蛭形輪蟲分泌物單糖組成的分析方法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種蛭形輪蟲分泌物單糖組成的分析方法。
【背景技術】
[0002]微型動物(原生動物和小型的后生動物)在污水生物處理中的有益作用一直備受關注，其作用包括攝食水中懸浮固體、促進細菌絮凝及減少剩余污泥量等，對污水生物處理有重要的指示作用。
[0003]蛭形輪蟲(Bdelloid Rotifer)是一種常見的對污水生物處理有益的微型動物，其是一類在基質上(活性污泥、生物膜等表面)附著生活的小型無脊椎動物。蛭形輪蟲頭部有由纖毛組成的可轉動的形如車輪的輪盤，輪盤是輪蟲運動和攝食的器官。蛭形輪蟲體形微小，長度約100?1000 μ??，需在顯微鏡下才能較好地觀察到。
[0004]蛭形輪蟲有助于改善污水生物處理性能，如去除水中懸浮顆粒物、提高出水透明度、減少剩余污泥發生量等。根據目前研宄，蛭形輪蟲在污水生物處理中具有較廣闊的應用前景。
[0005]不過，迄今為止，對蛭形輪蟲在污水生物處理中的作用，基本上是從其攝食或捕食角度來進行研宄，而蛭形輪蟲的生活習性是靠足底趾內腺體分泌的粘液粘附在活性污泥絮體或生物膜等載體上，頭部伸入到水中進行攝食或捕食，并不直接影響其粘附的載體上的微生物。因此，僅用蛭形輪蟲的攝食或捕食特性，是難以充分解釋其對活性污泥中微生物的活性和群落結構的作用機制；另一種可能的作用機制也許與其分泌物有關，這一點目前尚無文獻專利報道。
[0006]目前，對于未知物的成分分析研宄常用的儀器分析手段有:氣相、高效液相、氣質聯用、紫外及紅外光譜分析、核磁共振、X射線晶體掃描、原子力顯微技術等。儀器分析手段使未知物結構與功能研宄取得飛速發展，但由于蛭形輪蟲分泌物結構復雜的特點，單一儀器分析手段又具有一定局限性。因此對于蛭形輪蟲分泌物的成分分析目前尚無文獻專利報道。本方法結合傅里葉變換紅外光譜、氣相色譜及高效液相色譜分別對蛭形輪蟲的分泌物進行分析鑒定，以得到更為精準的結構組成。
【發明內容】
[0007]本發明的目的在于提供一種蛭形輪蟲分泌物單糖組成的分析方法，其包括傅里葉變換紅外光譜、氣相色譜及高效液相色譜法對未知物質進行分析的方法。其包括預先對蛭形輪蟲分泌物進行提取、純化，真空冷凍干燥，再通過傅里葉變換紅外光譜對其結構做初步鑒定，然后通過氣相和高效液相色譜分別分析其單糖組分。
[0008]為達此目的，本發明采用以下技術方案:
一種蛭形輪蟲分泌物單糖組分的分析方法，其特征在于該方法的具體步驟為:
a.將經清潔處理過的蛭形輪蟲移至無菌去離子水中，使蛭形輪蟲密度達到500?2500 ind/mL，恒溫靜置30分鐘后過濾，并用濾膜過濾去除細菌，收集含有輪蟲分泌物的濾液，將該濾液置于真空度等于1.0，溫度低于-5rc的條件下進行冷凍干燥處理，得到分泌物的固體樣品；
b.取步驟a所得的固體樣品以1: 100 (質量比)的比例與KBr混合，充分研磨均勻進行傅里葉變換紅外光譜掃描，掃描范圍:4000?400 cnT1;掃描次數:32次；分辨率為4CnT1;說明旋輪蟲分泌物的紅外光譜表現出一般多糖類物質的特征吸收峰；
c.將蛭形輪蟲分泌物進行水解和衍生化；
d.將步驟C所得衍生化和水解后的蛭形輪蟲分泌物樣品進行氣相色譜分析，程序升溫為:N2流速為I?2mL/min，H2流速為30?50mL/min，空氣的流速為350?450mL/min，進樣溫度為200?250°C，柱溫為80?100°C，持續I?5min，然后以15°C /min升到300°C，持續6min載氣流量10?30mL/min檢測器溫度為340°C，分流比大于等于100:1 ;
e.將步驟c所得衍生化和水解后的蛭形輪蟲分泌物樣品進行高效液相色譜分析，流動相為0.l~lmol/L, pH5~7的乙腈-磷酸鹽緩沖液，流速為1.0~3ml/min，檢測波長為200~300nm，柱溫 20~50°C，進樣量為 20ul。
[0009]上述的蛭形輪蟲的清潔處理方法為:將含有蛭形輪蟲的樣品經目數大于等于400目的濾網和孔徑小于或等于0.45 μ m的濾膜過濾，再用無菌去離子水洗滌截余物。
[0010]上述的步驟c的具體方法為:稱取蛭形輪蟲分泌物溶于2mol/L三氟乙酸溶液，混合均勻后充入氮氣密封，于80?120°C水浴中水解2?12h。
[0011]本發明的有益效果為:本發明所述的一種分析蛭形輪蟲分泌物單糖組成的方法，通過對蛭形輪蟲培養液進行初次過濾，提取蛭形輪蟲并過濾雜質，恒溫靜置一段時間后再次過濾達到去除蛭形輪蟲的效果，然后對濾液進行濾膜過濾達到提純蛭形輪蟲分泌物的效果。經過冷凍干燥處理，達到濃縮固化分泌物的效果，便于分析檢測。運用傅里葉變換紅外光譜掃描，達到檢測其多糖成分的效果。通過對蛭形輪蟲分泌物進行衍生化和水解處理，再進行氣相色譜和高效液相色譜分析，達到測定其單糖成分的效果。根據得到的色譜圖中各物質的保留時間和峰面積，可知蛭形輪蟲分泌物中的單糖成分及其濃度，從而完成對蛭形輪蟲分泌物單糖組成的分析。
【附圖說明】
[0012]圖1為本發明的分析方法流程圖。
[0013]圖2為本實施示例選用的蛭形輪蟲圖。
[0014]圖3為實施示例傅里葉紅外光譜儀檢測蛭形輪蟲分泌物的譜圖。
[0015]圖4為實施示例標準單糖衍生化氣相色譜圖。
[0016]圖5為實施示例蛭形輪蟲分泌物衍生化氣相色譜圖。
[0017]圖6為實施示例標準單糖衍生化高效液色譜圖。
[0018]圖7為實施示例蛭形輪蟲分泌物衍生產物化高效液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0019]下面結合附圖并通過【具體實施方式】來進一步說明本發明專利的技術方案。
[0020]本實施示例中采用的分析方法流程如圖1所示，使用的蛭形輪蟲為經過續代培養的旋輪蟲(見圖2)。該種類的旋輪蟲分離自上述的污水處理廠的活性