號處理，即用70%酒精浸 泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素)混合液浸泡30min+0. 1%升汞浸泡8min消毒效果 較好。
[0035] 2. 3成年植株外植體 2. 3. 1葉片 試驗表明(表5)，從污染率看，8月份> 12月份>4月份，8月份的葉片帶菌多，滅菌困 難。與幼苗葉片相比，成年植株葉片消毒困難，即使是4月份采集的葉片外植體，污染率也 在60%以上，培養基中添加PPM0.5ml/L后滅菌效果仍然很差。4個處理中8號處理效果 較好，添加抗菌劑處理之后，污染率為66. 67%，存活率為33. 33%，誘導率80%，滅菌有效值為 8. 89%。因此，用成年植株葉片為外植體，以4月份采集，用70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利 福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0. 1%升萊浸泡12min消毒及誘導效果最好。
[0036] 2. 3. 2 莖段 成年植株莖段外植體消毒處理比其葉片更為困難(表6)，4月份、12月份采集的莖段相 對帶菌較少，但污染率低于60%，8月份的帶菌最多，無論哪種滅菌處理均全部污染。成年植 株莖段消毒效果以12月份采集材料，用7號處理消毒效果較好，污染率為63. 67%、存活率為 33. 33%，但從誘導率看，以4月份采集材料，在培養基中添加PPMO. 5ml/L(6號處理)效果較 好，誘導率高達100%。從滅菌有效值看，6號處理和7號處理效果都比較差，成年植株無菌 體系建立還有待進一步探索。
[0037] 3.小結與討論 在植物組織培養過程中，無菌培養體系的建立是獲取組培苗的重要環節。以不同生長 階段的花櫚木葉片、莖段作為外植體的消毒試驗結果表明，籽苗外植體以70%乙醇消毒30s +0. 1%升汞滅菌8min+70%乙醇消毒30s+培養基中添加PPMO. 5ml/l(4號處理)的消毒效 果最好。幼苗外植體以4月份采集效果較好，幼苗莖段用70%酒精浸泡30s+(50mg/L利福平 +50mg/L氯霉素)混合液浸泡30min+0.l%Hgcl浸泡8min(15號處理)消毒效果最好，幼苗 葉片用70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0?l%Hgcl 浸泡6min(14號處理）消毒效果最好。成年植株外植體葉片以4月份采集較好，最佳消毒 方法為：70%酒精浸泡30s+ (50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.l%Hgcl 浸泡12min(8號處理)。
[0038] 外植體消毒的關鍵之處在于合適消毒方法和消毒時間的選定，合適消毒劑組合的 消毒方法以及合適的消毒時間的確定對植物無菌快繁體系的建立均具有重要作用。判斷 某種消毒方法是否合適，要以存活率為主要依據，并綜合考察污染率及誘導率。研究發現， 采用抗菌劑（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液及（100mg/L苯菌靈+100mg/L鏈霉素） 混合液浸泡在花櫚木外植體的消毒中均能起到一定的滅菌效果。在培養基中添加低濃度 (0. 5ml/L)的植物組培抗菌劑（PPM)，可以在不影響誘導率的前提下，顯著提升外植體的未 污染率和存活率。
[0039] 不同取材部位及取材時間對外植體的消毒難易程度有極大影響。取材時間對多數 植物的組織培養都有一定的影響。研究發現，4月份及12月份取材的消毒效果優于8月份 取材的花櫚木外植體，這可能是由于4月份之后溫度上升導致菌類活躍性上升。另外，由于 4月份時植物生長較旺盛，因此此時取材的外植體誘導效果更好。同時研究發現，消毒時選 用幼嫩葉片及帶頂芽莖段比下部莖段消毒效果更好，因為其生長時間不長，雜菌等附著物 較少，因而滅菌較容易。
【主權項】
1. 一種花櫚木組培消毒滅菌配方，其特征在于：包括70%酒精、0. 1%升汞、70%酒精和 向增殖培養基中添加〇. 5ml/L植物組織培養抗菌劑。2. -種花櫚木組培消毒滅菌配方，其特征在于：包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/ L氯霉素混合液以及0. 1%的升汞。3. -種花櫚木組培消毒滅菌配方，其特征在于：包括70%酒精，50mg/L利福平和50mg/ L氯霉素混合液以及0. 1%的升汞。4. 一種花櫚木組培方法，其特征在于：該方法包括以下步驟： (1) 外植體的采集：采用苗齡10天的花櫚木籽苗莖段外植體； (2) 清洗：采用洗滌劑浸泡15分鐘，用流水沖洗30分鐘； (3) 消毒：將步驟（2)中洗凈的外植體拿入無菌工作臺內，采用權利要求1所述的一種 花櫚木組培消毒滅菌配方，依次采用70%酒精、0. 1%升汞和70%酒精浸泡，其浸泡時間分別 為0. 5分鐘、8分鐘和0. 5分鐘，每次消毒處理后均用無菌水沖洗4-5次； (4) 接種：將步驟（3)中清洗后的外植體接種在誘導培養基上，所述誘導培養基包括MS 培養基及附加成分，并向誘導培養基中添加〇. 5ml/L植物組織培養抗菌劑； (5) 培養：將步驟（4)中放置在誘導培養基中的外植體放入到培養箱中進行培養，采用 培養條件為：溫度23-27°C，光強2500-30001x，白天光照12小時。5. -種花櫚木組培方法，其特征在于：該方法包括以下步驟： (1) 外植體的采集：采用當年生花櫚木播種幼苗的帶頂芽莖段、帶側芽莖段或葉片外植 體，采集時間為4月份； (2) 清洗：采用洗滌劑浸泡30分鐘，用流水沖洗1小時； (3) 消毒：將步驟（2)中洗凈的外植體拿入無菌工作臺內，采用權利要求2所述的一種 花櫚木組培消毒滅菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及 〇. 1%的升汞浸泡，針對葉片其浸泡時間分別為〇. 5分鐘、30分鐘和6分鐘，針對莖段其浸泡 時間分別為〇. 5分鐘、30分鐘和8分鐘，每次消毒處理后均用無菌水沖洗外植體4-5次； (4) 接種：將步驟（3)中清洗后的外植體接種在誘導培養基上，所述誘導培養基包括MS 培養基及附加成分； (5) 培養：將步驟（4)中放置在誘導培養基中的外植體放入到培養箱中進行培養，采用 培養條件為：溫度23-27°C，光強2500-30001x，白天光照12小時。6. -種花櫚木組培方法，其特征在于：該方法包括以下步驟： (1) 外植體的采集：采用多年生花櫚木成年植株上的當年生葉片，采集時間為4月份； (2) 清洗：采用洗滌劑浸泡1小時，用流水沖洗2小時； (3) 消毒：將步驟（2)中洗凈的外植體拿入無菌工作臺內，采用權利要求3所述的一種 花櫚木組培消毒滅菌配方，依次采用70%酒精、50mg/L利福平和50mg/L氯霉素混合液以及 〇. 1%升汞的浸泡，其浸泡時間分別為〇. 5分鐘、30分鐘和12分鐘，每次消毒處理后均用無 菌水沖洗外植體4-5次； (4) 接種：將步驟（3)中清洗后的外植體接種在誘導培養基上，所述誘導培養基包括MS 培養基及附加成分； (5) 培養：將步驟（4)中放置在誘導培養基中的外植體放入到培養箱中進行培養，采用 培養條件為：溫度23-27°C，光強2500-30001X，白天光照12小時。7.如權利要求4-6任一所述的一種花櫚木組培方法，其特征在于：所述MS基本培養基 成分如下： 硝酸鉀 KNO3 1900mg/L 硝酸銨 NH4NO3 1650mg/L 七水硫酸鎂 MgSO4. 7H20 370mg/L 磷酸二氫鉀 KH2PO4 170mg/L 二水氯化鈣 CaCl2. 2H20 440mg/L 四水硫酸錳 MnSO4. 4H20 22. 3mg/L 七水硫酸鋅 ZnSO4. 7H20 8. 60mg/L 硼酸 H3BO3 6. 20mg/L 碘化鉀 KI 0. 83mg/L 二水鉬酸鈉 NaMoO4. 2H20 0. 25mg/L 五水硫酸銅 CuSO4. 5H20 0. 025mg/L 六水氯化鈷 CoCl2. 6H20 0. 025mg/L 乙二胺四乙酸二鈉 Na2-EDTA 37. 30mg/L 四水硫酸亞鐵 FeSO4. 4H20 27. 80mg/L 甘氨酸 2.00mg/L 鹽酸硫胺素 0? 10mg/L 鹽酸吡哆醇 0? 50mg/L 煙酸 0? 50mg/L 肌醇 100mg/L ; 所述誘導培養基附加成分為6-BA2.0mg/L，NAA1.0mg/L，瓊脂8g/L，蔗糖30g/L。
【專利摘要】本發明公開了一種花櫚木組培消毒滅菌配方和組培方法，籽苗莖段以70%乙醇消毒30s+0.1%升汞滅菌8min+70%乙醇消毒30s+植物組織培養抗菌劑0.5ml/L的消毒效果最好；幼苗外植體采集最佳時間為4月份，莖段用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡8min消毒效果最好，葉片用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡6min消毒效果最好。成年植株葉片以4月份采集較好，用70%酒精浸泡30s+（50mg/L利福平+50mg/L氯霉素）混合液浸泡30min+0.1%升汞浸泡12min。本發明通過不同的消毒方法對花櫚木外植體的籽苗、幼苗和成年植株組培進行消毒，能夠獲得較好的成活率，并且大大擴展了花櫚木組培繁殖材料的來源，針對消毒時間的控制能夠大大提高花櫚木的組培效果。
【IPC分類】A01H4/00
【公開號】CN105165627
【申請號】
【發明人】韋小麗, 喬棟, 張蘭, 安常蓉
【申請人】貴州大學
【公開日】2015年12月23日
【申請日】2015年10月22日