專利名稱：一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的效力檢驗方法
技術領域：
本發明涉及一種獸用滅活疫苗的效力檢驗方法，尤其涉及一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力的檢驗方法，屬獸用生物制品檢驗技術領域。
背景技術：
鴨出血性卵巢炎(Duck Hemorrhagic Ovaritis, DH)是新近流行的、急性、高度接觸性的一種新型鴨傳染病，其病原為鴨出血性卵巢炎病毒(Duck Hemorrhagic OvaritisVirus, DHOV),在病毒分類上屬于黃病毒科的成員，感染不同日齡鴨，引起性成熟鴨卵巢出 血、睪丸萎縮、產蛋量、受精率和孵化率下降，鴨死淘率增加。在病毒分類地位的研究中，通過對分離病毒株的F4代鴨胚傳代病毒的基因組序列與已知的病毒進行序列同源性分析和進化分析，發現該病毒與黃病毒科黃病毒屬的坦布蘇病毒的遺傳距離最近。在診斷方面，曹貞貞、萬春和、蘇敬良、滕巧泱等人報道可以采用臨床癥狀、大體及組織病理變化、PCR擴增和病毒分離等方法確診該病。關于該病的防控，北京市農林科學院和瑞普(保定)生物藥業有限公司、齊魯動物保健品有限公司、福建省農業科學院畜牧獸醫研究所和重慶市農科院畜牧獸醫研究所報道了利用該病暴發期間所分離的毒株制備疫苗的方法。林健、劉月煥等報道了利用產蛋鴨成功建立了鴨出血性卵巢炎的人工感染模型，為疫苗的評價奠定了實驗基礎。尚未見有客觀、可行、操作性強和科學的疫苗效力評價方法的詳細報道。
發明內容
本發明目的之一是提供一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價鴨的日齡范圍和性別。本發明目的之二是提供鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價用疫苗免疫次數、采用時間、采集的組織樣本、攻毒途徑和檢驗用胚。本發明目的之三是提供一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價方法。本發明所用病毒毒株命名為鴨出血性卵巢炎病毒HB株，保藏號為CCTCCV201122 ;所述鴨出血性卵巢炎病毒是ssRNA病毒，有囊膜，能夠凝集鴿紅細胞；病毒顆粒大體呈球狀，直徑40 60nm ;所述病毒對外界環境的抵抗力較強，在4°C中存放幾周，在-20°C中存放幾個月，其感染力均不受影響；所述病毒對乙醚、氯仿敏感；大多數去污劑能將它迅速滅活；在371條件下，用0. I %福爾馬林熏蒸6h便可把它滅活。該病毒可在9 13日齡鴨胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，9 10日齡雞胚尿囊腔、胚絨毛尿囊膜，6日齡雞胚卵黃囊，7 8日齡鴨胚卵黃囊中培養，也可在鴨胚成纖維細胞和BHK21細胞上培養。本發明所用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的制備方法已于2011年申報發明專利，申請號為 201110255115. I。本發明提供一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗方法，該方法使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫鴨，共免疫2次，首免后2周進行二免，二免后3飛周用鴨出血性卵巢炎病毒對免疫鴨進行攻毒；攻毒后5 10日將試驗鴨處死，進行剖檢，觀察生殖系統的大體病變，免疫組鴨的生殖器官未發生病變的攻毒保護率為70%以上判為疫苗效力檢驗合格；所述的大體病變在雌鴨表現為雌鴨卵泡出血、變形或輸卵管萎縮，在雄鴨表現為睪丸或輸精
管萎縮。進一步地，本發明方法根據易感性實驗結果，確定鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗用鴨的日齡為120 560日齡。
優選地，效力檢驗用鴨的性別為雌性。其中，2次免疫鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的劑量為0. 5ml/只 2ml/只。其中，攻毒用鴨出血性卵巢炎病毒為DHOV-HB株(保藏編號為CCTCC V201122，已在申請號為201110255115. I的中國專利中公開)，攻毒劑量為3X IO4ELD500其中，所述的鴨為肉用鴨、蛋用鴨或SPF鴨。進一步地，本發明提供了一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗方法，該方法使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫42 560日齡雌鴨，首免后2周進行二免，兩次的免疫劑量均為0. 5^2ml/只；二免后3飛周用DHOV-HB株攻毒，攻毒途徑為口服、肌注或靜脈注射，攻毒劑量為3 X IO4ELD5tl，攻毒后5 10日將試驗鴨處死，進行剖檢，觀察生殖系統的大體病變，免疫組鴨的生殖器官未發生病變的攻毒保護率為70%以上判為疫苗效力檢驗合格；所述的大體病變表現為雌鴨卵泡出血、變形或輸卵管萎縮。其中，所述的鴨為肉用鴨、蛋用鴨或SPF鴨。本發明首次提出了用于鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗使用鴨的日齡和性別，疫苗效力檢驗時疫苗的免疫次數、攻毒途徑，提出了免疫保護-大體病變判斷的疫苗效力檢驗方法、判定標準及疫苗質量合格的標準。解決了鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價方法和判定標準的空白。本發明確定的方法客觀、全面、操作性強，可用于鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的實驗室和臨床效力評價。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的生物、化學試劑均為常規市售，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例中所用的北京鴨購自鴨出血性卵巢炎抗體陰性鴨場(北京金星鴨業中心南口種鴨場)，麻鴨購自鴨出血性卵巢炎抗體陰性鴨場(北京延慶縣四海鎮珍珠泉下花樓村)，SPF鴨由購自中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所實驗動物中心的SPF鴨蛋孵化，SPF雞隔離器中飼養至試驗所需日齡。實施例I鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗用鴨的日齡將42、50、100、120、200、300、400、560、600 日齡的北京鴨分為 9 組，每組 10 只，每
組均為同一日齡的北京鴨(購自北京金星鴨業中心南口種鴨場，鴨出血性卵巢炎抗體為陰性)。試驗鴨經口服途徑攻毒相同劑量的DHOV-HB株病毒，約含3 X IO4ELD50/只。攻毒后5天經翅靜脈采集鴨血，無菌分離血清。血清經卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚，5枚/鴨，0. 2ml/胚，置37°C繼續孵化至168h。24h以內死亡雞胚棄去，計算24 168h內死亡且DHOV的RT-PCR檢測陽性雞胚數。每份血清5枚雞胚中有I枚及以上雞胚死亡且DHOV的RT-PCR檢測陽性者記為該鴨病毒分離陽性。根據易感性實驗結果，確定鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力檢驗用鴨的日齡為120 560日齡。易感鴨或鴨胚的檢驗標準(一)易感鴨5只來自未經鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫或有鴨出血性卵巢炎流行史鴨群的鴨，每只鴨口服I. 0毫升無菌0. 5%水解乳蛋白Hank’ s液100倍稀釋的檢驗用毒株。攻毒后5日，米血,分尚血清進行病毒分尚。病毒分尚率應至少4/5陽性。(二)易感胚10枚來自未經鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫或有鴨出血性卵巢炎疫病流行史種鴨群所產的種蛋，37°C孵化至10日齡。經尿囊腔接種0. 5%無菌水解乳蛋白Hank’ s液(LH) 500倍稀釋的任何代次的種毒，每胚0. 1ml，置36 37°C條件下繼續孵化。 鴨胚應于接種后24 96小時至少9/10死亡。死亡鴨胚眼觀病變為全身出血。實施例2鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價用鴨的性別將80只140日齡雌雄各半的北京鴨經口服途徑攻毒相同劑量的DHOV-HB株病毒，約含3X IO4ELD5tl/只。攻毒后I 8天經翅靜脈采集鴨血，10只/天，無菌分離血清。血清經卵黃囊途徑接種6日齡SPF雞胚，5枚/鴨(每只鴨血清接種5枚雞胚)，0. 2ml/胚，置37°C繼續孵化至168h。24h以內死亡雞胚棄去,計算24 168h內死亡且DHOV陽性雞胚數。每份血清5枚雞胚中有I枚及以上雞胚死亡且DHOV陽性者記為該鴨病毒分離陽性。雌性北京鴨病毒分離陽性率明顯高于雄性北京鴨。對攻毒后每日雌雄鴨血清接種雞胚后出現的病毒感染雞胚的陽性率進行雙樣本的成對t檢驗，P值小于0. 05，性別在易感性方面有顯著差
巳升。實施例3鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價的免疫保護-大體病變法(I)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號2012001，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫200日齡北京鴨10只，雌雄各半，作為疫苗免疫組。疫苗免疫組的免疫劑量和方法為首免疫苗劑量為0.5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同劑量和相同途徑二免,二免后5周攻毒,攻毒毒株為DHOV-HB株,肌肉注射途徑攻毒，每只鴨攻毒劑量約為3 X IO4ELD5tlt5同時設未感染DHOV和未免疫鴨出血性卵巢炎滅活疫苗易感的北京鴨(10只，雌雄各半，與免疫組鴨同日齡)為對照組進行攻毒。攻毒后第10日處死實驗鴨，進行剖檢，將卵巢或輸卵管(睪丸或輸卵管)出現萎縮，或卵泡變形和出血的試驗鴨判為發病鴨，將卵巢、卵泡和輸卵管(睪丸和輸精管)均正常無病變的試驗鴨判為保護。本實施例中免疫組鴨的攻毒保護率為80%，非免疫對照組鴨的發病率為80%，說明本批次疫苗效力檢驗合格。實施例4鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價的免疫保護-大體病變法(2)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號2012002，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫140日齡北京鴨10只，雌雄各半，作為疫苗免疫組。疫苗免疫組的免疫劑量和方法為首免疫苗劑量為Iml/只，胸部肌肉注射。首免后2周，按照相同劑量和相同途徑二免，二免后4周攻毒,攻毒毒株為DHOV-HB株,靜脈注射途徑攻毒，每只鴨攻毒劑量約為3X IO4ELD5tlt5同時設未感染DHOV和未免疫鴨出血性卵巢炎滅活疫苗易感的北京鴨(10只，雌雄各半，與免疫組鴨同日齡)為對照組進行攻毒。攻毒后第9日處死實驗鴨，進行剖檢，將卵巢或輸卵管(睪丸或輸卵管)出現萎縮，或卵泡變形和出血的試驗鴨判為發病鴨，將卵巢、卵泡和輸卵管(睪丸和輸精管)均正常無病變的試驗鴨判為保護。本實施例中免疫組鴨的攻毒保護率為70%，非免疫對照組鴨的發病率為80%，說明本批次疫苗效力檢驗合格。實施例5鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價的免疫保護-大體病變法(3)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號2012003，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫300日齡北京鴨10只，雌雄各半，作為疫苗免疫組。疫苗免疫組的免疫劑量和方法為首免疫苗劑量為I. 5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同劑量和相同途徑二免,二免后3周攻毒,攻毒毒株為DHOV-HB株，口服感染途徑攻毒，每只鴨攻毒劑量約為3 X IO4ELD5tlt5同時設未感染DHOV和未免疫鴨出血性卵巢炎滅活疫苗易感的北京鴨(10只，雌雄各半，與免疫組鴨同日齡)為對照組進行攻毒。攻毒后第8日處死實驗鴨，進行剖檢，將卵巢或輸卵管(睪丸或輸卵管)出現萎縮，或卵泡變形和出血的試驗鴨判為發病鴨，將卵巢、卵泡和輸卵管(睪丸和輸精管)均正常，無病變的試驗鴨判為保護。本實施例中免疫組鴨的攻毒保護率為90%，非免疫對照組鴨的發病率為100%，說明 本批次疫苗效力檢驗合格。實施例6鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價的免疫保護-大體病變法(4)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號2012004，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫400日齡北京鴨10只，雌雄各半，作為疫苗免疫組。疫苗免疫組的免疫劑量和方法為首免疫苗劑量為2ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同劑量和相同途徑二免,二免后5周攻毒,攻毒毒株為DHOV-HB株,肌肉注射途徑攻毒，每只鴨攻毒劑量約為3X IO4ELD5tlt5同時設未感染DHOV和未免疫鴨出血性卵巢炎滅活疫苗易感的北京鴨(10只，雌雄各半，與免疫組鴨同日齡)為對照組進行攻毒。攻毒后第7日處死實驗鴨，進行剖檢，將卵巢或輸卵管(睪丸或輸卵管)出現萎縮，或卵泡變形和出血的試驗鴨判為發病鴨，將卵巢、卵泡和輸卵管(睪丸和輸精管)均正常的試驗鴨判為保護。本實施例中免疫組鴨的攻毒保護率為100%，非免疫對照組鴨的發病率為90%，說明本批次疫苗效力檢驗合格。實施例7鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價的免疫保護-大體病變(5)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號2012005，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫560日齡北京鴨10只，雌雄各半，作為疫苗免疫組。疫苗免疫組的免疫劑量和方法為首免疫苗劑量為Iml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同劑量和相同途徑二免,二免后4周攻毒,攻毒毒株為DHOV-HB株,肌肉注射途徑攻毒，每只鴨攻毒劑量約為3X IO4ELD5tlt5同時設未感染DHOV和未免疫鴨出血性卵巢炎滅活疫苗易感的北京鴨(10只，雌雄各半，與免疫組鴨同日齡)為對照組進行攻毒。攻毒后第7日處死實驗鴨，進行剖檢，將卵巢或輸卵管(睪丸或輸卵管)出現萎縮，或卵泡變形和出血的試驗鴨判為發病鴨，將卵巢、卵泡和輸卵管(睪丸和輸精管)均正常無病變的試驗鴨判為保護。本實施例中免疫組鴨的攻毒保護率為80%，非免疫對照組鴨的發病率為100%，說明本批次疫苗效力檢驗合格。實施例8鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價的免疫保護-大體病變法(6)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號2012006，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫120日齡北京鴨10只，雌雄各半，作為疫苗免疫組。疫苗免疫組的免疫劑量和方法為首免疫苗劑量為I. 5ml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同劑量和相同途徑二免,二免后4周攻毒,攻毒毒株為DHOV-HB株，口服途徑攻毒，每只鴨攻毒劑量約為3 X IO4ELD5tlt5同時設未感染DHOV和未免疫鴨出血性卵巢炎滅活疫苗易感的北京鴨(10只，雌雄各半，與免疫組鴨同日齡)為對照組進行攻毒。攻毒后第6日處死實驗鴨，進行剖檢，將卵巢或輸卵管(睪丸或輸卵管)出現萎縮，或卵泡變形和出血的試驗鴨判為發病鴨，將卵巢、卵泡和輸卵管(睪丸和輸精管)均正常無病變的試驗鴨判為保護。本實施例中免疫組鴨的攻毒保護率為100%，非免疫對照組鴨的發病率為90%，說明本批次疫苗效力檢驗合格。實施例9鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價的免疫保護-大體病變法(7)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號2012001，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫140日齡麻鴨10只，雌雄各半，作為疫苗免疫 組。疫苗免疫組的免疫劑量和方法為首免疫苗劑量為I. Oml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同劑量和相同途徑二免,二免后4周攻毒,攻毒毒株為DHOV-HB株，口服途徑攻毒，每只鴨攻毒劑量約為3 X IO4ELD5tlt5同時設未感染DHOV和未免疫鴨出血性卵巢炎滅活疫苗易感的麻鴨(10只，雌雄各半，與免疫組鴨同日齡)為對照組進行攻毒。攻毒后第6日處死實驗鴨，進行剖檢，將卵巢或輸卵管(睪丸或輸卵管)出現萎縮，或卵泡變形和出血的試驗鴨判為發病鴨，將卵巢、卵泡和輸卵管(睪丸和輸精管)均正常無病變的試驗鴨判為保護。本實施例中免疫組鴨的攻毒保護率為70%，非免疫對照組鴨的發病率為90%，說明本批次疫苗效力檢驗合格。實施例10鴨出血性卵巢炎滅活疫苗效力評價的免疫保護-大體病變法(8)使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗(批號2012001，北京市農林科學院畜牧獸醫研究所和瑞普(保定)生物藥業有限公司研制)免疫120日齡SPF鴨10只，雌雄各半，作為疫苗免疫組。疫苗免疫組的免疫劑量和方法為首免疫苗劑量為I. Oml/只，胸部肌肉注射。首免后2周,按照相同劑量和相同途徑二免,二免后4周攻毒,攻毒毒株為DHOV-HB株，口服途徑攻毒，每只鴨攻毒劑量約為3 X IO4ELD5tlt5同時設未感染DHOV和未免疫鴨出血性卵巢炎滅活疫苗易感的SPF鴨(10只，雌雄各半，與免疫組鴨同日齡)為對照組進行攻毒。攻毒后第5天處死實驗鴨，進行剖檢，將卵巢或輸卵管(睪丸或輸卵管)出現萎縮，或卵泡變形和出血的試驗鴨判為發病鴨，將卵巢、卵泡和輸卵管(睪丸和輸精管)均正常無病變的試驗鴨判為保護。本實施例中免疫組鴨的攻毒保護率為80%，非免疫對照組鴨的發病率為100%，說明本批次疫苗效力檢驗合格。以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
權利要求
1.ー種鴨出血性卵巣炎滅活疫苗效カ檢驗方法，其特征在于，使用鴨出血性卵巣炎滅活疫苗免疫鴨，共免疫2次，首免后2周進行ニ免，ニ免后3飛周用鴨出血性卵巣炎病毒對免疫鴨進行攻毒；攻毒后5 10日將試驗鴨處死，進行剖檢，觀察生殖系統的大體病變，免疫組鴨的生殖器官未發生病變的攻毒保護率為70%以上判為疫苗效カ檢驗合格；所述的大體病變在雌鴨表現為雌鴨卵泡出血、變形或輸卵管萎縮，在雄鴨表現為睪丸或輸精管萎縮。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在干，效カ檢驗用鴨的日齡為120 560日齡。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在干，效カ檢驗用鴨的性別為雌性。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述2次免疫的劑量為0.5ml/只 2ml/只。
5.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述的攻毒用鴨出血性卵巣炎病毒為 DHOV-HB 株，攻毒劑量為 3 X IO4ELD500
6.如權利要求1-5任一所述鴨出血性卵巣炎滅活疫苗效カ檢驗方法，其特征在于所述的鴨為肉用鴨、蛋用鴨或SPF鴨。
7.ー種鴨出血性卵巣炎滅活疫苗效カ檢驗方法，其特征在于，使用鴨出血性卵巣炎滅活疫苗免疫120 560日齡雌鴨，首免后2周進行ニ免，兩次的免疫劑量均為0. 5 2ml/只；ニ免后:T5周用DHOV-HB株攻毒，攻毒途徑為ロ服、肌注或靜脈注射，攻毒劑量為3 X IO4ELD5tl，攻毒后5 10日將試驗鴨處死，進行剖檢，觀察生殖系統的大體病變，免疫組鴨的生殖器官未發生病變的攻毒保護率為70%以上判為疫苗效カ檢驗合格；所述的大體病變表現為雌鴨卵泡出血、變形或輸卵管萎縮。
8.如權利要求7所述鴨出血性卵巣炎滅活疫苗效カ檢驗方法，其特征在于所述的鴨為肉用鴨、蛋用鴨或SPF鴨。
全文摘要
本發明提供了一種鴨出血性卵巢炎滅活疫苗的效力檢驗方法，該方法使用鴨出血性卵巢炎滅活疫苗免疫鴨，共免疫2次，首免后2周進行二免，二免后3~5周用鴨出血性卵巢炎病毒對免疫鴨進行攻毒；攻毒后5～10日將試驗鴨處死，進行剖檢，觀察生殖系統的大體病變，若雌鴨表現為雌鴨卵泡出血、變形和輸卵管萎縮，或雄鴨表現為睪丸和輸精管萎縮，則為發生了病變。免疫組鴨的生殖器官未發生病變的攻毒保護率為70%以上判為疫苗效力檢驗合格。
文檔編號G01N33/15GK102735808SQ201210202429
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月15日 優先權日2012年6月15日
發明者何平有, 劉月煥, 劉浩, 徐倩倩, 朱秀同, 楊保收, 林健, 梁武, 段會娟, 毛雅園, 潘潔, 趙際成, 郁宏偉, 韓春華 申請人:北京市農林科學院畜牧獸醫研究所, 瑞普(保定)生物藥業有限公司