專利名稱：一種低溫酸性木聚糖酶xyn10b及其基因和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種低溫酸性木聚糖酶XYNlOB及其基因和應用。
背景技術：
植物細胞壁主要是由纖維素、半纖維素和木質素組成，三者通過共價鍵和非共價鍵結合形成一個緊密的結構。半纖維素主要存在于細胞壁的表面，約占細胞干重的30% 35%。其中木聚糖是植物半纖維素的主要組成成分之一，也是自然界中除纖維素之外重要的可再生資源。木聚糖的結構復雜，其完全降解需要多種酶協同作用來進行。其中木聚糖酶是木聚糖降解中的最關鍵酶，它能夠有效地降解木聚糖主鏈的連接吡喃木糖的β-ι， 4 糖苷鍵(Saha B. Hemicellulose bioconversion. J Ind Microbiol Biotechnol, 2003, 30:279-291.)。NCBI中數據庫中收錄的木聚糖酶基因的分布來看，來源于微生物的木聚糖酶最多，占所有序列的80%以上。而微生物來源的序列中，細菌和真菌來源的序列又占大多數。這可能因為木聚糖的降解終產物木糖可以作為微生物的碳源和能源，而微生物要利用木聚糖，就得合成能夠降解木聚糖的酶。根據氨基酸序列同源性，木聚糖酶歸類于糖苷水解酶家族 10、11、39、43、52、62 和 67 (Henrissat B, Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J, 1993，293 :781-788.)。
木聚糖酶在多個領域有著重要的應用。木聚糖酶用于紙漿漂白過程，并發現木聚糖處理后的紙漿需要的化學漂白劑的用量要比不用木聚糖酶處理少20% 40%。隨后木聚糖酶在造紙工業上的研究越來越多。結果發現，用木聚糖酶預處理能夠提高漂白效果、增強紙張的強度、優化和調整紙張的性能；木聚糖經木聚糖酶作用后的水解產物(低聚木糖) 可用作增稠劑、脂肪替代物和抗凍食品添加劑等；木聚糖酶可以和葡聚糖酶協同作用， 從而解決啤酒黏度問題，可提高酒液的流速和澄清度。飼料里添加酸性木聚糖酶可以有效地降低消化道中食糜的黏度、提高干物質的消化率和營養吸收，從而提高飼料的利用率和動物體的抗病性。
木聚糖酶在工業中有著廣闊的應用前景。近幾年，在單胃動物的日糧中添加含有木聚糖酶等的復合酶制劑，能有效消除其抗營養作用，提高飼料利用率和動物的生產性能。 單胃動物胃腸道溫度在38. 5 40°C，ρΗ在2. 0 4. 0，因此，需要添加的外源木聚糖酶應該在此條件下酶活力最好。本發明的木聚糖酶最適PH 3. 5，并在ρΗ2. 5 4. 5范圍內具有很高的酶活性；最適溫度40°C，能很好的滿足胃腸道環境的要求。與中溫和高溫木聚糖酶相比，低溫酶能在低溫條件下有效發揮催化作用，加強其對底物的結合力，從而降低能耗， 提高底物利用率，具有很好的應用前景。發明內容
本發明的目的是提供一種低溫酸性木聚糖酶XYN10B。
本發明的再一目的是提供編碼上述低溫酸性木聚糖酶的基因xynlOB。本發明的另ー目的是提供包含上述低溫酸性木聚糖酶基因的重組載體。本發明的另ー目的是提供包含上述低溫酸性木聚糖酶基因的重組菌株。本發明的另ー目的是提供一種制備上述低溫酸性木聚糖酶的方法。本發明的另ー目的是提供上述低溫酸性木聚糖酶的應用。本發明分離篩選出一種生產上述低溫酸性木聚糖酶XYNlOB的青霉SlO本發明提供了ー種低溫酸性木聚糖酶XYN10B，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所 示MVAFSSLFTA FTAIAGSLAA PADLVKNDNV PDLVSRGPSN FVIDSTNNTSLARRSAINYD60QDYTTGGTVN YYSSSTGFEV TffNTQDDFVV GVGffNPGSTT PINFGGQFSVSSGTGLLSVY120GffSTSPLVEY YIIEDYANPP SFGTQKGSLT SDGGTYIIffE NTRYNEPSIQGTSTFNQYIS180VRQSPRTEGT VTVQNHFNAff KNLGMNLGTL NFQVIAAEGffGGSGSASYAV NNN 233其中，該酶基因編碼233個氨基酸，N端19個氨基酸為其預測的信號肽序列，如SEQ ID NO. 3 所示MVAFSSLFTAFTAIAGSLA19因此，成熟的低溫酸性木聚糖酶XYNlOB的理論分子量為23. IkDB,其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示APADLVKNDN VPDLVSRGPS NFVIDSTNNT SLARRSAINY DQDYTTGGTVNYYSSSTGFE60VTffNTQDDFV VGVGffNPGST TPINFGGQFS VSSGTGLLSV YGffSTSPLVEYYIIEDYANP120PSFGTQKGSL TSDGGTYIIff ENTRYNEPSI QGTSTFNQYI SVRQSPRTEGTVTVQNHFNA180WKNLGMNLGT LNFQVIAAEG WGGSGSASYA VNNN214本發明的木聚糖酶XYNlOB在酸性范圍內具有優良的pH穩定性，而低溫范圍內均 具有高活性。本發明的木聚糖酶，其最適PH值為3.5，在pH 2. 5 4. 5的范圍內維持50% 以上的酶活性；在pH 3. 0 6. 0之間，酶活很穩定；最適溫度為40°C，在0°C仍具有16%的 酶活性。本發明提供了編碼上述低溫酸性木聚糖酶基因xynlOB。具體地，該基因的基因組 序列如SEQ ID N0. 4所示atggttgcat tctcaagctt attcactgcc ttcacagcca ttgccggctc actcgctgca 60ccagcagatc tggtcaagaa cgataacgtc cctgacctcg tcagccgcgg cccatcaaac 120ttcgtcatcg attcaacaaa caacacctcc ttggctcgtc gatccgcaat caactatgac 180caggactata ccaccggcgg aacggtaaac tactattcct ccagcacggg gtttgaggtt 240acctggaaca cgcaggacga cttcgtcgtt ggcgttggct ggaaccctgg atctaccaca j00
cccatcaacttcggcggccaattctccgtctccagcggcacaggcctcctctccgtctac360
ggctggtccacctcccccctcgtcgaatactacataatcgaagactacgccaacccaccc420
agcttcggcacgcaaaagggttccctaaccagcgacggcggcacttacatcatctgggag480
aatacgcgatacaacgaaccttcgattcagggtacgtctactttcaatcagtatatctct540
gtgcgccagagtccccggacggagggcacggttacggtgcagaatcattttaatgcttgg600
aagaacttggggatgaatttggggacgttgaattttcaggttattgctgctgaggggtgg660
ggtgggagtggttctgcttcgtatgctgttaacaataactaa702
本發明通過RT-PCR的方法分離克隆了木聚糖酶基因xynlOB，cDNA全序列分析結果表明，木聚糖酶XYNlOB基因xynlOB全長702bp。其中，信號肽的堿基序列如SEQ ID NO. 6 所示
atggttgcattctcaagcttattcactgccttcacagccattgccggctcactcgct57
因此，成熟的木聚糖酶XYNlOB的基因序列如SEQID NO. 5 所示
gcaccagcagatctggtcaagaacgataacgtccctgacctcgtcagccgcggcccatca60
aacttcgtcatcgattcaac3.3.3.C3.3.C3.CCtccttggctcgtcgatccgcaatcaactat120
gaccaggactataccaccggcggaacggtaaactactattcctccagcacggggtttgag180
gttacctggaacacgcaggacgacttcgtcgttggcgttggctggaaccctggatctacc240
acacccatcaacttcggcggccaattctccgtctccagcggcacaggcctcctctccgtc300
tacggctggtccacctcccccctcgtcgaatactacataatcgaagactacgccaaccca360
cccagcttcggcacgcaaaagggttccctaaccagcgacggcggcacttacatcatctgg420
gagaatacgcgatacaacgaaccttcgattcagggtacgtctactttcaatcagtatatc480
tctgtgcgccagagtccccggacggagggcacggttacggtgcagaatcattttaatgct540
tggaagaacttggggatgaatttggggacgttgaattttcaggttattgctgctgagggg600
tggggtgggagtggttctgcttcgtatgctgttaacaataac642
成熟蛋白理論分子量為23. lkDa，將木聚糖酶基因xynlOB序列及推導出的氨基酸序列在GenBank中進行BLBST比對，該基因與來源于Penicillium marneffei ATCC182M假設的第11家族木聚糖酶氨基酸序列一致性為83%，與發表的來源于Trichoderma reesei 的木聚糖酶氨基酸序列一致性為67%。說明木聚糖酶基因xynlOB是一種新的木聚糖酶基因。
本發明還提供了包含上述低溫酸性木聚糖酶基因xynlOB的重組載體，優選為 pPIC9-xynlOB。將本發明的木聚糖酶基因插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間， 使其核苷酸序列可操作的與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，優選為將本發明的木聚糖酶基因插入到質粒PPIC9上的EcoR I和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調控，得到重組酵母表達質粒 pPIC9-xynl0Bo
本發明還提供了包含上述低溫酸性木聚糖酶基因xynlOB的重組菌株，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優選為重組畢赤酵母菌株GS115/XynlOB。
本發明還提供了一種制備上述低溫酸性木聚糖酶XYNlOB的方法，包括以下步驟
1)用上述重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
2)培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶XYNlOB的表達；以及
3)回收并純化所表達的木聚糖酶XYN10B。
其中，所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或多型遜酵母細胞，優選將重組酵母表達質粒轉化畢赤酵母細胞(Pichia past0ris)GS115，得到重組菌株GS115/ XynlOB0
本發明還提供了上述低溫酸性木聚糖酶XYNlOB的應用，優選其在水解木聚糖及其在飼料工業中的應用。
本發明首先所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種性質優良的、 適合于在造紙、紡織、飼料工業中應用的新的木聚糖酶。本發明的木聚糖酶最適PH3. 5，并在pH 2. 5 4. 5范圍內具有50%以上的酶活力；在酸性范圍內具有很好的pH穩定性；最適溫度40°C，在低溫下具有很高的活性，在0°C仍具有16%的活力。此外，木聚糖酶XYNlOB 可有效降解各種不同類型的木聚糖。因此，本木聚糖酶將在飼料工業的應用中顯示出其巨大的潛力。
圖1重組木聚糖酶的最適pH。
圖2重組木聚糖酶的pH穩定性。
圖3重組木聚糖酶的最適溫度。
圖4重組木聚糖酶的熱穩定性。
具體實施方式
試驗材料和試劑
1、菌株及載體畢赤酵母表達載體PPIC9及菌株GSl 15購自于hvitrogen公司。
2、酶類及其它生化試劑內切酶購自TAKARA公司，連接酶購自Promega公司。底物購自Sigma公司，其它都為國產試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。
3、培養基
(1)重組畢赤酵母菌培養基為馬鈴薯汁培養基1000mL馬鈴薯汁，IOg葡萄糖，25g 瓊脂，pH 5.0。
(2)大腸桿菌培養基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH 7.0)。
(3) BMGY 培養基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % YNB，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。
(4)BMMY培養基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4. 0。
說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。
實施例1木聚糖酶編碼基因XYNlOB的克隆
提取青霉SlO (Penicillium sp.)基因組 DNA
培養3天后將菌絲離心后取入研缽中，液氮凍制研磨5min，然后將研磨液置于 50mL離心管中，加入2mL CTAB提取液，70°C水浴鍋裂解2h，每隔IOmin混勻一次，在4°C下 12000rpm離心lOmin。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異丙醇，于室溫靜置IOmin后，4°C下12000rpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩次， 真空干燥，加入0. 2mL TE溶解，置于-20°C備用。
根據第11家族木聚糖酶基因的保守(CYLG(A)VYGW和TFNQYWS)序列設計合成了簡并引物P1，P2
Pl 5' -TGCTACCTGG(C/G)CTT(A/C/G/T)TA(C/T)GG(A/C/G/T)TGG-3‘；
P2 5' -ACCAGTA(C/T)TG(A/C/G/T)T(A/C/G/T)(A/G)AA(A/C/G/T)GT-3'。
以青霉S10(Penicillium sp.)總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為 94°C變性5min ；然后94°C變性30sec，53°C降落48°C (每個循環降落0. 5°C )退火30sec， 72°C延伸30s，十個循環；94°C變性30s，48°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環，72°C保溫 IOmin0得到一約199bp片段，將該片段回收后與pEBSY-T3載體相連送三博生物技術有限公司測序。
根據測序得到的核苷酸序列，設計上游和下游各二條TAIL-PCR特異性引物設計方向為需要擴增的未知區域方向，第二條引物的位置設計在第一條引物的內側。每兩個引物之間的距離為50bp左右，引物長度一般30nt，退火溫度在60°C。并將它們分別命名為 uspl, usp2 (上游特異性引物)，dspl, dsp2 (下游特異性引物)見表1。
表1.木聚糖酶XYNlOB TBIL-PCR特異性引物
引物名稱弓丨物序列(5·—3·>引物長度(bp)usplCCCCCCTCGTCGAATACTACATAATCGAAG30usp2GATACAACGAACCTTCGATTCAGGGTACGTC31dsplGACGTACCCTGAATCGAAGGTTCGTTGTATC31dsp2CTTCGATTATGTAGTATTCGACGAGGGGGG30
通過反向TAIL-PCR得到已知基因序列的側翼序列，擴增得到產物回收后送三博生物技術有限公司測序。拼接后再通過RT-PCR方法獲得XYNlOB木聚糖酶基因全長7(^bp(SEQ ID NO. 4)，編碼233個氨基酸(SEQ ID NO. 1)和一個終止密碼子。用 SignalP (http://www. cbs. dtu. dk/services/SignalP)進行分析表明 N端 19 個氨基酸為預測的信號肽(SEQ ID NO. 3)。預測該基因所編碼的成熟蛋白的理論分子量為23. lkDa。
實施例2重組木聚糖酶的制備
將表達載體pPIC9進行雙酶切(Spel+NotI)，同時將擴增到編碼木聚糖酶的基因xynlOB(不含信號肽)雙酶切(EcoRI+NotI)，切出編碼木聚糖酶的基因片段與表達載體pPIC9連接，獲得含有木聚糖酶基因xynlOB的重組質粒pPIC9-xynlOB并轉化畢赤酵母GS115，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/XynlOB ；同樣，將包含有信號肽序列的木聚糖酶 XYN10B的cDNA通過酶切、連接方法插入已去除α -因子信號肽序列的表達載體pPIC9中， 獲得含信號肽序列的編碼木聚糖酶的基因xynlOB的重組質粒pPIC-xynlOB-Ι并轉化畢赤酵母GSl 15，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/XynlOB-l。
分別取含有兩種重組質粒的GS115菌株，分別接種于300mL BMGY培養液中， 300C 250rpm振蕩培養48h后，離心收集菌體。然后于IOOmL BMMY培養基重懸，30°C 250rpm 振蕩培養。誘導7 后，離心收集上清。測定木聚糖酶的活力。重組菌株GS115/XynlOB的重組木聚糖酶的表達量為46. 2U/mL，相比之下，重組菌株GS115/xynlOB-l的重組木聚糖酶的表達量低于前者。SDS-PBGE結果表明，重組木聚糖酶在畢赤酵母中得到了表達。重組木聚糖酶的比活為1200U/mg。
實施例3重組木聚糖酶的活性分析
純化重組菌株GS115/XYmOB和GS115/XYN10B-1所產重組木聚糖酶，使用DNS法進行活性分析。
DNS法具體方法如下在pH 3. 5，40°C條件下，ImL的反應體系包括100 μ L適當的稀釋酶液，900 μ L底物，反應lOmin，加入1. 5mLDNS終止反應，沸水煮5min。冷卻后540nm 測定OD值。1個酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出Iymol還原糖的酶量。
實施例4重組木聚糖酶XYNlOB的性質測定
1、重組木聚糖酶XYNlOB的最適pH和pH穩定性的測定方法如下
將實施例3純化的重組木聚糖酶在不同的pH下測定其最適pH。樺木木聚糖在不同pH的0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中37°C下進行酶活力測定。結果(圖1)表明，重組酶XYNlOB的最適pH為3.5，在pH 2. 5 4. 5有50%以上的相對酶活性。木聚糖酶在以上各種不同PH的緩沖液中37°C處理60min，再在pH 7. 0緩沖液體系中60°C下測定酶活性，以研究酶的PH穩定性。結果(圖2)表明木聚糖酶在pH 3. 0 6. 0之間均很穩定，在此pH范圍內處理60min后剩余酶活性在70%以上，這說明此酶在酸性范圍內具有很好的PH穩定性。
2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩定性測定方法如下
木聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 3. 5)緩沖液體系及不同溫度下進行酶促反應。耐溫性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時間，再在 37°C下進行酶活性測定。酶反應最適溫度測定結果(圖幻表明其最適溫度為40°C。酶的熱穩定性性試驗表明(圖4)，XYN10B在37°C下溫育lh，能保持原有的酶活性的90%，而在 55°C下溫育Ih后只剩余5%。
3、木聚糖酶的Km值測定方法如下
以不同濃度的樺木木聚糖為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH3. 5)緩沖液體系中，40°C下測定酶活性，計算出其在40°C下的Km值。經測定，Km值為2.2mg/mL，最大反應速度 Vmax 為 1425. 5 μ mol/min · mg。
4、不同金屬離子化學試劑對XYNlOB酶活的影響測定如下
在酶促反應體系中加入lmmol/L的不同的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響。在40°C、pH 3.5條件下測定酶活性。結果表明(表幻，012+、狗3+^8+對酶活有部分抑制作用，SDS強烈抑制其活性，而巰基乙醇對酶活都有一定的促進作用，其它金屬離子和EDTA對酶活的影響不大。
表2.各種化學試劑及離子的對木聚糖酶XYNlOB的影響
權利要求
1.一種低溫酸性木聚糖酶XYN10B，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2 所示。
2.一種低溫酸性木聚糖酶基因xynlOB，其特征在于，編碼權利要求1所述的低溫酸性木聚糖酶XYN10B。
3.根據權利要求2所述的低溫酸性木聚糖酶基因xynlOB，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4或5所示。
4.包含權利要求2或3所述低溫酸性木聚糖酶基因xynlOB的重組載體。
5.根據權利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPIC9-XynlOB。
6.包含權利要求2或3所述低溫酸性木聚糖酶基因xynlOB的重組菌株。
7.根據權利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母菌。
8.一種制備低溫酸性木聚糖酶XYNlOB的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；2)培養重組菌株，誘導重組木聚糖酶XYNlOB的表達；以及3)回收并純化所表達的木聚糖酶XYN10B。
9.權利要求1所述低溫酸性木聚糖酶XYNlOB的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地，本發明涉及一種低溫酸性木聚糖酶XYN10B及其基因和應用。本發明提供了一種新的低溫酸性木聚糖酶XYN10B，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本發明還提供了編碼上述低溫酸性木聚糖酶XYN10B的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4或5所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應用。本發明的木聚糖酶最適pH3.5，并在pH2.5～4.5范圍內具有50％以上的酶活力；在酸性范圍內具有很好的pH穩定性；最適溫度40℃，在低溫下具有很高的活性，在0℃仍具有16％的活力。此外，木聚糖酶XYN10B可有效降解各種不同類型的木聚糖。因此，本木聚糖酶將在飼料工業的應用中顯示出其巨大的潛力。
文檔編號C12N15/56GK102533699SQ20111041109
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月12日 優先權日2011年12月12日
發明者劉文龍, 孫碩, 李芳芳, 王興吉, 王忠連, 郭慶文, 錢娟娟 申請人:山東隆科特酶制劑有限公司