 耗材酶標板深圳金燦華容器(瓶)深圳金燦華2.3ELISA 板制備2. 3. I病毒的純化鴨出血性卵巢炎細胞適應病毒株DHOV-HB株(F5代)接種DEF(鴨胚成纖維細胞)，當CPE出現85%時，收獲病毒。凍融I次后，3500rpm離心15min，取上清液，再經IOOOOrpm離心30min，取上清液，經中空纖維柱濃縮，PEG6000沉淀，蔗糖密度梯度離心，取30%與45%之間的明亮帶，經STE緩沖液稀釋和離心處理后獲得純化病毒。2. 3. 2病毒包被利用pH9. 6的碳酸鹽緩沖液(配方見附注I)將病毒1000倍稀釋，以IOOul/孔的劑量加入到96孔板中，4°C條件下包被12 16h。2. 3. 3洗板洗液洗板5次，每孔加滿。每次間隔30秒。2. 3. 4封閉洗板后酶標板，拍干。加入封閉液200ul。4°C過夜，或36度I小時。2. 3. 5干燥封閉后酶標板棄去封閉液，吹干后備用。2. 3. 6包裝用鋁箔封裝。2. 4酶標抗體的制備采用過碘酸鈉法將辣根過氧化物酶標記在鴨出血性卵巢炎病毒E蛋白單克隆抗體，制備成紫外分光光度計280nm處A值約為2. 5酶結合物標記的抗體。2. 5待檢樣本抗體的測定2. 5. I在已經包被的ELISA板各孔中均加入50 ii L樣品稀釋液；2. 5. 2A1孔和BI孔各加50 U L陽性血清；C1孔和Dl孔各加50 U L陰性血清，見制備方法(7);其余各孔中分別加入50 y L待測血清。2. 5. 321。。±5。。孵育 90min±6min，。2. 5. 4移去各孔液體，用300 ii L沖洗液洗滌3次。2. 5. 5各孔加入100 ii L I倍稀釋的辣根過氧化物酶標記抗體。2. 5. 62 TC ± 5 °C 孵育 30min ± 3min。2. 5. 7移去各孔液體，用300 ii L沖洗液洗滌3次。2. 5. 8各孔中加入IOOii L底物溶液。2.5.9避光21°〇 ±5°C鮮育 15min±2min。
·
2. 5. 10在各孔中加入IOOii L終止液(2mol / L硫酸)終止反應。2. 5. 11使用酶標儀在450nm波長下讀取并記錄OD值。結果判定陰性對照的OD值大于0. 700試驗成立。計算每個樣品的S/N值S/N=樣品OD值/陰性血清OD值X 100，并按下表進行判定。
SZNjt_判定結果
S/N < 40%陽性40% < S/N <
— 可疑
50%
S/N > 50%_哩_注意事項( I)底物溶液需避光保存，勿與氧化物接觸。(2)為防止污染，所有在試驗中使用過的一次性物品需經過高壓滅菌。(3)臨界值(cut-off)的確定檢測300份陰性血清，計算其95%的可信限。一般是陰性對照的平均值X —個常數，這個常數一般是要據95%可信限獲得(通常是2. IX陰性平均值)。本發明的試劑盒溶液或試劑的配方與制備(I) pH9. 6包被緩沖液(CB)的配方
_縫_歷_備注
Na2CO31.59 克NaHCO32.93 克
NaN3 0.2 克 _HaO_至 IOOOml_(2)洗液的配方 _m_m_
權利要求
1.ー種鴨出血性卵巣炎滅活疫苗效カ檢驗方法，其特征在于，使用鴨出血性卵巣炎滅活疫苗免疫鴨，免疫2次，首免后2周進行ニ免，采集ニ免后3飛周的鴨血清進行ELISA抗體檢測，非免疫組ELISA抗體陽性率為0%，免疫組ELISA抗體陽性率為不低于80%判為疫苗效カ檢驗合格。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在干，效カ檢驗用鴨的日齡為42 560日齡。
3.如權利要求I所 述的方法，其特征在于，所述2次免疫的劑量為0.5ml/只 2ml/只。
4.如權利要求1-3任一所述鴨出血性卵巣炎滅活疫苗效カ檢驗方法，其特征在于所用的ELISA抗體檢測是以純化的黃病毒科病毒為包被抗原的ELISA檢測試劑盒。
5.如權利要求1-3任一所述鴨出血性卵巣炎滅活疫苗效カ檢驗方法，其特征在于所述的鴨為肉用鴨、蛋用鴨或SPF鴨。
6.ー種鴨出血性卵巣炎滅活疫苗效カ檢驗方法，其特征在于，使用鴨出血性卵巣炎滅活疫苗免疫42 560日齡鴨，首免后2周進行ニ免，兩次免疫的劑量均為0. 5ml/只 2ml/只；采集ニ免后3飛周的鴨血清，使用ELISA抗體檢測試劑盒檢測免疫鴨血清，進行效カ評價，非免疫對照組鴨ELISA抗體陽性率為0%，免疫組鴨ELISA抗體陽性率彡80%,判定疫苗效カ檢驗合格。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于所用的ELISA抗體檢測試劑盒是以純化的黃病毒科病毒為包被抗原的ELISA檢測試劑盒。
8.如權利要求6或7所述的方法，其特征在于所述的鴨為肉用鴨、蛋用鴨或SPF鴨。
全文摘要
本發明提供了鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的血清學效力檢驗方法，該方法使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫鴨，免疫2次，首免后2周進行二免，采集二免后3~5周的鴨血清進行ELISA抗體檢測，非免疫組ELISA抗體陽性率為0%，免疫組ELISA抗體陽性率為不低于80%判為疫苗效力檢驗合格。本發明提供的鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的血清學效力檢驗方法操作方便，結果準確、可廣泛應用于鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的效力評價。
文檔編號G01N33/15GK102735807SQ20121020229
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者何平有, 劉月煥, 劉浩, 徐倩倩, 朱秀同, 楊保收, 林健, 梁武, 段會娟, 毛雅園, 潘潔, 趙際成, 郁宏偉, 韓春華 申請人:北京市農林科學院畜牧獸醫研究所, 瑞普(保定)生物藥業有限公司